Высокая пропускная способность, автоматизированное извлечение ДНК и РНК из клинических образцов TruTip использованием технологий на общей жидкостной обработки Роботы

Резюме

TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Таким образом, формат подготовки образца совместим с большинством ликвидных инструментов обработки, и могут быть использованы для многих средней и высокой пропускной клинического применения и типов образцов.

Аннотация

TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Геометрия монолита могут быть адаптированы для конкретных наконечники начиная объемом от 1,0 до 5,0 мл. Большой пористостью монолита позволяет вязких или сложные образцы легко проходить через него с минимальными жидкостный противодавления. Двунаправленный поток максимизирует время пребывания между монолитом и образец, и обеспечивает большие объемы образцов, подлежащих обработке в пределах одной TruTip. Основные шаги, независимо от объема образца или TruTip геометрии, включают лизиса клеток, нуклеиновые кислоты связывания с внутренней поры TruTip монолит, смывая несвязанных компонентов образца и лизис буфера, и элюирование очищенного и концентрируют нуклеиновых кислот в соответствующем буфере. Атрибуты и адаптивность TruTip демонстрируются в трех автоматизированных клиническом образце обработки протоколов, использующих epMotion Эппендорф 5070, Гамильтон звезда и STARPLUS жидких роботов обработки, в том числе выделение РНК из носоглотки аспирации, изоляции геномной ДНК из цельной крови и выделения ДНК плода и обогащение из больших объемов материнской плазме (соответственно).

Введение

Очистка нуклеиновых кислот необходимо для большинства молекулярной диагностики, исследований использования, и научных приложений жизни. Различные подходы появились с момента фенол / хлороформом, многие из которых основаны на фундаментальном принципе нуклеиновой кислоты связывания с диоксидом кремния в присутствии хаотропные соли ^1. Процесс экстракции был упрощен и автоматизирован за счет использования различных бисером и мембранные форматов, со спином фильтры, магнитные шарики и связанных с ними подходов доминирующей отрасли науки о жизни (см. примеры в ^2-13). В то время как эффективные, частицы и мембраны известные ограничения при столкновении со сложными клиническими матриц. Например, мембраны и шарик на основе столбцы соответствуют, имеют небольшие размеры пор (таким образом, высокое давление назад), а также требуют некоторого типа поддержки для того, чтобы быть обработана с помощью системы центрифуги или вакуума. Физические характеристики мембран и шарик результате столбцовзначительного жидкостного сопротивление, которое ограничивает тип образцов, которые могут быть эффективно обработаны без засорения расходные, и / или общее (вход) объем образца, который может быть одно-направленно обрабатываются через пути потока. С другой стороны, магнитные частицы должны быть распределены по всему образцу при перемешивании. Необходимость гомогенно распределять магнитные частицы в растворе ограничивает объем входной выборки, которые могут быть обработаны с наиболее магнитный валик расходных материалов. Клинические признаки образца (такие как вязкость и сложности) может привести к неэффективному концентрации магнитных частиц на стороне трубки или стержня. Кроме того, мелкие частицы кремнезема может разорвать из бисера в процессе извлечения, теряя свою намагниченность и загрязнения конечного образца.

Технологии TruTip была разработана для преодоления некоторых из этих нуклеиновых кислот обработки образцов ограничений и ограничений ^14. По вложения пористый монолит впипетки, жидкостный противодавление снижается, что позволяет управление потоком с помощью вакуума (т.е. стремление пипетки). Эта функция позволяет процесс добычи и Инструменты требующегося, чтобы очистить нуклеиновых кислот из сложных видов образцов значительно упростить (рис. 1). Геометрии и пористость монолита предназначена для минимизации засорения, а толщина монолита обеспечивает достаточную нуклеиновой кислоты связывающей способности для образца объемом от 1,0 до 5,0 мл. Двунаправленный поток во время аспирации и дозирования образца позволяет в течение длительного времени пребывания между экстрактом образца и связывания монолит для эффективного восстановления нуклеиновые кислоты и элюирования и обеспечивает относительно большие объемы образцов, подлежащих обработке, которые превышают объем емкости наконечник пипетки непосредственно. Ранее мы сообщили о разработке и применении процедуры ручной очистки TruTip гриппа РНК из носоглотки образцов с использованием одно-или многоканальные Райнин пипетки ^15. Эквивалентная эффективность добычи были получены между автоматизированными QIAcube и методы руководства TruTip 10 ⁶ копий генов гриппа на мл аспирата носоглотки. Целью данного исследования было продемонстрировать средней и высокой пропускной способностью, автоматизированные TruTip нуклеиновой кислоты процедур очистки носоглотки аспирация (НПД) и других клинически значимых типов образцов, с использованием жидких роботов обработки обычно встречаются в ссылки клинических лабораторий.

