Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

Özet

TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.

Özet

TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Yekpare geometrisi, 1.0 ila 5.0 ml hacim arasında değişen belirli bir pipet uçları için adapte edilebilir. Yekpare büyük gözenek kolayca minimum akışkan geri basınç ile geçmesine viskoz veya karmaşık örnekleri sağlar. Çift yönlü akış yekpare ve örnek arasında kalma süresi en üst düzeye çıkarır ve tek TruTip içinde işlenecek büyük örnek hacmi sağlar. Ne olursa olsun numune hacmi veya TruTip geometrinin temel adımlar, hücre lizisi TruTip yekpare iç gözenekleri bağlayıcı bir nükleik asit, bağlanmamış numune bileşenleri ve lisis tampon yıkayarak ve uygun bir tampon içine saflaştırılmış ve konsantre nükleik asitleri yıkanarak içerir. TruTip özelliklerini ve uyum bir Eppendorf epMotion 5070 kullanarak üç otomatik klinik örnek işleme protokollerinde gösterilmiştir, Hamilton STAR ve nazofarenks aspirat, kandan genomik DNA izolasyonu ve fetal DNA ekstraksiyon ve maternal plazma geniş hacimli (sırasıyla) den zenginleştirme RNA izolasyonu dahil olmak üzere STARplus sıvı taşıma robotlar,.

Giriş

Nükleik asit saflaştırma en moleküler tanı için, araştırma sadece kullanmak gereklidir ve yaşam bilimleri uygulamaları. Çeşitli yaklaşımlar fenol / kloroform ekstraksiyon işleminden itibaren ortaya çıkmıştır, bunun pek çok kaotropik tuzlar ¹ mevcudiyetinde silika bağlama nükleik asidin temel ilkesine dayanmaktadır. Çıkarma işlemi ^(2-13 olarak örneklere bakın) dönüş filtreleri, manyetik boncuk ve yaşam bilimleri sektöründe hakim ilgili yaklaşımlar, çeşitli boncuk ve membran tabanlı biçimler aracılığıyla akıcı ve otomatik olmuştur. Etkili iken zorlu klinik matrisler ile karşı karşıya zaman, parçacıklar ve membranlar sınırlamalar tanıyoruz. Örneğin, membranlar ve boncuk tabanlı sütun uyumlu, küçük gözenek boyutları (böylece, yüksek karşı basınçlı) var ve bir santrifüj veya vakum sistemi tarafından işlenmesi için destek bir tür gerektirir. Zarlar, fiziksel özellikleri ve boncuk sütun sonuçverimli sarf ve / veya tek yönlü akış yolu ile işlenebilir toplam (giriş) örnek hacmi tıkanma olmadan işlenebilir örnekleri türünü sınırlar önemli akışkan direnci,. Tersine, manyetik parçacıklar çalkalama ile numune içinde dağıtılmalıdır. Homojen bir çözüm içinde manyetik parçacıkların dağıtmak için ihtiyacı en manyetik boncuk sarf malzemeleri ile işlenebilir toplam giriş örnek hacmi sınırlar. Klinik örnek özelliklerini (örneğin, viskozite ve karmaşıklık gibi), bir tüp veya çubuk tarafındaki verimsiz manyetik partikül konsantrasyonu yol açabilir. Buna ek olarak, silika ince partiküller kendi mıknatıslanma kaybetme ve son örnek kirlenmesine, çıkarma işlemi sırasında boncuk kapalı zarar verebilir.

TruTip teknolojisi, bu nükleik asit örnek işleme kısıtlamaları ve sınırlamaları ¹⁴ bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Bir içinde gözenekli bir yekpare gömerekpipet, akışkan geri basınç düşer, vakum (yani pipet aspirasyon) tarafından akış kontrolü sağlar hangi. Bu özellik, büyük ölçüde (Şekil 1) basitleştirilmiş zor örnek tipleri nükleik asitlerin arındırmak için gereken ekstraksiyon işlemi ve enstrümantasyon sağlar. Yekpare geometrisi ve gözenek yekpare kalınlığı 1.0 5,0 ml kadar numune hacimleri için yeterli nükleik asit bağlama kapasitesi sağlarken, tıkanma en aza indirmek için özel olarak tasarlanmıştır. Örnek aspirasyon ve dağıtım sırasında çift yönlü akışı örnek özü ve verimli nükleik asit kurtarma ve elüsyon için bağlayıcı yekpare arasında uzun süreli ikamet kez izin verir ve pipet kendi hacim kapasitesi aşan işlenecek nispeten büyük örnek hacmi sağlar. Daha önce tek veya çok kanallı Rai kullanarak nazofarenks örneklerinden grip RNA arındırıcı için bir el TruTip prosedürün geliştirme ve uygulama rapornin pipet ^15. Eşdeğer ekstraksiyon verimleri 10 ⁶ gen kopyaları da otomatik Qiacube ve manuel TruTip yöntemleri arasında influenza A ml başına nazofarengeal aspirat elde edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, yaygın referans klinik laboratuvarlarda bulunan sıvı taşıma robotlar kullanarak nazofarenks aspirat (NPA) ve diğer klinik örnek türleri için orta ve yüksek verimli, otomatik TruTip nükleik asit saflaştırma işlemleri, göstermekti.

Protokol

Üç otomatik TruTip çıkarma protokolleri tarif ve burada gösterilmektedir: bir Eppendorf epMotion 5070 NPA 1) orta verimli RNA ekstraksiyon, 2) Hamilton STAR tam kan düşük hacimli yüksek verimli genomik DNA ekstraksiyon ve 3) seçici izolasyonu ve Hamilton STARplus üzerinde maternal plazma geniş hacimli gelen parçalanmış fetal DNA zenginleştirme. Otomatik komut Akonni edinilebilir ve sadece üst düzey programı tanımlayıcıları burada verilmektedir. Klinik örneklerden işlenmeden önce çıkarma ve yıkama reaktifler otomatik olarak otomatik komut dosyası (ler) tarafından toplu reaktif olukları 96-kuyucuğu dağıtılmıştır.

