Method Article
TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.
TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Yekpare geometrisi, 1.0 ila 5.0 ml hacim arasında değişen belirli bir pipet uçları için adapte edilebilir. Yekpare büyük gözenek kolayca minimum akışkan geri basınç ile geçmesine viskoz veya karmaşık örnekleri sağlar. Çift yönlü akış yekpare ve örnek arasında kalma süresi en üst düzeye çıkarır ve tek TruTip içinde işlenecek büyük örnek hacmi sağlar. Ne olursa olsun numune hacmi veya TruTip geometrinin temel adımlar, hücre lizisi TruTip yekpare iç gözenekleri bağlayıcı bir nükleik asit, bağlanmamış numune bileşenleri ve lisis tampon yıkayarak ve uygun bir tampon içine saflaştırılmış ve konsantre nükleik asitleri yıkanarak içerir. TruTip özelliklerini ve uyum bir Eppendorf epMotion 5070 kullanarak üç otomatik klinik örnek işleme protokollerinde gösterilmiştir, Hamilton STAR ve nazofarenks aspirat, kandan genomik DNA izolasyonu ve fetal DNA ekstraksiyon ve maternal plazma geniş hacimli (sırasıyla) den zenginleştirme RNA izolasyonu dahil olmak üzere STARplus sıvı taşıma robotlar,.
Nükleik asit saflaştırma en moleküler tanı için, araştırma sadece kullanmak gereklidir ve yaşam bilimleri uygulamaları. Çeşitli yaklaşımlar fenol / kloroform ekstraksiyon işleminden itibaren ortaya çıkmıştır, bunun pek çok kaotropik tuzlar 1 mevcudiyetinde silika bağlama nükleik asidin temel ilkesine dayanmaktadır. Çıkarma işlemi (2-13 olarak örneklere bakın) dönüş filtreleri, manyetik boncuk ve yaşam bilimleri sektöründe hakim ilgili yaklaşımlar, çeşitli boncuk ve membran tabanlı biçimler aracılığıyla akıcı ve otomatik olmuştur. Etkili iken zorlu klinik matrisler ile karşı karşıya zaman, parçacıklar ve membranlar sınırlamalar tanıyoruz. Örneğin, membranlar ve boncuk tabanlı sütun uyumlu, küçük gözenek boyutları (böylece, yüksek karşı basınçlı) var ve bir santrifüj veya vakum sistemi tarafından işlenmesi için destek bir tür gerektirir. Zarlar, fiziksel özellikleri ve boncuk sütun sonuçverimli sarf ve / veya tek yönlü akış yolu ile işlenebilir toplam (giriş) örnek hacmi tıkanma olmadan işlenebilir örnekleri türünü sınırlar önemli akışkan direnci,. Tersine, manyetik parçacıklar çalkalama ile numune içinde dağıtılmalıdır. Homojen bir çözüm içinde manyetik parçacıkların dağıtmak için ihtiyacı en manyetik boncuk sarf malzemeleri ile işlenebilir toplam giriş örnek hacmi sınırlar. Klinik örnek özelliklerini (örneğin, viskozite ve karmaşıklık gibi), bir tüp veya çubuk tarafındaki verimsiz manyetik partikül konsantrasyonu yol açabilir. Buna ek olarak, silika ince partiküller kendi mıknatıslanma kaybetme ve son örnek kirlenmesine, çıkarma işlemi sırasında boncuk kapalı zarar verebilir.