протокол

Три автоматизированные протоколы добычи TruTip описаны и продемонстрированы здесь: 1) средней пропускной РНК из NPA на Эппендорф epMotion 5070, 2) высокой пропускной геномной ДНК из низких объемов цельной крови на Гамильтон звезду и 3) селективного выделения и обогащение фрагментированной ДНК плода из больших объемов плазмы на материнской STARPLUS Гамильтон. Автоматизированные сценарии можно получить Akonni и только высокого уровня дескрипторов программы приведены здесь. Добычи и элюирование реагенты автоматически освобождается от объемной желоба реагента 96-луночных планшетах в автоматизированный сценарий (ов) до клинических образцов, будут обработаны.

1. Автоматизированное извлечение РНК из носоглотки Aspirate

Описанный выше метод ручной TruTip ¹⁵ теперь адаптированы для работы на Эппендорф epMotion 5070 обработки жидкого робота, используя большой матрицы TruTip пор встроенные в 1,0 мл Eppendorf трубыTTE советов, 2 мл артезианской пластины (США Scientific), Akonni реагентов TruTip экстракции и НПД в качестве образца типа. EpMotion 5070 жидкого робота обработки вмещает до 8 советов одновременно, так базовый автоматизированный протокол описан, 8 параллельных экстракции. Тем не менее, до 24 образцов могут быть обработаны в течение одной программы в одном глубоких скважин 96-луночных образец пластины. Отдельная программа epMotion доступен (и обязательно), чтобы обработать 16 или 24 образцах. Протокол общих чертах изложенный ниже для 8 образцов автоматизированный сценарий.

Установка

1. Принесите носоглотки образцы до комнатной температуры перед началом добычи.
2. Внесите 100 мкл носоглотки аспирате плюс 150 мкл нуклеазы без воды в колонну 1 образца пластину (рис. 2А).
3. Поместите образец пластины в положении B1 на epMotion Рабочий стол (рис. 2В).
4. Место наконечники, TruTips и 30 мл реагента желоба на соответствующие Worktab epMotionле положений (фиг. 2В).
5. Откройте программу Эппендорф epBlue, выберите Run файлом, предоставленным Akonni для 8 образцов, и загрузить, нажав метода кнопку Выполнить на вкладке Выполнение.
6. В разделе Параметры датчика уровня, выберите Уровни и советы, и нажать кнопку Выполнить.
7. Введите объем образца в программное обеспечение и выберите пункт Выполнить.
8. EpMotion скрипт будет предлагать пользователю добавить добычи и элюирования реагентов Реагент водоемов, расположенных на позицию B2 на рабочем столе. Добавить рекомендуемые объемы каждого реагента в соответствующие желоба. Для 8 образцов, минимальные объемы реагента:

Реагент	Объем (мл)	Желоб позиция
95% этанола	3,5	2
Промывочного буфера D	9,0	3
Промывочного буфера E	9,0	4
Буфера для элюции A2	1,3	5
Лизиса и связывающего буфера D	11,0	6

9. Введите объемы реагента в таблице представлены epMotion программного обеспечения во время приглашения не шаге 8 выше. Входное значение должно отражать фактический объем буфера обойтись пользователем в каждом соответствующем резервуаре реагента и должно быть больше или равно минимальному объемах, указанных выше. Неправильное записи объем может привести к неправильному объемы выступил epMotion аппаратных в каждую пробирку или же в 96-луночный планшет (ы).

Автоматизированная программа

10. Выберите Выполнить, чтобы начать автоматизированный метод. Автоматизированный сценарий будет двигаться через следующие шаги без вмешательства пользователя:
    Лизиса пробы и реагента распространения:
    1. Внесите 375 мкл буфера для лизиса D в колонну 1 и перемешивать в течение 10циклов (+ apirate обойтись = 1 цикл). Этот шаг запускает процесс лизиса инкубации а остальные реагенты аликвоты.
    2. Внесите 1,6 мл промывочного буфера D в колонке 2.
    3. Внесите 1,6 мл промывочного буфера E в колонке 3.
    4. Добавьте 50 мкл буфера для элюции в колонке 4.
    5. Пауза в течение 6 минут, чтобы завершить 10 мин инкубации образца в лизирующего буфера D.
    6. Добавить 375 мкл этанола в каждую лунку в колонке 1, смешивания каждого образца с помощью этанола через 10 пипетки циклов.
    Добыча:
    7. Загрузите 8 TruTips из положения A2 на рабочем столе, и начать процесс извлечения указаны на рисунке 1.
    8. Аспирируйте и обойтись образец / буфера для лизиса / этанол из колонки 1 образца пластины в течение семи циклов для связывания нуклеиновой кислоты TruTip монолит. Хотя не образец потока через TruTip могут отличаться (из-за различий в клинических вязкость образца), нуклеиновые кислоты выход для этих образцов было никакихT затронуты изменение расхода. Варианты улучшения потока пробы описаны в обсуждении.
    9. Переместить TruTips к образцу пластины колонке 2, и цикл промывочного буфера D 5x над монолитом для удаления остатков буфера для лизиса и матрицы пробы.
    10. Перемещение TruTips к образцу тарельчатой ​​колонне 3, а цикл промывочного буфера E 5x на монолит для удаления белков и других загрязняющих веществ из связанного нуклеиновой кислоты.
    11. Переместить TruTips в пустую позицию резервуаром реагента 1 (в Worktable B2 местоположения) и цикл 80x (с высокой скоростью потока), чтобы высушить монолит. Важно тщательно высушить TruTip, как остаточных растворителей в элюированных препаратов нуклеиновых кислот отрицательно скажется на ферменты, такие как обратную транскриптазу и Taq ДНК-полимеразы.
    12. Переместить TruTips к образцу пластина 4 колонки и в цикле 5x буфера элюирования А. Выделение и очистка нуклеиновых кислот в настоящее время в буфер для элюции образца в колонке 4 пластины скважин.
    13. Извлеките TruTips в мусорное ведро отходов epMotion.
    14. Когда программа закончится, вручную удалить образца пластины из прибора и передача очищенной нуклеиновой кислоты в новые пробирки для долгосрочного хранения или дальнейшего использования. Опытные пользователи epMotion можете добавить инструкции Run файл для передачи Элюированную образцов в отдельные пробирки хранения или ПЦР планшеты, если это необходимо.