1. Nazofarenks Aspire üzerinden Otomatik RNA Ekstraksiyon

Daha önce tarif edilen yöntem, ¹⁵ kılavuzu TruTip hemen 1.0 ml lik Eppendorf boru içine bir büyük gözenek TruTip matrisi kullanılarak, bir Eppendorf epMotion 5070 sıvı yü çalışacak şekilde uyarlanmıştırtte ipuçları, bir 2 ml derin plaka (ABD Scientific), Akonni TruTip çıkarma reaktifler ve NPA örnek türü olarak. EpMotion 5070 sıvı yü aynı anda, yani bir temel otomatik protokol 8 paralel çekimi için açıklanmıştır 8 ipuçları kadar tutar. Bununla birlikte, 24 taneye kadar numuneleri kuyulu 96 oyuklu plaka örnek olarak, tek bir programı sırasında işlenebilir. Ayrı bir epMotion programı 16 veya 24 örnekleri işlemek için (ve gerekli) kullanılabilir. Aşağıda özetlenen Protokol 8 örnek otomatik komut dosyası içindir.

Kurulum

1. Ekstraksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığına kadar nazofarenks örnekleri getirin.
2. Örnek plaka (Şekil 2A) kolon 1'e 100 ul nazofarengeal aspirat artı 150 ul nükleaz içermeyen su koyun.
3. EpMotion Çalışma tablası (Şekil 2B) üzerindeki konumunu B1 içine örnek plakası yerleştirin.
4. Yeri pipet uçları, TruTips ve kendi epMotion Worktab üzerine 30 ml reaktif oluklarıle pozisyon (Şekil 2B).
5. Eppendorf epBlue yazılımını açın, 8 örnekleri için Akonni tarafından sağlanan Çalıştır dosyayı seçin ve RUN sekmesinde RUN butonuna tıklayarak yöntemi yükleyin.
6. Seviye Sensörü Ayarları altında, Düzeyleri ve İpuçları seçin ve RUN düğmesini tıklatın.
7. Yazılım girdi örnek hacmi ve RUN tıklayın.
8. EpMotion komut dosyası kullanıcı Çalışma Tezgahı pozisyon B2 bulunan reaktif rezervuarları için çıkarma ve elüsyon reaktifler eklemek isteyecektir. Ilgili çukur her reaktif önerilen miktarlar ekleyin. 8 örnekleri için, minimum reaktif hacimlerini şunlardır:

Reaktif	Hacim (ml)	Tekne pozisyonu
% 95 etanol	3.5	2
Tampon D yıkayın	9.0	3
Tampon E yıkayın	9.0	4
Seyreltme Tampon maddesi A2	1.3	5
Lizis ve Bağlama Tamponu D	11.0	6

9. Yukarıdaki Adım 8 istemi sırasında epMotion yazılımı tarafından sunulan Tablo girdi reaktif hacimlerini. Giriş değeri her bir ilgili reaktif rezervuar içine kullanıcı tarafından verilen tampon gerçek hacmi yansıtması ve daha büyük ya da yukarıda belirtildiği gibi en az miktarlar eşit olmalıdır. Yanlış hacmi verileri 96 oyuklu plaka (lar), her tüp veya oyuğa epMotion donanım tarafından teslim yanlış miktarlar neden olabilir.

Otomatik Program

10. Otomatik bir yöntem başlatmak için RUN seçin. Otomatik komut dosyası kullanıcı müdahalesi olmadan aşağıdaki adımları hareket edecek:
    Örnek Lizis ve Reaktif Dağıtım:
    1. Kolon 1'e 375 ul Lizis Tampon D koyun ve 10 için karıştırındöngüleri (+ = 1 döngü dağıtmak apirate). Kalan reaktif bölündü ise bu adım lizis inkübasyon işlemi başlar.
    2. Sütun 2 içine 1.6 ml Yıkama Tampon D dağıtın.
    3. Sütun 3 içine 1.6 ml Yıkama Tampon E dağıtın.
    4. Bir sütun 4 içine 50 ul Elüsyon Tampon dağıtın.
    5. Lizis Tampon 10 dakika örnek inkübasyon tamamlamak için 6 dakika duraklama D.
    6. 10 pipetleme döngüleri boyunca etanol ile her bir numune karıştırma, kolon 1 'de her bir oyuğa 375 ul etanol ekleme.
    Ekstraksiyon:
    7. Çalışma Tezgahı pozisyon A2 8 TruTips yükleyin ve Şekil 1'de çıkarma işlemi başlar.
    8. Aspire ve TruTip monolit için nükleik asit bağlamak için yedi döngüleri için örnek plaka sütun 1 numune / lizis tamponu / etanol karışımı dağıtmak. (Klinik örnek viskozite farklılıklar nedeniyle) TruTip ile numune akışı değişebilir olsa da, bu örnek için nükleik asit verimi yok oldut akım değişim etkilenir. Örnek akışının iyileştirilmesi için seçenekler tartışma kısmında tarif edilmiştir.
    9. Artık lizis tamponu ve örnek matris kaldırmak için örnek plaka sütun 2, ve yekpare üzerinde 5x döngüsü Yıkama Tamponu D TruTips taşıyın.
    10. Örnek plaka sütun 3 ve bağlı nükleik asit protein ve diğer kirleri çıkarmak için yekpare üzerinde 5x döngüsü Yıkama Tamponu E TruTips taşıyın.
    11. Monolit kuru için boş Reaktif kabını pozisyonu 1 (Çalışma Tezgahı yerde B2) ve döngü 80x (hızlı bir akış hızında) için TruTips taşıyın. Yıkanarak ayrılan bir nükleik asit preparatlar kalıntı çözücüler olumsuz yönde ters transkriptaz ve Taq DNA polimeraz gibi enzimler etkiler gibi, iyice TruTip kuruması için önemlidir.
    12. Ayıklanır ve saflaştırılmış nükleik asit örnek plaka sütun 4 kuyularda elüsyon tampon şimdi Elüsyon Tampon A'da 5x örnek plaka sütun 4 ve döngüsüne TruTips taşıyın.
    13. EpMotion çöp kutusu içine TruTips çıkarın.
    14. Programı tamamlandığında, manuel cihazdan örnek plaka kaldırmak ve uzun süreli depolama ya da daha sonra kullanmak için yeni tüplere saflaştırılmış nükleik asit aktarın. İsterseniz Gelişmiş epMotion kullanıcılar, ayrı depolama tüpler veya PCR plakaları içine yıkandı, örnekleri aktarmak için Çalıştır dosyaya talimatları ekleyebilirsiniz.