TruTip teknolojisi, bu nükleik asit örnek işleme kısıtlamaları ve sınırlamaları 14 bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Bir içinde gözenekli bir yekpare gömerekpipet, akışkan geri basınç düşer, vakum (yani pipet aspirasyon) tarafından akış kontrolü sağlar hangi. Bu özellik, büyük ölçüde (Şekil 1) basitleştirilmiş zor örnek tipleri nükleik asitlerin arındırmak için gereken ekstraksiyon işlemi ve enstrümantasyon sağlar. Yekpare geometrisi ve gözenek yekpare kalınlığı 1.0 5,0 ml kadar numune hacimleri için yeterli nükleik asit bağlama kapasitesi sağlarken, tıkanma en aza indirmek için özel olarak tasarlanmıştır. Örnek aspirasyon ve dağıtım sırasında çift yönlü akışı örnek özü ve verimli nükleik asit kurtarma ve elüsyon için bağlayıcı yekpare arasında uzun süreli ikamet kez izin verir ve pipet kendi hacim kapasitesi aşan işlenecek nispeten büyük örnek hacmi sağlar. Daha önce tek veya çok kanallı Rai kullanarak nazofarenks örneklerinden grip RNA arındırıcı için bir el TruTip prosedürün geliştirme ve uygulama rapornin pipet 15. Eşdeğer ekstraksiyon verimleri 10 6 gen kopyaları da otomatik Qiacube ve manuel TruTip yöntemleri arasında influenza A ml başına nazofarengeal aspirat elde edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, yaygın referans klinik laboratuvarlarda bulunan sıvı taşıma robotlar kullanarak nazofarenks aspirat (NPA) ve diğer klinik örnek türleri için orta ve yüksek verimli, otomatik TruTip nükleik asit saflaştırma işlemleri, göstermekti.
Üç otomatik TruTip çıkarma protokolleri tarif ve burada gösterilmektedir: bir Eppendorf epMotion 5070 NPA 1) orta verimli RNA ekstraksiyon, 2) Hamilton STAR tam kan düşük hacimli yüksek verimli genomik DNA ekstraksiyon ve 3) seçici izolasyonu ve Hamilton STARplus üzerinde maternal plazma geniş hacimli gelen parçalanmış fetal DNA zenginleştirme. Otomatik komut Akonni edinilebilir ve sadece üst düzey programı tanımlayıcıları burada verilmektedir. Klinik örneklerden işlenmeden önce çıkarma ve yıkama reaktifler otomatik olarak otomatik komut dosyası (ler) tarafından toplu reaktif olukları 96-kuyucuğu dağıtılmıştır.
1. Nazofarenks Aspire üzerinden Otomatik RNA Ekstraksiyon
Daha önce tarif edilen yöntem, 15 kılavuzu TruTip hemen 1.0 ml lik Eppendorf boru içine bir büyük gözenek TruTip matrisi kullanılarak, bir Eppendorf epMotion 5070 sıvı yü çalışacak şekilde uyarlanmıştırtte ipuçları, bir 2 ml derin plaka (ABD Scientific), Akonni TruTip çıkarma reaktifler ve NPA örnek türü olarak. EpMotion 5070 sıvı yü aynı anda, yani bir temel otomatik protokol 8 paralel çekimi için açıklanmıştır 8 ipuçları kadar tutar. Bununla birlikte, 24 taneye kadar numuneleri kuyulu 96 oyuklu plaka örnek olarak, tek bir programı sırasında işlenebilir. Ayrı bir epMotion programı 16 veya 24 örnekleri işlemek için (ve gerekli) kullanılabilir. Aşağıda özetlenen Protokol 8 örnek otomatik komut dosyası içindir.
Kurulum
Reaktif | Hacim (ml) | Tekne pozisyonu |
% 95 etanol | 3.5 | 2 |
Tampon D yıkayın | 9.0 | 3 |
Tampon E yıkayın | 9.0 | 4 |
Seyreltme Tampon maddesi A2 | 1.3 | 5 |
Lizis ve Bağlama Tamponu D | 11.0 | 6 |
Otomatik Program
16 toplam örnekleri için program örnek plaka sütun 5-8 kullanarak 10.13 arası adımları 10.1 tekrar edecektir. 24-örnek program için, 10.13 ile 10.1 adımları tekrarlanır 2x örnek plaka sütun sırasıyla 5-8 ve 9-12, kullanarak.