Программа для 16 общего количества образцов будет повторить шаги через 10,1 10,13 использованием колонки образца пластины 5-8. Для 24-пример программы, шаги через 10,1 10,13 повторяются 2x использованием образца пластины столбцы 5-8 и 9-12 соответственно.

2. 96-луночные геномной выделения ДНК из цельной крови

Гамильтона СТАР жидкого робота обработки используется для демонстрации автоматизированное извлечение из 96 образцов одновременно из цельной крови. Гамильтона СТАР отличается от epMotion системы в том, что факультативный обогревателя / шейкер Устройство доступно на палубе, что важно для ферментативного расщепления определенных клиническихкал матриц, например цельной крови. Поскольку система может быть оснащена 96-канальным головка пипетки, существует выделенный 96-луночный планшет для каждого из TruTip стадий и реагентов.

Установка

1. Включите инструмент звезда и компьютер.
2. Откройте панель управления Гамильтон запуска программного обеспечения.
3. Откройте файл Run предоставляемые Akonni для 96 образцов.
4. Место лабораторное оборудование на звезду палубе, как показано на рисунке 3.
5. Внесите реагентов в соответствующие желоба (объемы обозначить минимальные требования для обработки 96 образцов):

Реагент	Объем (мл)	Желоб позиция
Лизиса и связывающего буфера F	75	5
95% этанола	100	6
Промывочного буфера J	175	7
МытьБуфер K	175	8
Буфера для элюции A2	12	9
Протеиназы К (20 мг мл-1)	8	15

6. Разрешить образцы для уравновешивания до комнатной температуры.

7. Поместить пробирки в носитель образца стойки (палуба положении 4 на рисунке 3). Поместите образец 1 в задней части дальнем левом носителя и последовательно двигаться вниз каждого оператора Пример 96 окончание в переднее правое положение.

Автоматизированная программа

8. Выберите кнопку воспроизведения в верхней левой части окна Запустить файл и введите число образцов обрабатывается. Автоматизированный сценарий будет двигаться через следующие шаги без вмешательства пользователя:
   Лизиса пробы и реагента Распределение
   1. Передача 200 мкл из каждой пробирки в инкубационную пластины в положении 14 на онВодный / шейкер модуль (рис. 3).
   2. Внесите 80 мкл протеиназы К в каждую лунку с образцом инкубационного пластины.
   3. Распределить 600 мкл буфера для лизиса F в каждую лунку инкубации пластины.
   4. Смешайте раствор в течение 10 циклов, а затем инкубировали в течение 20 мин при 70 ° С и 500 оборотах в минуту. 70 ° C заданной температуры приводит к ~ 60 ° C Температура образца в глубоком луночный планшет, который находится в пределах диапазона активности протеиназы К. В то время как образцы инкубации, жидкость системы обработки продолжается на операционной дозирования реагентов в соответствующие пластины и скважин:
      • 100 мкл буфера для элюции в каждую лунку глубоко луночный планшет в положении 13.
      • 800 мкл этанола в каждую лунку глубокий колодец пластину в положении 10.
      • 1,6 мл промывочного буфера K в каждую лунку глубокий колодец пластину в положении 12.
      • 1,6 мл промывочного буфера J в каждую лунку глубокий колодец пластину в положении 11.
   5. После 20 мин инкубации образца смесь переносят из инкубационной пластина для глубокого луночный планшет в положении 10 и смешивают до 12 пипетки циклов.
   6. Извлеките реагента советы в мусорное ведро.
      Добыча
      Эта часть процедуры крови гДНК очень похож на протокол гриппа epMotion, за исключением состава для стирки реагентов и цикл номеров. Гамильтон TruTips советы черные, так что поток жидкости через TruTip не видно.
   7. Загрузите 96 TruTips от палубы положение 3.
   8. Аспирируйте и обойтись образца / буфер для лизиса / этанол в положении 10 в течение 10 циклов связывать нуклеиновых кислот TruTip монолит.
   9. Переместить TruTips в положение 11 и цикл промывочного буфера J 5x над монолитом для удаления остатков буфера для лизиса и матрицы пробы.
   10. Перемещение TruTips в положение 12, и цикл промывочного буфера K 5x для удаления белков и других загрязняющих веществ из связанного нуклеиновой кислоты.
   11. Цикл TruTip 40x на высокой скорости высохнуть на воздухе.
   12. Переместить TruTips в положение 13 и в цикле 5x буфера элюирования A2. Выделение и очистка нуклеиновых кислот в настоящее время в элюирующего буфера в глубоком луночный планшет.
   13. Извлеките TruTips в мусорное ведро.