16 toplam örnekleri için program örnek plaka sütun 5-8 kullanarak 10.13 arası adımları 10.1 tekrar edecektir. 24-örnek program için, 10.13 ile 10.1 adımları tekrarlanır 2x örnek plaka sütun sırasıyla 5-8 ve 9-12, kullanarak.

2. Tam Kan 96 oyuklu Genomik DNA ekstraksiyonu

Bir Hamilton YILDIZ sıvı yü kandan eş zamanlı olarak 96 örneğin otomatik çıkarma göstermek için kullanılır. Hamilton YILDIZ isteğe bağlı bir ısıtıcı / sallama ünitesi belirli klinik enzimatik sindirim için önemli olan güverte, geçerli o da epMotion sistemi farklıdırörneğin, tam kan gibi CAL matrisler. Sistem 96 kanallı bir pipet kafası ile donatılmış olabilir, çünkü TruTip adımları ve reaktifler her biri için özel bir 96 oyuklu plaka vardır.

Kurulum

1. YILDIZ alet ve bilgisayarı açın.
2. Hamilton Run kontrol yazılımı açın.
3. 96 örnekleri için Akonni tarafından sağlanan Çalıştır dosyasını açın.
4. STAR güverte üzerine yer laboratuvar Şekil 3 'de gösterildiği gibi.
5. Bunlara karşılık gelen olukları (cilt 96 örnekleri işlemek için gereken minimum ifade) içine reaktifler koyun:

Reaktif	Hacim (ml)	Tekne pozisyonu
Lizis ve Bağlama Tampon F	75	5
% 95 etanol	100	6
Tampon J yıkayın	175	7
YıkamaTampon K	175	8
Seyreltme Tampon maddesi A2	12	9
Proteinaz K (20 mg ml-1)	8	15

6. Örnekleri RT gelmesini sağlayınız.

7. Örnek Taşıyıcı raflar (Şekil 3 güverte konumda 4) içinde örnek tüpleri yerleştirin. En sol taşıyıcı arka yer Örnek 1 ve ön doğru pozisyonda Örnek 96 biten her taşıyıcı aşağı sırayla hareket ettirin.

Otomatik Program

8. Çalıştır dosya pencere ve giriş işlenen örneklerin sayısını üst sol PLAY düğmesini seçin. Otomatik komut dosyası daha sonra kullanıcı müdahalesi olmadan aşağıdaki adımları hareket edecek:
   Örnek Lizis ve Reaktif Dağıtım
   1. O, her bir numune tüpü, konum 14 ° C'de inkübasyon plakaya 200 ul transferbırakmayın / Shaker modülü (Şekil 3).
   2. Inkübasyon levhasının her bir numune de içine 80 ul Proteinaz K dağıtın.
   3. Inkübasyon levhasının her bir kuyuya 600 ul Lizis Tampon F dağıtın.
   4. 10 döngü çözüm karıştırın ve daha sonra 500 ° C'de ve 70 rpm, 20 dakika boyunca inkübe edilir. 70 ° C'ye ayarlanmış bir sıcaklıkta ~ 60 ° ile sonuçlanır proteinaz K aktivitesi aralığında olan derin plaka, içindeki C örnek ısısı. Örneklerin kuluçka iken, sıvı taşıma sistemi, karşılık gelen plaka ve kuyu içine tevzi reaktifleri ile çalışmaya devam eder:
      • Pozisyon 13 derin oyuklu plakanın her oyuğuna 100 ul, Seyreltme Tampon maddesi bir.
      • Pozisyon 10 derin oyuklu plakanın her bir oyuğuna 800 ul etanol.
      • Pozisyon 12 derin oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.6 mL Yıkama Tamponu K.
      • Pozisyon 11 derin oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.6 mL Yıkama Tamponu J.
   5. 20 dakika inkübasyondan sonra, örnek karışım, 10 konumundaki Derin kuyu levhası, inkübasyon plaka aktarılır ve 12 pipetleme döngüleri boyunca karıştırılır.
   6. Çöp kutusu içine reaktif ipuçları çıkarın.
      Çıkarma
      GDNA kan prosedürün bu bölümü yıkama reaktifler ve çevrim numaralarının bileşim dışında, epMotion grip protokolüne çok benzer. Hamilton TruTips uçlarına siyah, bu nedenle TruTip sıvıların akışını görünür değildir.
   7. Güverte konumu 3 96 TruTips yükleyin.
   8. Aspire ve örnek / TruTip yekpare nükleik asitleri bağlamak için 10 döngü 10 sırada lizis tamponu / etanol karışımı dağıtın.
   9. Artık lizis tamponu ve örnek matris kaldırmak için yekpare üzerinden 11 ve 5x döngüsü Yıkama Tamponu J konumlandırmak için TruTips taşıyın.
   10. 12 ve bağlı nükleik asit protein ve diğer kirleri çıkarmak için 5x döngüsü Yıkama Tampon K konumlandırmak için TruTips taşıyın.
   11. Çevrim yüksek hızda 40x TruTip kurumaya.
   12. Pozisyon 13 ve Elüsyon Tampon A2 5x döngüsüne TruTips taşıyın. Ekstre edilmiş ve saflaştırılmış nükleik asit derin plaka elüsyon tamponu içinde artık.
   13. Çöp kutusu içine TruTips çıkarın.