2. Tam Kan 96 oyuklu Genomik DNA ekstraksiyonu
Bir Hamilton YILDIZ sıvı yü kandan eş zamanlı olarak 96 örneğin otomatik çıkarma göstermek için kullanılır. Hamilton YILDIZ isteğe bağlı bir ısıtıcı / sallama ünitesi belirli klinik enzimatik sindirim için önemli olan güverte, geçerli o da epMotion sistemi farklıdırörneğin, tam kan gibi CAL matrisler. Sistem 96 kanallı bir pipet kafası ile donatılmış olabilir, çünkü TruTip adımları ve reaktifler her biri için özel bir 96 oyuklu plaka vardır.
Kurulum
Reaktif | Hacim (ml) | Tekne pozisyonu |
Lizis ve Bağlama Tampon F | 75 | 5 |
% 95 etanol | 100 | 6 |
Tampon J yıkayın | 175 | 7 |
YıkamaTampon K | 175 | 8 |
Seyreltme Tampon maddesi A2 | 12 | 9 |
Proteinaz K (20 mg ml-1) | 8 | 15 |
6. Örnekleri RT gelmesini sağlayınız.
7. Örnek Taşıyıcı raflar (Şekil 3 güverte konumda 4) içinde örnek tüpleri yerleştirin. En sol taşıyıcı arka yer Örnek 1 ve ön doğru pozisyonda Örnek 96 biten her taşıyıcı aşağı sırayla hareket ettirin.
Otomatik Program
Program tamamlandığında, cihazdan Elüsyon Plaka çıkarın ve depolama veya alt uygulamaları için uygun tüplere çıkarılan örnekleri aktarın.
3. Büyük Hacimli Plazma Örnekleri DNA Ekstraksiyon
Hamilton STARplus alet maternal plazma 5 ml DNA fetal serbestçe dolaşan ayıklanması için otomatik bir protokol göstermek için kullanılır. STARplus sistemi iki otomatik pipet kanalı silah, 8 x 5 ml kanallı bir ve 8 x 1 ml kanallı bir destekleyebilir. Bu kollar 8 örnek her gruplar halinde sendeleyerek işleme paralel olarak çalışabilir. 5 ml'lik bir TruTip başlangıç l kullanılırarge ses çıkarma, 1 ml'lik bir TruTip boyut ayırma ve ayıklanan bir nükleik asidin bir daha konsantrasyon yapılması için kullanılır.
Set-up
Reaktif | Hacim (ml) | Tekne pozisyonu |
CN-W1 | 17 | 5A |
CN-W2 | 17 | 5B |
CN-W4 | 21 | 5C |
Proteinaz K (20 mg ml-1) | 5 | 6A |
EBB | 17 | 6B |
EBA2 | 5 | 6C |
CN-W3 | 5 | 6D |
CN-B2 | 5 | 6E |
CN-B3 | 5 | 6F |
CN-L1 | 52 | 7 |
CN-B1 | 175 | 8 |
Otomatik Program
Çünkü büyük bir giriş, örnek hacmi, parçalama ve homojenizasyon adımları bir su banyosu içinde Hamilton STARplus aygıtının kapalı gerçekleştirilmelidir. Otomatik protokol içinde kullanıcı müdahalesi gerektiren adımlar beginnin bir yıldız (*) ile gösterilircümle ve kalın g.
Örnek Lizis ve Reaktif dağılımı: bir numune homojen hale getirmek ve DNA serbest bırakmak için proteinaz K ve lizis tamponu ile inkübe edilir.
5 ml kanalları güverte 9 sırada derin plaka her kuyuya her bir örnek için bitişik kuyu, otomatik bir programın dağıtır reaktifler kullanmak için çok geniş olduğu için. 1 ml kanallar için kullanılan mekanik kol da dışlama ve konsantrasyon st için reaktif plakalar her kuyunun kullanımını gerektirirProtokolün eps.
Dağıtım reaktifler sonra, program PAUSE olacak.
Geniş Hacim Ekstraksiyon: 5 ml TruTips parçalanmış plazma numunesi, toplam DNA çıkarılması için kullanılır.
Dışlama ve Konsantrasyon: Yüksek moleküler ağırlıklı DNA ekstre örneği çıkarılır ve geri kalan DNA izole edilir ve konsantre edildi.