Когда программа закончится, удалите Элюированием Тарелка из прибора и передачи извлеченных образцов в соответствующие пробирки для хранения или последующих применений.

3. Выделения ДНК из образцов Большой объем плазмы

Прибор Hamilton STARPLUS используется для демонстрации автоматизированный протокол для извлечения свободно циркулирующей ДНК плода из 5 мл плазме матери. STARPLUS система может поддерживать два автоматизированных пипетки канала руки, одна с 8 х 5 мл каналов и один с 8 х 1 мл каналов. Это оружие могут работать параллельно для шахматных партий в обработку 8 образцов каждая. 5 мл TruTip используется для начального лArge объема добычи, и 1 мл TruTip используется для разделения размер и дальнейшей концентрации извлеченную нуклеиновую кислоту.

Настройка

1. Включите STARPLUS приборостроения и информатики.
2. Откройте панель управления Гамильтон запуска программного обеспечения.
3. Откройте файл Run предоставляемые Akonni на 8 больших выборках объема плазмы.
4. Место лабораторное оборудование на STARPLUS палубе, как показано на рисунке 4.
5. Не включать реагенты в соответствующие резервуары:

Реагент	Объем (мл)	Желоб позиция
CN-W1	17	5А
CN-W2	17	5B
CN-W4	21	5C
Протеиназы К (20 мг мл-1)	5	6А
Самого высшего качества	17	6B
EBA2	5	6C
CN-W3	5	6D
CN-B2	5	6E
CN-B3	5	6F
CN-L1	52	7
CN-B1	175	8

6. Разрешить образец для уравновешивания до комнатной температуры.
7. Поместить пробирки в носитель образца стойки (палуба положение 3 на рисунке 4). Место Образец 1 в задней и последовательно перемещать по направлению к передней палубе.

Автоматизированная программа

Из-за большого объема образца ввод, лизис и гомогенизации шаги должны быть выполнены вне прибора Hamilton STARPLUS в ванну с водой. Шаги, требующие вмешательства пользователя в автоматизированный протокол обозначены звездочкой (*) в beginninг предложении, и жирным шрифтом.

Лизирующего реагента и образца распространения: образец инкубируют с протеиназы К и лизирующего буфера для гомогенизации образца и освободить ДНК.

8. Выберите кнопку воспроизведения в верхней левой части окна файл Run. Входной количество образцов обрабатывается, расположение пипеток на палубе, и расположение TruTips на палубе.
9. Автоматизированный сценарий добавляет 615 мкл протеиназы К, 5 мл плазмы и 6,2 мл буфера для лизиса CN-L1 для каждого 50 мл коническую трубку, и затем будет паузы.
10. * Удаление 50 мл конические пробирки с образцом палубе, вихрь в течение 30 сек на высокой скорости, и инкубируют автономно в течение 30 мин при 60 ° С в водяной бане или в нагревательном блоке. После того, как конические пробирки удаляются из колоды Гамильтон, РЕЗЮМЕ автоматизированный сценарий для продолжения дозирования реагентов в их соответствующих пластин и скважины (фиг.4В и 4С):
    • 2 мл CN-W1 каждого друга в положении 9 колонке 1.
    • 2 мл CN-W2 каждого друга в положении 9 колонке 2.
    • 2 мл CN-W4 каждого друга в положении 9 колонке 3.
    • 250 мкл EBA2 каждому друга в положении 9 графы 4 и 5.
    • 495 мкл CN-B2 с любой другой и в положении 10 колонны 1.
    • 1 мл EBB каждого друга в положении 10 колонке 2.
    • 500 мкл CN-W3 с любой другой хорошо в положении 10 колонки 3.
    • 500 мкл CN-W4 каждого друга в положении 10 колонке 4.
    • 50 мкл EBA2 каждому друга в положении 10 графе 5.

Поскольку каналы 5 мл слишком широки, чтобы использовать соседние скважины для каждого образца, автоматизированная программа обходится реагентов в любой другой хорошо глубокого луночный планшет в деке положение 9. Механическую руку, используемых для каналов 1 мл также требует использования любого другого хорошо реагент пластины для изоляции и концентрация-йEPS протокола.

После дозирования реагентов, Программа обеспечит паузу.

11. * После 30 мин, 60 ° C Инкубационный, место 50 мл конические пробирки во льду в течение 5 мин.
12. * Возвращает 50 мл конические пробирки на исходные позиции в стойке для пробы на палубе 4 позиции, и возобновить автоматизированный сценарий.
13. Добавить 12 мл буфера для связывания CN-B1 до каждой пробирки и смешивают 10x.