Program tamamlandığında, cihazdan Elüsyon Plaka çıkarın ve depolama veya alt uygulamaları için uygun tüplere çıkarılan örnekleri aktarın.

3. Büyük Hacimli Plazma Örnekleri DNA Ekstraksiyon

Hamilton STARplus alet maternal plazma 5 ml DNA fetal serbestçe dolaşan ayıklanması için otomatik bir protokol göstermek için kullanılır. STARplus sistemi iki otomatik pipet kanalı silah, 8 x 5 ml kanallı bir ve 8 x 1 ml kanallı bir destekleyebilir. Bu kollar 8 örnek her gruplar halinde sendeleyerek işleme paralel olarak çalışabilir. 5 ml'lik bir TruTip başlangıç ​​l kullanılırarge ses çıkarma, 1 ml'lik bir TruTip boyut ayırma ve ayıklanan bir nükleik asidin bir daha konsantrasyon yapılması için kullanılır.

Set-up

1. STARplus alet ve bilgisayarı açın.
2. Hamilton Run kontrol yazılımı açın.
3. 8 büyük hacimli plazma örnekleri için Akonni tarafından sağlanan Çalıştır dosyasını açın.
4. Şekil 4'te gösterildiği gibi STARplus güverte üzerine yer laboratuvar.
5. Bunlara karşılık gelen rezervuar içine reaktifler koyun:

Reaktif	Hacim (ml)	Tekne pozisyonu
CN-W1	17	5A
CN-W2	17	5B
CN-W4	21	5C
Proteinaz K (20 mg ml-1)	5	6A
EBB	17	6B
EBA2	5	6C
CN-W3	5	6D
CN-B2	5	6E
CN-B3	5	6F
CN-L1	52	7
CN-B1	175	8

6. Örnek RT gelmesini sağlayınız.
7. Örnek Taşıyıcı raflar (Şekil 4 güverte konumda 3) içinde örnek tüpleri yerleştirin. Arka yerleştirin Örnek 1 ve güverte önüne doğru sırayla hareket ettirin.

Otomatik Program

Çünkü büyük bir giriş, örnek hacmi, parçalama ve homojenizasyon adımları bir su banyosu içinde Hamilton STARplus aygıtının kapalı gerçekleştirilmelidir. Otomatik protokol içinde kullanıcı müdahalesi gerektiren adımlar beginnin bir yıldız (*) ile gösterilircümle ve kalın g.

Örnek Lizis ve Reaktif dağılımı: bir numune homojen hale getirmek ve DNA serbest bırakmak için proteinaz K ve lizis tamponu ile inkübe edilir.

8. Çalıştır dosya penceresinin sol üst PLAY düğmesini seçin. Örneklerin giriş sayısı, güvertede pipet uçları yerini ve güvertede TruTips yerini işleniyor.
9. Otomatik komut dosyası 615 ul proteinaz K, 5 ml plazma, ve her 50 ml konik tüp 6.2 ml Lizis Tampon CN-L1 ekler ve olacak daha sonra PAUSE.
10. * Yüksek hızda 30 sn için örnek güverte, girdap 50 ml konik tüp çıkarın ve 60 ° C'de bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 30 dakika için off-line inkübe edin. Konik tüpler Hamilton güverte kaldırılır sonra, kendi plakaları ve kuyu (Şekil 4B ve 4C) içine reaktif dağıtım devam etmek için otomatik komut dosyası RESUME:
    • 2 pozisyon 9 sütun 1'de her kuyuya ml CN-W1.
    • 2 ml CN-W2 konumu 9 sütun 2'de her kuyuya.
    • 2 ml CN-W4 pozisyonu 9 sütun 3 her kuyuya.
    • Pozisyonda her kuyuya 250 ul EBA2 9 sütun 4 ve 5.
    • Konumu 10 sütun 1'de her bir kuyunun 495 ul CN-B2.
    • Pozisyon 10 sütun 2'de her iyi ile 1 ml EBB.
    • Pozisyonu 10 3. sütunda her bir kuyunun 500 ul CN-W3.
    • 500 ul CN-W4 pozisyonda her de 10 ile sütun 4.
    • Pozisyon 10 kolonu 5 her bir kuyucuğa 50 ul EBA2.

5 ml kanalları güverte 9 sırada derin plaka her kuyuya her bir örnek için bitişik kuyu, otomatik bir programın dağıtır reaktifler kullanmak için çok geniş olduğu için. 1 ml kanallar için kullanılan mekanik kol da dışlama ve konsantrasyon st için reaktif plakalar her kuyunun kullanımını gerektirirProtokolün eps.

Dağıtım reaktifler sonra, program PAUSE olacak.

11. * 30 dakika sonra, 60 ° C de inkübasyon, 5 dakika için buz üzerinde 50 ml konik tüp yerleştirebilir.
12. * Güverte pozisyon 4 de örnek taşıyıcı raf içinde orijinal konumlarına 50 ml konik tüpler dönün ve otomatik komut dosyası RESUME.
13. Her bir örnek tüpüne 12 ml Bağlama Tampon CN-B1 ekleyin ve 10x karıştırın.