NPA influenza RNA çıkarılması için gerçek zamanlı PCR veri Şekil 5A gösterilmiştir. Tahmin edilen nükleik asit çıkarma verimliliğini protokol 15 manuel versiyonu ile elde edilen sonuçlara benzerdir. Ortalama C t değerleri bir doğrusal yanıt ortalama C t standart sapma az 1 değerleri ile 6 4 10 ila 10 gen kopya ml -1, (A ve B influenza = 0.99 ve 0.98, sırasıyla R 2) grip değiştirilmiştir görülmektedir döngüsü. EpMotion sistemi ile çapraz kontaminasyon olmaması 10 6 gen kopya ml -1 NPA içeren 12 olumlu NPA örnekleri 12 tampon boşlukları ile serpiştirilmiş edildi Şekil 5B, gösterilmiştir. Pozitif kontrol için ortalama C t ± 0.14 30.16 oldu, ve tüm tampon boşlukları negatifti. Toplam örnek işlem süresi sırasıyla 8, 16 ve 24 örnekleri için 16, 28 ve 40 dakika vardır.Tipik bir klinik nazofarenks aspirasyon veya sürüntü 10 7 gen kopya ml -1 içerir çünkü (1.000 TCID başına virionların 50 16 ve varsayarak> 10 4 TCID 50 ml -1 grip 17), otomatik epMotion protokolü bir çoğunluğu üzerinde etkili olması bekleniyor Klinik NPA örneklerin.
Insan genomik DNA üzerinde gerçekleştirilen testler moleküler aralığı göz önüne alındığında, tüm kandan nükleik asit çıkarma, birincil amacı kirletici madde içermeyen, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA üretmektir. 96 örnekleri için otomatik protokolü (örneğin Promega MagneSil = 90 dakika ve Qiagen QIAamp DNA Kan Biorobot MDx sistemi = 2.5 saat). Şekil 6A UV / Vis absorbans profilleri için gösterir diğer otomatik sistemler üzerinde bir gelişmedir 1 saat, içinde tamamlanır Bir ortalama ile, Hamilton YILDIZ protokolü 45 reaktif boşlukları ile eş zamanlı olarak işlenmiş 45 pozitif kan örnekleri 260/280 oranı ve 1.93 ortalama bir 260/230 oranı. 1.7-2.0 ve> 1.7 genellikle artık tuzlar, protein veya solvent içermez, çok saf DNA göstergesidir, ve en alt moleküler uygulamalar için kabul edilebilir bir 260/230 oranı arasında bir A 260/280 oranı. Şekil 6B 'de% 1 agaroz jel elde gDNA minimum kesme ile yüksek moleküler ağırlıklı (> 24 kb), sahip olduğunu göstermektedir. 45 pozitif örnekler tam kümesinden ortalama nükleik asit verimi 5.26 ± Life Technologies Quantifiler İnsan DNA miktar tayini Kiti dayalı 200 ul tam kan başına 0.46 mg insan DNA,. Şekil 5B 'de gösterilenlere benzer bir çapraz kontaminasyon çalışmalarda pozitif numune serpiştirilmiş ve paralel ekstre negatif kontrol tamponu boşlukları ile yapıldı; Tüm boşluklar (şekilde gösterilmemiştir) PCR ile daha negatiftir. Arıtılmış gDNA (gösterilmemiştir) da çok sayıda diğer PCR bazlı analizler için uygundur.