Большой объем добычи: 5 мл TruTips используются для извлечения общей ДНК из лизированных образцов плазмы.

14. Возьмите 5 мл TruTips из положения 2 для больших объемов выделения нуклеиновых кислот.
15. Цикл образца mixture15 раза в 50 мл коническую трубку, начиная с нижней части трубы и перемещение 3 мм выше, после каждого цикла пипетки. Этот шаг связывается общей нуклеиновой кислоты TruTip монолит.
16. Переместить TruTips к глубокими лунками в положении 6 колонка 1, и CYCLE 1x в промывочный буфер CN-W1.
17. Переместить TruTips в положение 9 колонке 2 и цикл 1x в Wash CN-W2.
18. Переместить TruTips в положение 9 и 3 колонки 2x в цикле стирки CN-W4.
19. Перемещение TruTips в положение 9 4 столбцов и цикл 40x на высокой скорости, чтобы высушить связывания матрицы.
20. Переместить TruTips в положение 9 графе 5 и цикл 10x для элюирования связанного нуклеиновых кислот из 5 TruTips мл. Это большой объем элюирования № 1.
21. Перемещение TruTips в колонку 6 и повторяют шаг со второй аликвоте буфера для элюции. Это большой объем элюирования № 2.
22. Передача элюирования № 2 в положение 9 колонка 5 сочетать его с элюирования № 1, и отбросить TruTips.

Исключение и Концентрация: ДНК с высоким молекулярным весом удаляется из извлеченного образца, а остальные ДНК выделяют и концентрируют.

23. Добавить в сочетании элюента с шага 22 в положение 10 колонки 1 и тщательно перемешать 10x.
24. Возьмите 1 мл TruTiPS с позиции 13 и 20-кратным циклом связывать ДНК с высоким молекулярным весом в монолит.
25. Переместить TruTips установить на 10 и 2 колонки цикла 5x для полоскания наконечником и удалить ДНК с высоким молекулярным весом. TruTips сохраняются и помещен обратно в кончик стойки в положении 13.
26. С реагента советов от позиции 12, добавьте 575 мкл буфера для связывания CN-B3 на образец в положении 10 колонки 1 и перемешать 10x.
27. Возьмите TruTips с шага 25, возвращают в положение 10 колонки 1 и цикл 20x связывать остальные ДНК из образца в 1 мл TruTip.
28. Переместить TruTips установить на 10 колонки 4 и 1x в цикле стирки CN-W3, чтобы удалить оставшиеся ингибиторов.
29. Переместить TruTips установить на 10 и 5 колонок 1x в цикле стирки CN-W4 для полоскания остаточных солей из CN-W3.
30. Поднимите TruTips более 10 позиций графе 5 и циклом воздуха через советы 35x для сушки монолит.
31. Переместить TruTips установить на 10 графы 6 и цикл 10x в EBA2 для элюирования очищенный, размер-отборTed и концентрированной нуклеиновой кислоты.
32. Откажитесь TruTips.
33. Передача элюированной пробы из колонки 6 до 1,5 мл пробирки в положении 11. Извлеченные образцы были готовы для хранения или последующей обработки.

Результаты

ПЦР в реальном времени данных для гриппа РНК из NPA показаны на рисунке 5А. Оценка эффективности экстракции нуклеиновой кислоты аналогично результатам, полученным с ручным версии протокола ^15. Линейный отклик в среднем C значений _т наблюдается между 10 ⁴ и 10 ⁶ копий гена мл ^-1 поправки гриппа (R ₂ = 0,99 и 0,98 гриппа А и В, соответственно), со стандартным отклонением в среднем C _т значений менее 1 цикла. Отсутствие перекрестного загрязнения с epMotion системы показано на рисунке 5В, где 12 положительных образцов NPA, содержащий 10 ⁶ копий гена мл ^-1 NPA чередовались с буфером из 12 заготовок. Средняя C _T для положительного контроля был 30,16 ± 0,14, а все пробелы буфера были отрицательными. Общее время обработки образца 16, 28 и 40 мин в течение 8, 16 и 24 образцов соответственно.Потому что типичная клиническая носоглотки аспирата или тампон будет состоять из 10 ⁷ копий гена мл ^-1 (при условии, 1000 вирионов в TCID ¹⁶ и _50> 10 ⁴ TCID ₅₀ мл ^-1 гриппа ^17), автоматизированный протокол epMotion как ожидается, будет эффективным на большинстве клинических образцов NPA.