Geniş Hacim Ekstraksiyon: 5 ml TruTips parçalanmış plazma numunesi, toplam DNA çıkarılması için kullanılır.

14. Büyük hacimli nükleik asit ekstraksiyon için pozisyon 2 5 ml TruTips almak.
15. Döngü Örnek 50 ml konik bir tüp içinde mixture15 kez, tüpün altındaki başlangıç ​​ve her bir pipetleme işleminden sonra daha fazla 3 mm hareket. Bu adım, TruTip yekpare için toplam nükleik asit bağlar.
16. Pozisyonda derin kuyucuğu 6 sütun 1 ve cy TruTips hareketYıkama Tampon CN-W1 cle 1x.
17. Yıkama CN-W2 9 sütun 2 ve döngü 1x konumlandırmak için TruTips taşıyın.
18. 9 sütun 3 ve Yıkama CN-W4 döngüsü 2x konumlandırmak için TruTips taşıyın.
19. Bağlayıcı matris kuru yüksek hızda 40x 9 sütun 4 ve döngü konumlandırmak için TruTips taşıyın.
20. 5 ml TruTips gelen bağlı nükleik asitlerin Zehir için 10x 9 sütun 5 ve döngü konumlandırmak için TruTips taşıyın. Bu büyük hacimli elüsyon 1 numaradır.
21. Sütun 6 TruTips hareket ve elüsyon tampon ikinci kısım ile adımı tekrarlayın. Bu büyük hacimli elüsyon # 2'dir.
22. Elüsyon # 1 ile birleştirmek ve TruTips atmak için pozisyon 9 sütun 5 içine elüsyon 2. aktarın.

Dışlama ve Konsantrasyon: Yüksek moleküler ağırlıklı DNA ekstre örneği çıkarılır ve geri kalan DNA izole edilir ve konsantre edildi.

23. 10 sütun 1 pozisyon ve iyice 10x karıştırmak için adım 22 kombine yıkama sıvısı ekleyin.
24. 1 ml TruTi almakmonolit için yüksek molekül ağırlıklı DNA bağlamak için pozisyon 13 ve döngü 20x ps.
25. Ucu yıkayın ve yüksek molekül ağırlıklı DNA kaldırmak için 5x 10 sütun 2 ve çevrim pozisyonuna TruTips hareket ettirin. TruTips muhafaza ve pozisyon 13 ucu rafa geri yerleştirilir.
26. Pozisyon 12 reaktif ipuçları ile, pozisyon 10x 10 sütun 1 ve karışımı örnek bağlama Tampon CN-B3 575 ul ekleyin.
27. Adım 25 TruTips almak, 1 ml TruTip için örnek kalan DNA bağlamak için 10 sütun 1 ve çevrim 20x pozisyon dönmek.
28. Kalan inhibitörleri kaldırmak için Yıkama CN-W3, 10 sütun 4 ve döngü 1x konumlandırmak için TruTips taşıyın.
29. CN-W3 den kalan tuzlar durulama Yıkama CN-W4 10 sütun 5 ve döngü 1x konumlandırmak için TruTips taşıyın.
30. Konumu üzerinde yekpare kurumaya 35x ipuçları ile 10 sütun 5 ve bisiklet hava TruTips kaldırın.
31. Saflaştırılmış, boyut-seçimi Zehir EBA2 olarak 10x 10 sütun 6 ve döngü konumlandırmak için TruTips hareketted ve konsantre edilmiş bir nükleik asit.
32. TruTips atın.
33. Konumda 11 Kolon 6 için 1.5 ml tüpler yıkandı, örnek aktarın. Çıkarılan örnekler depolama veya alt işlem için hazır.

Sonuçlar

NPA influenza RNA çıkarılması için gerçek zamanlı PCR veri Şekil 5A gösterilmiştir. Tahmin edilen nükleik asit çıkarma verimliliğini protokol ¹⁵ manuel versiyonu ile elde edilen sonuçlara benzerdir. Ortalama C _t değerleri bir doğrusal yanıt ortalama C _t standart sapma az 1 değerleri ile ^{6 4} 10 ila 10 gen kopya ml ^-1, (A ve B influenza = 0.99 ve 0.98, sırasıyla R ₂₎ grip değiştirilmiştir görülmektedir döngüsü. EpMotion sistemi ile çapraz kontaminasyon olmaması 10 ⁶ gen kopya ml ^-1 NPA içeren 12 olumlu NPA örnekleri 12 tampon boşlukları ile serpiştirilmiş edildi Şekil 5B, gösterilmiştir. Pozitif kontrol için ortalama C _t ± 0.14 30.16 oldu, ve tüm tampon boşlukları negatifti. Toplam örnek işlem süresi sırasıyla 8, 16 ve 24 örnekleri için 16, 28 ve 40 dakika vardır.Tipik bir klinik nazofarenks aspirasyon veya sürüntü 10 ⁷ gen kopya ml ^-1 içerir çünkü (1.000 TCID başına virionların ₅₀ ¹⁶ ve varsayarak> 10 ⁴ TCID ₅₀ ml ^-1 grip ^17), otomatik epMotion protokolü bir çoğunluğu üzerinde etkili olması bekleniyor Klinik NPA örneklerin.