Büyük hacimli TruTip prosedürü ile işlenen bir havuza anne plazma örneği, sekiz tekrar örnekleri alınan gerçek zamanlı sonuçları Şekil 7 'de gösterilmiştir. Tam protokolü (off-line proteinaz K kuluçka dahil) Nükleik Asitler Kiti (hiçbir karşılaştırılabilir otomatik ekstraksiyon kitleri henüz mevcut) Sirkülasyon Qiagen manuel benzer yaklaşık 2.5 saat, bitti. Tüm çoğaltır boyunca ortalama C t değerleri 34.58 ± 0.66 ve 29.76 ± fetal erkek (CHY) ve toplam (CH1) DNA için 0.50, sırasıyla, otomatik ekstraksiyon yöntemi mükemmel tekrarlanabilirlik göstermektedir vardır. Toplam DNA havuzu (genom benzeri) içinde fetal DNA konsantrasyonu, 2.8% tüm örnekleri arasında ortaya çıkan ortalama% fetal DNA ile, standartlara uygun noktası analizi karşılaştırma esas alınarak hesaplanır. Örnekleri çıkarma yapmadan önce toplanmış çünkü bu örnek için gerçek% fetal DNA bilinmemektedir. Fetal DNA bileşiminon-plazma örnekleri toplanmış TruTip yöntemi kullanılarak ekstre Qiagen Dolaşım Nükleik Asitler Kiti (gösterilmemiştir) ile sonuçlar ile karşılaştırıldığında, genellikle, 1.5 kat daha yüksektir.
Şekil 1. TruTip çıkarma işlemi ve sıvı taşıma sistemi ne olursa olsun iş akışı,. Diğer numune hazırlama veya sıvı taşıma adımları belirli sıvı taşıma aracı ve yazılım özelliklerine bağlı olarak otomatik rutinleri içine dahil edilebilir.
Şekil 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 örnek plaka düzeni. Reaktif / consuma (B) DüzenlemeepMotion sadece aynı anda 8 numune maksimum işleyecek rağmen Çalışma Tezgahı üzerinde Gide. örnek plaka, 24 örnek (sütunlar 1, 5 ve sırasıyla 9,) 'e kadar yapılandırılabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Tam kan genomik DNA arındırıcı Hamilton YILDIZ güverte düzeni (ölçekli değildir) Güverte Pozisyon 1 = Hamilton 1 ml filtre ipuçları;. 2 = Hamilton 1 ml olmayan filtre ipuçları; 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = giriş kan örneği taşıyıcıları (kan alma tüpleri veya mikrosantrifüj tüpleri); Lizis Tampon F, Etanol için 5-9 = 290 ml reaktif olukları, sırasıyla Tampon J, Yıkama Tampon K ve Elüsyon Tampon A2, yıkayın; 10 = 96 deep iyi Bağlama plaka; 11 de J yıkayın = 96 derin; 13 = 96 derin kuyu Elüsyon plaka,, 14 Nunc 96 derin kuyu Kuluçka plakalı = Hamilton HHS2 ısıtıcı / Shaker; 15 = 50 ml reaktif çukur 12 = 96 derin kuyu K yıkayın proteinaz K. içeren büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Büyük hacimli plazma örnekleri (ölçekli değildir) elde edilen DNA saflaştırılması için Hamilton STARplus güverte düzeni. 8 x 5 mi kanalı ve 8 x 1 ml kanalı (güverte düzeni gösterilmemiştir) ile donatılmıştır. Güverte Pozisyon 1 = Hamilton 4 ml filtre ipuçları; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = kaynak plazma örnekleri, 4 = 50 ml konik tüpler, CN-W1, CN-W2 ve CN-W4 içeren 5 = 120 ml reaktif olukları ReageNTS; 6 proteinaz K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB ve CN-W3 reaktifler içeren = düşük hacimli reaktif olukları; 7 = CN-L1 reaktif içeren 290 ml reaktif çukur; 8 = 290 ml reaktif çukur içeren CN -B1 reaktif; 9 Adım 1 = 96 derin kuyu plakalar, 10 Adım 2 = 96 derin kuyu plakalar, saflaştırılmış, nihai ürün için 11 = örnek taşıyıcılar; 12 = Hamilton 1 ml filtresiz ipuçları; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. (A). Grip virüsü otomatik TruTip çıkarma gerçek zamanlı PCR sonuçları nazofarenks aspirat (NPA) ilave. Giriş NPA hacmi = 100 ul, elüsyon hacmi = 50 ul. Toplam 3 çoğaltmak e ortalamaseyreltme seviyesi ve grip hedef başına 5 ayrı NPA arka (n = 15) xtractions. qPCR daha önce 15 açıklanan test koşullarına LightCycler 480 sistemi üzerinde yapıldı. 