Учитывая диапазон молекулярных испытаний, выполненных на геномной ДНК человека, основной целью выделения нуклеиновых кислот из цельной крови является производство содержащем вредных веществ высокой молекулярной геномной ДНК веса. Автоматизированный протокол для 96 образцов завершается в течение 1 ч, что является улучшением по сравнению с другими автоматизированными системами (например, Promega MagneSil = 90 мин и Qiagen QIAamp ДНК крови BioRobot MDx система = 2,5 ч). Фиг.6А показан UV / Vis поглощение профили 45 положительных образцов крови обрабатываются одновременно с 45 реагента пустые графы в протоколе Гамильтона СТАР, в среднем _{260/280 Отношение 1,96 и средней 260/230 отношением 1,93. 260/280 соотношение между 1,7-2,0 и 260/230 соотношение> 1,7, как правило, свидетельствует о очень чистой ДНК, свободный от остаточных солей, белков или растворители и приемлемо для большинства приложений молекулярной вниз. 1% агарозном геле на Фиг.6В показывает, что в результате гДНК является высокой молекулярной массы (> 24 кб), с минимальным сдвига. Средний выход нуклеиновых кислот из полного набора 45 положительных образцов 5,26 ± 0,46 мкг ДНК человека в 200 мкл цельной крови, основанный на Quantifiler Life Technologies человека Kit Количественное ДНК. Перекрестное загрязнение исследования, аналогичные показанным на фиг.5В проводили с отрицательным контролем буфер заготовки перемежаются с положительных образцов и экстрагируют параллельно, и все заготовки снова были отрицательными методом ПЦР (не показано). Очищенный гДНК также подходит для многих других ПЦР-анализа (не показан).}

Результаты в реальном времени из восьми одинаковых образцов с пулом материнской образца плазмы обрабатывается с большим объемом TruTip процедуре, показано на рисунке 7. Полный протокол (в том числе автономно инкубации протеиназы К) завершена примерно 2,5 часа, похожие на Qiagen ручной Циркуляционный Нуклеиновые Кислоты Kit (не сопоставимы автоматизированные наборы извлечение пока недоступны). Среднее значение C _T по всем повторяет являются 34,58 ± 0,66 и 29,76 ± 0,50 для мужчин плода (CHY) и общего (CH1) ДНК, соответственно, что демонстрирует отличную повторяемость автоматизированного метода экстракции. Концентрацию ДНК плода в общий пул ДНК (в геном эквивалентов), вычисляется на основе нужным сравнительный анализ указывает на стандартам, в результате средняя% плодной ДНК всех образцов на 2,8%. Фактический% фетальной ДНК для этого образца неизвестна, так как образцы объединяли перед проведением экстракции. Плод состав ДНКВ не-объединенных образцов плазмы экстрагировали с использованием TruTip метод, как правило, в 1,5 раза выше по сравнению с результатами с Qiagen Циркуляционный Нуклеиновые Кислоты Kit (не показан).

Рисунок 1. Процесс TruTip добычи и рабочего потока, независимо от жидкостной системы управления. Другие пробоподготовки или жидкого шагов обработки могут быть включены в автоматизированных процедур в зависимости от возможностей конкретного жидкость инструмент обработки и программное обеспечение.

Рисунок 2. (A) Эппендорф epMotion 5070 образца пластины макета. (B) Организация реагенты / ConsumaБлес на рабочем столе. образца пластины можно настроить до 24 образцов (столбцы 1, 5 и 9 соответственно), хотя epMotion будет обрабатывать не более 8 образцов одновременно. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Гамильтона СТАР палубе макета для очистки геномной ДНК из цельной крови (не в масштабе) Палуба Ступень 1 = Гамильтон 1 мл фильтруется советов;. 2 = Гамильтон 1 мл нефильтрованного советов; 3 = Akonni / Гамильтон 1 мл LPT 2 мм TruTips; 4 = вход крови носителей (сбора крови труб или труб микроцентрифужные); 5-9 = 290 мл реагента корыта для буфера для лизиса F, этанол, промывочного буфера J, K промывочного буфера и буфера для элюции A2 соответственно, 10 = 96 DЕЭП также Планшеты для связывания, 11 = 96 глубоких хорошо моются J, 12 = 96 глубоких хорошо моются К, 13 = 96 глубоких скважин элюирования пластину; 14 = Гамильтон HHS2 нагреватель / шейкер с Nunc 96 глубоких скважин пластины инкубации; 15 = 50 мл реагента корыта содержащего протеиназы К. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Hamilton STARPLUS палубе макета для очистки ДНК из большой объем образцов плазмы (не в масштабе). Система оснащена 8 × 5 мл каналов и 8 х 1 мл каналы (не показаны на палубе раскладки). Палуба Ступень 1 = Гамильтон 4 мл фильтруется советов, 2 = Akonni / Гамильтон 5 мл TruTips; 3 = образцов плазменного источника, 4 = 50 мл конические пробирки, 5 = 120 мл реагента желоба содержащие CN-W1, W2 CN-и CN-W4 reageНТС, 6 = низкого объема реагента желоба содержащего протеиназы К, CN-B2, CN-B3, EBA2, приливы и CN-W3 реагентов; 7 = 290 мл реагента корыта содержащие CN-L1 реагента, 8 = 290 мл реагента корыта содержащие CN Реагент-B1; 9 = 96 глубокими лунками для шага 1, 10 = 96 глубокими лунками на шаге 2, 11 = образца носителей для очищенных, конечный продукт; 12 = Гамильтон 1 мл нефильтрованного советы; 13 = Akonni / Гамильтон 1 мл LPT 4 мм TruTips. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 5. (A). ПЦР в реальном времени результаты автоматизированное извлечение TruTip гриппа вирус, добавленный в носоглоточной аспирации (ННА). Входной NPA объем = 100 мкл, объем элюирования = 50 мкл. Результаты являются средними из 3 повторных электроннойxtractions из 5 различных фонов NPA (N = 15) за уровень разбавления и гриппа цель. кПЦР проводили на LightCycler 480 система с анализа условий, описанных ранее ^15. (B) Нет перекрестного загрязнения не обнаружен, когда 12 положительных образцов NPA перемежаются с не шаблонные элементы управления и в соответствии с автоматизированной процедуры экстракции. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6. Результаты человеческой геномной экстракции ДНК из цельной крови.) УФ-видимый след от NanoDrop 1000 (ThermoFisher) из 10 случайно выбранных репликации. B) 1%-ном агарозном геле TruTip очищенный гДНК. M = 24 Кб Фишер Max DН.А. лестнице. Дорожки 1 - 4 = ~ 100 нг очищенного гДНК из четырех выбранных случайным образом повторяет. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 7. ПЦР в реальном времени результатов из восьми повторных TruTip экстракции ДНК свободно циркулирует из плазмы. Образцы отмечены звездочкой (* или **) экстрагировали в отдельные дни. CHY количественно мужской ДНК плода и CH1 количественно общее данной ДНК (матери и плода). количественной ПЦР проводили на 480 системы LightCycler (Roche) с ранее опубликованными анализов ориентации CHY и CH1 ^18.