Insan genomik DNA üzerinde gerçekleştirilen testler moleküler aralığı göz önüne alındığında, tüm kandan nükleik asit çıkarma, birincil amacı kirletici madde içermeyen, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA üretmektir. 96 örnekleri için otomatik protokolü (örneğin Promega MagneSil = 90 dakika ve Qiagen QIAamp DNA Kan Biorobot MDx sistemi = 2.5 saat). Şekil 6A UV / Vis absorbans profilleri için gösterir diğer otomatik sistemler üzerinde bir gelişmedir 1 saat, içinde tamamlanır Bir ortalama ile, Hamilton YILDIZ protokolü 45 reaktif boşlukları ile eş zamanlı olarak işlenmiş 45 pozitif kan örnekleri 260/280 oranı ve 1.93 ortalama bir _260/230 oranı. 1.7-2.0 ve> 1.7 genellikle artık tuzlar, protein veya solvent içermez, çok saf DNA göstergesidir, ve en alt moleküler uygulamalar için kabul edilebilir bir _260/230 oranı arasında bir A _260/280 oranı. Şekil 6B 'de% 1 agaroz jel elde gDNA minimum kesme ile yüksek moleküler ağırlıklı (> 24 kb), sahip olduğunu göstermektedir. 45 pozitif örnekler tam kümesinden ortalama nükleik asit verimi 5.26 ± Life Technologies Quantifiler İnsan DNA miktar tayini Kiti dayalı 200 ul tam kan başına 0.46 mg insan DNA,. Şekil 5B 'de gösterilenlere benzer bir çapraz kontaminasyon çalışmalarda pozitif numune serpiştirilmiş ve paralel ekstre negatif kontrol tamponu boşlukları ile yapıldı; Tüm boşluklar (şekilde gösterilmemiştir) PCR ile daha negatiftir. Arıtılmış gDNA (gösterilmemiştir) da çok sayıda diğer PCR bazlı analizler için uygundur.

Büyük hacimli TruTip prosedürü ile işlenen bir havuza anne plazma örneği, sekiz tekrar örnekleri alınan gerçek zamanlı sonuçları Şekil 7 'de gösterilmiştir. Tam protokolü (off-line proteinaz K kuluçka dahil) Nükleik Asitler Kiti (hiçbir karşılaştırılabilir otomatik ekstraksiyon kitleri henüz mevcut) Sirkülasyon Qiagen manuel benzer yaklaşık 2.5 saat, bitti. Tüm çoğaltır boyunca ortalama C _t değerleri 34.58 ± 0.66 ve 29.76 ± fetal erkek (CHY) ve toplam (CH1) DNA için 0.50, sırasıyla, otomatik ekstraksiyon yöntemi mükemmel tekrarlanabilirlik göstermektedir vardır. Toplam DNA havuzu (genom benzeri) içinde fetal DNA konsantrasyonu, 2.8% tüm örnekleri arasında ortaya çıkan ortalama% fetal DNA ile, standartlara uygun noktası analizi karşılaştırma esas alınarak hesaplanır. Örnekleri çıkarma yapmadan önce toplanmış çünkü bu örnek için gerçek% fetal DNA bilinmemektedir. Fetal DNA bileşiminon-plazma örnekleri toplanmış TruTip yöntemi kullanılarak ekstre Qiagen Dolaşım Nükleik Asitler Kiti (gösterilmemiştir) ile sonuçlar ile karşılaştırıldığında, genellikle, 1.5 kat daha yüksektir.

Şekil 1. TruTip çıkarma işlemi ve sıvı taşıma sistemi ne olursa olsun iş akışı,. Diğer numune hazırlama veya sıvı taşıma adımları belirli sıvı taşıma aracı ve yazılım özelliklerine bağlı olarak otomatik rutinleri içine dahil edilebilir.

Şekil 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 örnek plaka düzeni. Reaktif / consuma (B) DüzenlemeepMotion sadece aynı anda 8 numune maksimum işleyecek rağmen Çalışma Tezgahı üzerinde Gide. örnek plaka, 24 örnek (sütunlar 1, 5 ve sırasıyla 9,) 'e kadar yapılandırılabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Tam kan genomik DNA arındırıcı Hamilton YILDIZ güverte düzeni (ölçekli değildir) Güverte Pozisyon 1 = Hamilton 1 ml filtre ipuçları;. 2 = Hamilton 1 ml olmayan filtre ipuçları; 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = giriş kan örneği taşıyıcıları (kan alma tüpleri veya mikrosantrifüj tüpleri); Lizis Tampon F, Etanol için 5-9 = 290 ml reaktif olukları, sırasıyla Tampon J, Yıkama Tampon K ve Elüsyon Tampon A2, yıkayın; 10 = 96 deep iyi Bağlama plaka; 11 de J yıkayın = 96 derin; 13 = 96 derin kuyu Elüsyon plaka,, 14 Nunc 96 derin kuyu Kuluçka plakalı = Hamilton HHS2 ısıtıcı / Shaker; 15 = 50 ml reaktif çukur 12 = 96 derin kuyu K yıkayın proteinaz K. içeren büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Büyük hacimli plazma örnekleri (ölçekli değildir) elde edilen DNA saflaştırılması için Hamilton STARplus güverte düzeni. 8 x 5 mi kanalı ve 8 x 1 ml kanalı (güverte düzeni gösterilmemiştir) ile donatılmıştır. Güverte Pozisyon 1 = Hamilton 4 ml filtre ipuçları; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = kaynak plazma örnekleri, 4 = 50 ml konik tüpler, CN-W1, CN-W2 ve CN-W4 içeren 5 = 120 ml reaktif olukları ReageNTS; 6 proteinaz K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB ve CN-W3 reaktifler içeren = düşük hacimli reaktif olukları; 7 = CN-L1 reaktif içeren 290 ml reaktif çukur; 8 = 290 ml reaktif çukur içeren CN -B1 reaktif; 9 Adım 1 = 96 derin kuyu plakalar, 10 Adım 2 = 96 derin kuyu plakalar, saflaştırılmış, nihai ürün için 11 = örnek taşıyıcılar; 12 = Hamilton 1 ml filtresiz ipuçları; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. (A). Grip virüsü otomatik TruTip çıkarma gerçek zamanlı PCR sonuçları nazofarenks aspirat (NPA) ilave. Giriş NPA hacmi = 100 ul, elüsyon hacmi = 50 ul. Toplam 3 çoğaltmak e ortalamaseyreltme seviyesi ve grip hedef başına 5 ayrı NPA arka (n = 15) xtractions. qPCR daha önce ¹⁵ açıklanan test koşullarına LightCycler 480 sistemi üzerinde yapıldı. 12 olumlu NPA örnekleri hiçbir şablon kontrolleri ve otomatik çıkarma prosedürüne tabi serpiştirilmiş zaman (B) Hayır çapraz kontaminasyon tespit edilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