12 olumlu NPA örnekleri hiçbir şablon kontrolleri ve otomatik çıkarma prosedürüne tabi serpiştirilmiş zaman (B) Hayır çapraz kontaminasyon tespit edilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
6 Şekil. Rastgele seçilen 10 Bir NanoDrop 1.000 (ThermoFisher) tam kan insan genomik DNA izolasyonu sonuçları. A) UV-Görünür izleri çoğaltır. B)% 1 TruTip saflaştırılmış gDNA agaroz jel. M = Fisher 24 kb Max DNA Merdiven. Lanes 1 - 4 = ~ 100 ng saflaştırılmış gDNA dört rastgele seçilmiş çoğaltır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Serbestçe plazma DNA dolaşımdaki sekiz çoğaltmak TruTip çekimi gerçek zamanlı PCR sonuçları. Yıldız (* veya **) ile gösterilir Örnekleri ayrı günlerde çıkarıldı. CHY erkek fetal DNA rakamlarla ve CH1 toplam DNA mevcut (fetal ve maternal) rakamlarla. QPCR CHY CH1 18 hedefleme deneyleri daha önce yayınlanmış olan LightCycler 480 sistemi (Roche) üzerinde gerçekleştirildi.
TruTip kavramı ve iş akışı sadeliği (Şekil 1) bu kolay, otomatik verimli ve klinik örnek matrisleri, giriş numune hacimleri ve sıvı taşıma sistemleri bir dizi için etkili, adapte olun. Her klinik örnek benzersiz olduğunu, ancak, kabul edilmelidir, ve viskozite sonraki bir, parçacık, mukus, yüzey kirleticiler, mikrobiyal ve / veya insan genetik arka değişir. Klinik örnek kompozisyon ve otomatik bir TruTip örnek hazırlama protokolü kullanım amaçları beklenen değişimler göz önüne alındığında, bu nedenle belirli bir örnek türü için istenen sonuçları elde etmek için bir TruTip prosedürde bazı adımlar değiştirmek gerekli olabilir. Ne olursa olsun örnek türü, ancak, genellikle nükleik asit saflığı ve / veya kurtarma en önemli etkiye sahip TruTip parametreler şunlardır:
Robot kanal kollar için geometri, pipet malzeme ve ek yöntem her araç üreticisi için benzersiz olduğu için, farklı bir TruTip yapı her sıvı taşıma sistemi için gereklidir. TruTip monolit boyutları (çap, kalınlık ve gözenek boyutu) nükleik asit bağlama kapasitesi (ve yıkama verimliliği) ile ilişkili yok, herhangi bir katı-faz ekstraksiyon tekniği için bekleniyor. Kalın (> 4 mm) matrisler büyük hacimli örnekleri ve / için nükleik asit bağlama kapasitesinin artırılması ya da belirli TruTip biçimleri arasında bağlama kapasitesi eşitlemek için 1 ml TruTip içine gömülü olsa da, TruTip kalınlığı ve akış oranları arasında bir değiş tokuş sırasında orada ilk bağlama adımı (ham lizatları varlığında). Bu nedenle, otomatik bir protokolün ilk adımları için daha büyük hacimli pipet uçları içine büyük çaplı yekpare embed bazen avantajlıdır, (örneğin </ Em> büyük hacimli çekimi için 5 ml Hamilton / Akonni TruTips). Sıvı taşıma robot üreticileri tarafından dikte özel TruTip yapılandırmaları göz önüne alındığında, ancak, mutlaka TruTip nükleik asit verimleri farklı üreticilerin, veya farklı TruTip boyutları arasında sıvı taşıma platformlarında aynı olması için beklemeyin.