Обсуждение

Простота концепции TruTip и рабочий процесс (рис. 1) сделать его легко адаптировать, автоматизировать, эффективной и действенной для ряда клинических образцов матриц, объемы входной выборки, и жидких систем обработки. Следует признать, однако, что каждый клинический образец является уникальным, и будет меняться одного к другому в вязкости, частиц, слизи, поверхностных загрязнений, микробного и / или человеческого генетического фона. Учитывая ожидаемые изменения в области клинической состав образца и предполагаемое использование автоматизированный протокол пробоподготовки TruTip, поэтому может возникнуть необходимость в изменении определенные шаги в TruTip процедуры для достижения желаемых результатов для определенного типа образца. Независимо от типа образца, однако, TruTip параметров, которые обычно имеют наибольшее влияние на чистоту нуклеиновых кислот и / или восстановления включают:

1. Пример перемешивания и гомогенизации буфером для лизиса (и алкоголя). TruTips Хотя есть повторноlatively большой размер пор, образец гомогенизации и сжижение очень важно для эффективного лизиса клеток и последующее связывание шага к TruTip монолит. С однородным и хорошо сжиженный лизата, образцы могут перемещаться по TruTip с более высокие скорости потока, что снижает общее время обработки образца. Большой объем плазмы протокол демонстрирует потенциал для пользователей, чтобы тщательно гомогенизации и сжижению трудно образцов (он-лайн или в автономном режиме), несмотря на большой объем входной выборки.
2. Расход. Более медленные темпы потока во время связывания нуклеиновых кислот или элюирования обычно приводят к более высоким выходом нуклеиновых кислот, хотя и за счет общего времени обработки. Более медленные темпы потока может также уменьшить степень ДНК стрижки.
3. Цикл чисел. Оптимальное количество и отказаться от стремления циклов зависит от типа образца, общий объем образца, и скорость потока. Шаг 1 на рисунке 1, как правило, точка, в которой цикл NumbeРТС (и скорости потока) может потребовать некоторых эмпирических оптимизации с образцов, таких как носоглоточной аспирации (рис. 5) представляет собой один из наиболее сложных лизатов оптимизировать за счет диапазоне вязкости ОПН из разных пациентов.
4. Сушка. Полное высыхание TruTip монолит является необходимым условием предотвращения остаточных органических растворителей из совместного элюированием смесью очищенного образца нуклеиновой кислоты и ингибирования последующих процессов или испытаний. Поскольку TruTip не сушится с помощью центрифугирования или вакуумной фильтрации, важно, чтобы максимизировать как скорость потока и цикл номера во время стадии сушки. Иногда возникают остаточные капли промывочного раствора на конец TruTip после цикла сушки будут завершены. Hamilton робот имеет возможность выполнить "кончик касание" на стороне скважины, чтобы освободить капли, тем самым обеспечивая растворителей элюирования. EpMotion системы не имеют этой функции, но предварительной промывки из TruTip концом в Эль-ution буфер может быть запрограммирован для достижения такого же эффекта.

Поскольку геометрия, пипетки материала и способа крепления к роботизированных рук канала являются уникальными для каждого изготовителя прибора, различные конструкции TruTip требуется для каждой системы обработки жидкости. TruTip монолит размеры (диаметр, толщина и размер пор) коррелируют с нуклеиновой кислотой, связывающую способность (при элюировании эффективности), как ожидается для любого твердофазной экстракции техники. В то время как толстый (> 4 мм) матрицы могут быть встроены в 1 мл TruTip увеличить нуклеиновой кислоты связывающей способности для больших объемов образцов и / или выравнивания способность к связыванию через специальные форматы TruTip, существует компромисс между толщиной TruTip и скорости потока при начальные стадии связывания (в присутствии сырой лизатов). Таким образом, иногда выгодно, чтобы встроить большего диаметра монолитов в больших объемах наконечники на начальных этапах автоматизированного протокола, (например, </ EM> Гамильтон 5 мл / Akonni TruTips для больших объемов экстракции). С учетом конкретных конфигураций TruTip продиктовано производителей жидкость роботов обработки, однако, не обязательно ожидать TruTip нуклеиновые кислоты выход идентичными через жидкость платформы обработки различных производителей или разных размеров TruTip.

Клинических образцов (по определению) будет содержать значительное количество геномной ДНК человека, если они не получены из стерильных в норме сайтов (например, спинномозговой жидкости). Иногда геномной ДНК человека нужен (как показано на рисунке 6), тогда как в других приложениях ДНК человека представляет собой нежелательный фон геномной (как рисунок 5). Присутствии фонового ДНК, как правило, не является проблемой, пока общее количество нуклеиновой кислоты в образце, не превышает способность к связыванию монолита, а фон ДНК может служить в качестве носителя, если желаемый целевой нуклеиновойкислота присутствует в следовых количествах. Целью большого объема плазмы протокола экстракции (рис. 7), чтобы изолировать (фрагментированные) ДНК плода в присутствии 10-20 кратного избытка материнской ДНК, которая похожа на цель пробоподготовки инфекционных заболеваний Тесты исключением того, что последовательностей очень конгруэнтно и может быть отличаются высокой специфичностью молекулярного тестирования и / или размер дискриминации. В этом случае общий циркулирующей ДНК выделяли с использованием 5 мл TruTip и последующее высокомолекулярный и низкомолекулярный ДНК плода разделены посредством последующего связывания и элюирования 1 мл TruTip, изменяя условия связывания буфера. Селективное разделение размер и обогащение нуклеиновых кислот-мишеней на основе их связывание и элюирование свойства монолита, является существенно различным механизмом действия, чем достигается за счет мембраны или размер колонки исключение спина. Разделение Размер и обогащение микробной ДНК из геномной ДНК человека может бытьccomplished в будущих приложений через настройки связывания TruTip и элюирования буферов.

Автоматизированные протоколы продемонстрировали здесь подчеркнуть полезность TruTip монолит сам для обработки разнообразных клинических образцов, и как она может быть адаптирована для больших объемов и конкретных жидких роботов обращения. Обтекаемый методы обычно приводят к более быстрому добычи протоколов по сравнению с другими автоматизированными системами. Простота TruTip технологии, однако, также предоставляет некоторые преимущества в стоимости для тех, кто заинтересован в покупке нового, автоматизированная система очистки нуклеиновых кислот, так как основной аппаратных средств, необходимых для автоматизации процедур TruTip пипетки руку сам канал, а не магнитные стержни, вакуумные системы или бортовой центрифуги. Используя предварительно заполненные пластинами реагента может также уменьшить пространство и необходимые расходные материалы, и в два раза пропускную за один запуск. Минимизация палубе пространство с протоколами TruTip также предоставляет продвинутым пользователям возможность интегрировать выше или Downstream автоматизированных процессов с TruTip. Например easyBlood решение Гамильтона для фракционирования цельной крови могут быть включены с автоматизированным способом экстракции TruTip, что значительно упрощать био-банковских процессов. Постэкстракционный процессами, такими как нуклеиновые кислоты количественно, нормализация, ПЦР установка, или секвенирование ДНК также легко интегрируется с TruTip на больших платформах наливных.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-11120
95% Ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
99% Acetone	Sigma-Aldrich	270725-4L
DEPC-treated water	Life Technologies	AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml	Eppendorf	960050100
Deep well plate 96/2,000 μl	USA Scientific	30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl	Eppendorf	960050100
Equipment
epMotion 5070 System	Eppendorf	5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8	960001061
Reservoir rack	960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-20341
95% ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235904
50 ml Reagent Trough	Hamilton Robotics, Inc.	187297
Deep Well 2 ml plate	USA Scientific	1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml	Thermofisher	27874
Reagent Trough	Fisher	14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System	Hamilton Robotics, Inc.	173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173050
1 ml 96-channel head	Hamilton Robotics, Inc.	199090
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
Sample Carriers/Inserts	Hamilton Robotics, Inc.	173400/182238
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
HHS2 Heater Shaker Unit	Hamilton Robotics, Inc.	199033
Rack Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	Call to inquire
100% ethanol	Sigma-Aldrich	459828-1L
Isopropanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC327270010
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
Filtered 4 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	184022
Unfiltered 1 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	235939
96-Deep Well Plates	USA Scientific	1896-2800
50 ml Conical Tubes	Corning/ThermoFisher Scientific	05-526B
50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	187297
120 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs	ThermoFisher Scientific	14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module	Hamilton Robotics, Inc.	173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	184090/173050
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	188047
120 ml Reagent trough carrier	Hamilton Robotics, Inc.	185290
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
50 ml Tube Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182245
24 Position Sample Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	173400
32 Position Sample Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.