6 Şekil. Rastgele seçilen 10 Bir NanoDrop 1.000 (ThermoFisher) tam kan insan genomik DNA izolasyonu sonuçları. A) UV-Görünür izleri çoğaltır. B)% 1 TruTip saflaştırılmış gDNA agaroz jel. M = Fisher 24 kb Max DNA Merdiven. Lanes 1 - 4 = ~ 100 ng saflaştırılmış gDNA dört rastgele seçilmiş çoğaltır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7. Serbestçe plazma DNA dolaşımdaki sekiz çoğaltmak TruTip çekimi gerçek zamanlı PCR sonuçları. Yıldız (* veya **) ile gösterilir Örnekleri ayrı günlerde çıkarıldı. CHY erkek fetal DNA rakamlarla ve CH1 toplam DNA mevcut (fetal ve maternal) rakamlarla. QPCR CHY CH1 ¹⁸ hedefleme deneyleri daha önce yayınlanmış olan LightCycler 480 sistemi (Roche) üzerinde gerçekleştirildi.

Tartışmalar

TruTip kavramı ve iş akışı sadeliği (Şekil 1) bu kolay, otomatik verimli ve klinik örnek matrisleri, giriş numune hacimleri ve sıvı taşıma sistemleri bir dizi için etkili, adapte olun. Her klinik örnek benzersiz olduğunu, ancak, kabul edilmelidir, ve viskozite sonraki bir, parçacık, mukus, yüzey kirleticiler, mikrobiyal ve / veya insan genetik arka değişir. Klinik örnek kompozisyon ve otomatik bir TruTip örnek hazırlama protokolü kullanım amaçları beklenen değişimler göz önüne alındığında, bu nedenle belirli bir örnek türü için istenen sonuçları elde etmek için bir TruTip prosedürde bazı adımlar değiştirmek gerekli olabilir. Ne olursa olsun örnek türü, ancak, genellikle nükleik asit saflığı ve / veya kurtarma en önemli etkiye sahip TruTip parametreler şunlardır:

1. Lizis tamponu (ve alkol) ile örnek karıştırma ve homojenizasyon. TruTips yeniden sahip olsa dalatively büyük gözenek boyutu, örnek homojenizasyon ve sıvılaşma verimli hücre parçalama için çok önemlidir, ve TruTip yekpare sonra bağlayıcı adımlar. Homojen ve iyi sıvılaştırılmış lizat ile, örnekler genel örnek işleme süresini azaltır yüksek akış oranları ile TruTip hareket edebilir. Büyük hacimli plazma protokolü büyük giriş örnek hacmi rağmen, iyice homojenize ve zor örnekleri (on-line veya off-line) sıvı hale kullanıcılar için potansiyel göstermektedir.
2. Akış oranları. Yavaş akış oranları bir nükleik asit bağlayıcı bir veya yıkama sırasında tipik olarak toplam işlem süresi pahasına olsa da, daha yüksek nükleik asit verimi ile sonuçlanabilir. Yavaş akış oranları da DNA kesme ölçüde azaltabilir.
3. Döngüsü numaraları. Optimum aspirasyon sayısı ve döngüleri dağıtmak numune tipi, toplam örnek hacmi ve akış hızı bağlıdır. Şekil 1, Adım 1, tipik olarak bir nokta olduğu döngü numbe ders (ve akış hızı) gibi farklı hastalardan nedeniyle NPA viskozite aralığına optimize etmek daha zor lizatları birini temsil nazofarenks aspirasyon (Şekil 5) gibi örnekleri ile, bazı ampirik optimizasyon gerektirebilir.
4. Kurutma. TruTip yekpare tam kurutma saflaştırılmış nükleik asit örnek ve inhibe alt süreçleri ya da testleri ile birlikte salınımlı gelen artık organik çözücüler önlemek için zorunludur. TruTip santrifüj veya vakumlu filtrasyon yoluyla kurutuldu değildir, çünkü, bu kurutma adımı sırasında akım oranı ve döngü sayısı en üst düzeye çıkarmak için önemlidir. Bazen kurutma döngüsü tamamlandıktan sonra TruTip bir ucu üzerinde yıkama çözeltisinin bir damlacık kalıntı yoktur. Hamilton robot böylece solvent içermeyen elüsyon sağlanması, damlacık serbest bırakmak için iyi tarafında bir "ipucu dokunuş" gerçekleştirmek için yeteneğine sahiptir. EpMotion sistemi bu özelliği var, ama bir el içinde TruTip terminus ön durulama değilkirlenmesi tamponu, aynı etkiyi elde etmek için programlanabilir.

Robot kanal kollar için geometri, pipet malzeme ve ek yöntem her araç üreticisi için benzersiz olduğu için, farklı bir TruTip yapı her sıvı taşıma sistemi için gereklidir. TruTip monolit boyutları (çap, kalınlık ve gözenek boyutu) nükleik asit bağlama kapasitesi (ve yıkama verimliliği) ile ilişkili yok, herhangi bir katı-faz ekstraksiyon tekniği için bekleniyor. Kalın (> 4 mm) matrisler büyük hacimli örnekleri ve / için nükleik asit bağlama kapasitesinin artırılması ya da belirli TruTip biçimleri arasında bağlama kapasitesi eşitlemek için 1 ml TruTip içine gömülü olsa da, TruTip kalınlığı ve akış oranları arasında bir değiş tokuş sırasında orada ilk bağlama adımı (ham lizatları varlığında). Bu nedenle, otomatik bir protokolün ilk adımları için daha büyük hacimli pipet uçları içine büyük çaplı yekpare embed bazen avantajlıdır, (örneğin </ Em> büyük hacimli çekimi için 5 ml Hamilton / Akonni TruTips). Sıvı taşıma robot üreticileri tarafından dikte özel TruTip yapılandırmaları göz önüne alındığında, ancak, mutlaka TruTip nükleik asit verimleri farklı üreticilerin, veya farklı TruTip boyutları arasında sıvı taşıma platformlarında aynı olması için beklemeyin.

Normalde steril siteler (örneğin beyin omurilik sıvısı) elde sürece klinik örnekler (tanım olarak) insan genomik DNA önemli miktarda içerir. Diğer uygulamalarda, insan genomik DNA'sı, istenmeyen bir arka (Şekil 5 gibi) temsil etmektedir, bazen insan genomik DNA'sı, (Şekil 6'daki gibi) tercih edilir. Arka plan DNA varlığı, genellikle monolit bağlama kapasitesi aşmayacak numunedeki nükleik asidin toplam miktarının sürece sorun teşkil etmez, arka plan DNA'nın bir taşıyıcı olarak hizmet edebilir, istenen hedef nükleik halindeasit eser miktarda bulunur. Yüksek hacimli plazma çıkarma protokolü (Şekil 7) amacı, olması dışında bulaşıcı hastalık test edilen numune hazırlama amacı benzer anne bir DNA 10-20 kat fazla, mevcudiyetinde (bölünmüş) DNA fetal izole etmektir dizileri derece uyumlu olan ve sadece yüksek derecede spesifik moleküler testleri ve / veya boyut ayrımı ile ayırt edilebilir. Bu durumda, toplam DNA, dolaşımdaki 5 ml TruTip ve daha sonra yüksek molekül ve düşük molekül ağırlıklı DNA fetal yoluyla ayrılır kullanılarak izole edilir bağlama tamponu koşullar değiştirilerek, 1 ml'lik bir TruTip yapışmasından ve elüsyon. Bir silika yekpare kendi bağlanma ve elüsyon özelliklerine göre hedef nükleik asitlerin selektif boyut ayırma ve zenginleştirme zarlar ya da boyut dışlama spin sütunları ile elde göre hareket önemli ölçüde farklı bir moddur. Insan genomik DNA mikrobiyal DNA boyutu ayırma ve zenginleştirme bir olabilirTruTip bağlayıcı ve elüsyon tampon özelleştirme yoluyla gelecekte uygulamalarında ccomplished.

Otomatik protokolleri burada çeşitli klinik örneklerden işlenmesi için TruTip yekpare kendi yarar ve nasıl geniş hacimli ve belirli sıvı taşıma robotlar için adapte edilebilir vurgulamak gösterdi. Aerodinamik yöntemler genellikle diğer otomatik sistemlere göre daha hızlı çıkarma protokolleri neden. TruTip işlemleri otomatik hale getirmek için gerekli olan temel donanım pipet kanal kol kendisi yerine manyetik çubuklar, vakum sistemleri, çünkü TruTip teknoloji basitlik Ancak, aynı zamanda, yeni, otomatik nükleik asit arıtma sistemi satın alma ilgilenenler için bazı maliyet avantajı tanıyor , ya da on-board santrifüjler. Önceden doldurulmuş reaktif plakaları kullanan da alan ve gerekli sarf azaltmak ve çalışma başına verim iki katına çıkarabilir. TruTip protokolleri ile güverte alanı en aza indirmek de entegre gelişmiş olanak sağlar yukarı veya dTruTip ile ownstream otomatik işlemler. Örneğin damıtmak tam kan için Hamilton easyBlood çözümü önemli ölçüde biyo-bankacılık süreçlerini olur otomatik TruTip ekstraksiyon yöntemi ile dahil edilebilir. Bu nükleik asit kantitatif, normalleştirme, PCR set-up, ya da DNA dizi analizi gibi post-çıkarma işlemleri de kolayca büyük sıvı taşıma platformlarda TruTip ile entegre edilmiştir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-11120
95% Ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
99% Acetone	Sigma-Aldrich	270725-4L
DEPC-treated water	Life Technologies	AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml	Eppendorf	960050100
Deep well plate 96/2,000 μl	USA Scientific	30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl	Eppendorf	960050100
Equipment
epMotion 5070 System	Eppendorf	5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8	960001061
Reservoir rack	960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-20341
95% ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235904
50 ml Reagent Trough	Hamilton Robotics, Inc.	187297
Deep Well 2 ml plate	USA Scientific	1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml	Thermofisher	27874
Reagent Trough	Fisher	14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System	Hamilton Robotics, Inc.	173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173050
1 ml 96-channel head	Hamilton Robotics, Inc.	199090
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
Sample Carriers/Inserts	Hamilton Robotics, Inc.	173400/182238
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
HHS2 Heater Shaker Unit	Hamilton Robotics, Inc.	199033
Rack Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	Call to inquire
100% ethanol	Sigma-Aldrich	459828-1L
Isopropanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC327270010
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
Filtered 4 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	184022
Unfiltered 1 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	235939
96-Deep Well Plates	USA Scientific	1896-2800
50 ml Conical Tubes	Corning/ThermoFisher Scientific	05-526B
50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	187297
120 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs	ThermoFisher Scientific	14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module	Hamilton Robotics, Inc.	173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	184090/173050
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	188047
120 ml Reagent trough carrier	Hamilton Robotics, Inc.	185290
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
50 ml Tube Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182245
24 Position Sample Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	173400
32 Position Sample Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.