Normalde steril siteler (örneğin beyin omurilik sıvısı) elde sürece klinik örnekler (tanım olarak) insan genomik DNA önemli miktarda içerir. Diğer uygulamalarda, insan genomik DNA'sı, istenmeyen bir arka (Şekil 5 gibi) temsil etmektedir, bazen insan genomik DNA'sı, (Şekil 6'daki gibi) tercih edilir. Arka plan DNA varlığı, genellikle monolit bağlama kapasitesi aşmayacak numunedeki nükleik asidin toplam miktarının sürece sorun teşkil etmez, arka plan DNA'nın bir taşıyıcı olarak hizmet edebilir, istenen hedef nükleik halindeasit eser miktarda bulunur. Yüksek hacimli plazma çıkarma protokolü (Şekil 7) amacı, olması dışında bulaşıcı hastalık test edilen numune hazırlama amacı benzer anne bir DNA 10-20 kat fazla, mevcudiyetinde (bölünmüş) DNA fetal izole etmektir dizileri derece uyumlu olan ve sadece yüksek derecede spesifik moleküler testleri ve / veya boyut ayrımı ile ayırt edilebilir. Bu durumda, toplam DNA, dolaşımdaki 5 ml TruTip ve daha sonra yüksek molekül ve düşük molekül ağırlıklı DNA fetal yoluyla ayrılır kullanılarak izole edilir bağlama tamponu koşullar değiştirilerek, 1 ml'lik bir TruTip yapışmasından ve elüsyon. Bir silika yekpare kendi bağlanma ve elüsyon özelliklerine göre hedef nükleik asitlerin selektif boyut ayırma ve zenginleştirme zarlar ya da boyut dışlama spin sütunları ile elde göre hareket önemli ölçüde farklı bir moddur. Insan genomik DNA mikrobiyal DNA boyutu ayırma ve zenginleştirme bir olabilirTruTip bağlayıcı ve elüsyon tampon özelleştirme yoluyla gelecekte uygulamalarında ccomplished.
Otomatik protokolleri burada çeşitli klinik örneklerden işlenmesi için TruTip yekpare kendi yarar ve nasıl geniş hacimli ve belirli sıvı taşıma robotlar için adapte edilebilir vurgulamak gösterdi. Aerodinamik yöntemler genellikle diğer otomatik sistemlere göre daha hızlı çıkarma protokolleri neden. TruTip işlemleri otomatik hale getirmek için gerekli olan temel donanım pipet kanal kol kendisi yerine manyetik çubuklar, vakum sistemleri, çünkü TruTip teknoloji basitlik Ancak, aynı zamanda, yeni, otomatik nükleik asit arıtma sistemi satın alma ilgilenenler için bazı maliyet avantajı tanıyor , ya da on-board santrifüjler. Önceden doldurulmuş reaktif plakaları kullanan da alan ve gerekli sarf azaltmak ve çalışma başına verim iki katına çıkarabilir. TruTip protokolleri ile güverte alanı en aza indirmek de entegre gelişmiş olanak sağlar yukarı veya dTruTip ile ownstream otomatik işlemler. Örneğin damıtmak tam kan için Hamilton easyBlood çözümü önemli ölçüde biyo-bankacılık süreçlerini olur otomatik TruTip ekstraksiyon yöntemi ile dahil edilebilir. Bu nükleik asit kantitatif, normalleştirme, PCR set-up, ya da DNA dizi analizi gibi post-çıkarma işlemleri de kolayca büyük sıvı taşıma platformlarda TruTip ile entegre edilmiştir.
Yazarlar bu makalede kullanılan malzemeler üretmek Akonni Biyosistem, Inc çalışanlarıdır.
Bu makalenin Serbest Erişim ve Üretim Akonni Biyosistem, Inc tarafından desteklenmektedir
Bu çalışmanın bölümleri hibe R 44 AI072784 altında Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Kirsten St George, Sara B. Griesemer'ın, Daryl Lamson ve Viral Hastalıklar, Wadsworth Merkezi, sayısal grip virionların ve klinik-doğrulanmış influenza gerçek zamanlı erişim için Sağlık New York Eyaleti Bölümü Laboratuvarı Amy Dean teşekkür PCR.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır