Ad alta velocità, l'estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

Riepilogo

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. Conseguentemente, il formato preparazione del campione è compatibile con gli strumenti di manipolazione più liquidi, e può essere utilizzato per molte applicazioni cliniche medio-alto throughput e tipi di campione.

Abstract

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. La geometria del monolite può essere adattato per specifici puntali variano nel volume di 1,0-5,0 ml. La grande porosità del monolite consente campioni viscosi o complessi di passare facilmente attraverso di esso con la minima contropressione fluidico. Flusso bidirezionale massimizza il tempo di permanenza tra il monolito e il campione, e consente grandi volumi di campione da elaborare all'interno di un singolo TruTip. I passi fondamentali, indipendentemente dal volume di campione o geometria TruTip, includono la lisi cellulare, vincolante per i pori interni della TruTip monolite acido nucleico, lavando via i componenti del campione non legato e buffer di lisi e eluizione di acidi nucleici purificati e concentrati in un tampone appropriato. Gli attributi e le capacità di adattamento di TruTip sono dimostrate in tre protocolli di trattamento del campione clinici automatici utilizzando un epMotion Eppendorf 5070, STARPLUS robot di manipolazione dei liquidi, inclusi l'isolamento dell'RNA da aspirato nasofaringeo, estrazione di DNA genomico da sangue intero, e l'estrazione del DNA fetale e arricchimento da grandi volumi di plasma materno (rispettivamente) e Hamilton STAR.

Introduzione

Nucleico purificazione acido è necessario per la diagnostica molecolare più, uso di ricerca, e le applicazioni delle scienze della vita. Vari approcci sono emerse dopo il tempo di fenolo / cloroformio, molte delle quali sono basate sul principio fondamentale di legame alla silice in presenza di sali di acido nucleico caotropici ^1. Il processo di estrazione è stato semplificato e automatizzato attraverso l'uso di vari formati di perline e membrana a base, con filtri rotativi, perline magnetiche e approcci connessi dominano il settore delle scienze della vita (vedi esempi in ^2-13). Mentre efficace, le particelle e le membrane hanno conosciuto limiti quando si confronta con le matrici clinici difficili. Per esempio, le membrane e colonne bead-based sono compliant, hanno piccole dimensioni dei pori (quindi, elevate pressioni di schiena), e richiedere un certo tipo di sostegno al fine di essere trasformati con un sistema di centrifugazione o di vuoto. Le caratteristiche fisiche di membrane e colonne tallone risultato insignificativa resistenza fluida, che limita il tipo di campioni che possono essere elaborati in modo efficiente senza intasare il consumo, e / o il volume totale (input) di esempio che può essere unidirezionalmente elaborati attraverso il percorso di flusso. Viceversa, particelle magnetiche devono essere distribuiti in tutto il campione mediante agitazione. La necessità di distribuire omogeneamente particelle magnetiche all'interno di una soluzione limita il volume del campione totale di ingresso che può essere elaborato con i materiali di consumo di perline più magnetici. Esempio di attributi clinici (quali viscosità o complessità) può portare ad una concentrazione inefficiente particella magnetica sul lato di un tubo o asta. Inoltre, silice polveri sottili possono staccarsi delle perline durante il processo di estrazione, perdendo la loro magnetizzazione e contaminare il campione finale.

La tecnologia TruTip stata sviluppata per superare alcuni di questi vincoli di acido nucleico campione e limiti di lavorazione ^14. Incorporando un monolite poroso all'interno di unpunta di pipetta, fluidico contropressione si abbassa, che permette il controllo del flusso di aspirazione (cioè pipetta di aspirazione). Questa caratteristica consente al processo di estrazione e strumentazione necessaria per purificare acidi nucleici da tipi di campioni difficili essere notevolmente semplificato (Figura 1). La geometria e la porosità del monolito è su misura per minimizzare intasamento, mentre lo spessore del monolito fornisce sufficiente acido nucleico capacità di legame per volumi di campione che vanno 1,0-5,0 ml. Flusso bidirezionale durante l'aspirazione del campione e di erogazione consente tempi di residenza prolungati tra il campione e il monolito vincolante per efficiente recupero di acido nucleico e di eluizione, e consente relativamente grandi volumi di campione da lavorare che superi la capacità di volume del puntale stesso. Abbiamo precedentemente riportato lo sviluppo e l'applicazione di una procedura TruTip manuale per la purificazione di RNA di influenza da campioni del rinofaringe utilizzando un singolo o multi-canale Rainin pipetta ^15. Efficienze di estrazione equivalenti sono stati ottenuti tra automatizzato QIAcube e metodi TruTip manuali a 10 ⁶ copie del gene influenza A per ml aspirato nasofaringeo. L'obiettivo di questo studio era di dimostrare a medio e alto-rendimento, automatizzati TruTip nucleici procedure di purificazione di acidi per aspirato nasofaringeo (NPA) e altri tipi di campioni clinicamente rilevanti, utilizzando robot di manipolazione dei liquidi che si trovano comunemente nei laboratori clinici di riferimento.

Protocollo

Tre protocolli di estrazione TruTip automatizzati sono descritti e dimostrati qui: 1) estrazione medio-rendimento RNA da NPA su un Eppendorf epMotion 5070, 2) ad alta velocità di estrazione del DNA genomico da bassi volumi di sangue intero sulla Hamilton STAR, e 3) l'isolamento selettivo e l'arricchimento di frammentazione del DNA fetale da grandi volumi di plasma materno sulla Hamilton STARPLUS. Script automatici sono disponibili da Akonni e solo i descrittori di programma di alto livello sono fornite qui. I reagenti di estrazione ed eluizione vengono automaticamente distribuite da abbeveratoi reagenti sfusi a piastre a 96 pozzetti dallo script automatico (s) prima che i campioni clinici vengono elaborati.

1. Automated RNA da aspirato nasofaringeo

Il manuale metodo TruTip precedentemente descritto ¹⁵ è ora adattato per funzionare su un Eppendorf epMotion 5070 liquido movimentazione robot, utilizzando una grande matrice TruTip poro incorporato in 1,0 ml Eppendorf tubotte punte, a 2 ml piatto profondo bene (USA scientifico), Akonni reagenti di estrazione TruTip, e NPA come il tipo di campione. Il epMotion 5070 liquido movimentazione robot può contenere fino a 8 punte contemporaneamente, in modo un protocollo automatizzato linea di base è descritto per 8 estrazioni parallelo. Tuttavia, fino a 24 campioni possono essere trattati nel corso di un unico programma in un profondo bene piatto del campione a 96 pozzetti. Un programma epMotion separato è disponibile (e richiesto) al fine di elaborare 16 o 24 campioni. Il protocollo descritto di seguito è per uno script automatico 8 campioni.

Setup

1. Portare i campioni del rinofaringe per RT prima di iniziare l'estrazione.
2. Dispensare 100 ul aspirato nasofaringeo più 150 ml di acqua priva di nucleasi nella colonna 1 del piatto del campione (Figura 2A).
3. Posizionare la piastra campione in posizione B1 sul piano di lavoro epMotion (Figura 2B).
4. Luogo puntali, TruTips e 30 ml depressioni reattivo sul loro rispettivo Worktab epMotiona le posizioni (Figura 2B).
5. Aprire il software di Eppendorf epBlue, selezionare il file di esecuzione fornito da Akonni per 8 campioni, e caricare il metodo facendo clic sul pulsante Esegui nella scheda Esegui.
6. In Impostazioni sensore di livello, selezionare Livelli e suggerimenti, e fare clic sul pulsante Esegui.
7. Inserire il volume del campione nel software e scegliere Esegui.
8. Lo script epMotion chiederà all'utente di aggiungere reagenti di estrazione ed eluizione ai serbatoi reagenti situati in posizione B2 sul piano di lavoro. Aggiungere i volumi raccomandati di ogni reagente alla rispettiva trogolo. Per 8 campioni, i volumi minimi di reagente sono:

Reattivo	Volume (ml)	Attraverso Posizione
95% di etanolo	3.5	2
Tampone di lavaggio D	9.0	3
Tampone di lavaggio e	9.0	4
Tampone di eluizione A2	1.3	5
Lysis e Binding Buffer D	11.0	6

9. Inserire i volumi di reagente nella tabella presentata dal software epMotion durante la visualizzazione del passaggio 8. Il valore di ingresso dovrebbe riflettere l'effettivo volume di tampone erogata dall'utilizzatore In ciascun serbatoio dei reagenti, e deve essere maggiore o uguale al volume minimo precedentemente menzionati. Voci di volume errata potrebbe provocare volumi errati consegnati dal hardware epMotion a ciascun tubo o pozzetto nella piastra a 96 pozzetti (s).

Programma automatico

10. Selezionare Esegui per avviare il metodo automatizzato. Lo script automatico si muoverà attraverso le seguenti fasi senza l'intervento dell'utente:
    Lisi di campioni e reagenti Distribuzione:
    1. Dispensare 375 ml Lysis Buffer D nella colonna 1 e mescolare per 10cicli (apirate + dispensare = 1 ciclo). Questo passaggio avvia il processo di incubazione lisi mentre i reagenti rimanenti vengono aliquotato.
    2. Dispensare 1.6 ml di tampone di lavaggio D nella colonna 2.
    3. Dispensare 1.6 ml di tampone di lavaggio e in colonna 3.
    4. Dispensare 50 ml tampone di eluizione A nella colonna 4.
    5. Pausa di 6 minuti per completare il campione 10 min di incubazione a Lysis Buffer D.
    6. Aggiungere 375 ml di etanolo per ogni pozzetto nella colonna 1, mescolando ogni campione con etanolo attraverso 10 cicli di pipettaggio.
    Estrazione:
    7. Carico 8 TruTips dalla posizione A2 sul piano di lavoro, e iniziare il processo di estrazione delineato in Figura 1.
    8. Aspirare e dispensare campione / tampone / etanolo lisi composto da colonna 1 della piastra campione per sette cicli di legare l'acido nucleico al TruTip monolite. Sebbene portata del campione attraverso la TruTip può variare (a causa di differenze nella viscosità campione clinico), la resa di acido nucleico per questi campioni era alcunat influenzato dalla variazione di flusso. Opzioni per migliorare il flusso del campione sono descritti nella discussione.
    9. Spostare TruTips a campione colonna piastra 2, e il ciclo di tampone di lavaggio D 5x sopra il monolite per rimuovere residui di tampone di lisi e matrice del campione.
    10. Spostare TruTips al campione colonna piastra 3, e il ciclo di Wash Buffer E 5x sopra il monolito di rimuovere le proteine ​​e altri contaminanti dall'acido nucleico bound.
    11. Spostare TruTips al reagente posizione vuota serbatoio 1 (in posizione Worktable B2) e ciclo 80x (ad una portata veloce) per asciugare il monolito. È importante asciugare la TruTip, come solventi residui nei eluite preparazioni di acidi nucleici influiscano negativamente enzimi come la trascrittasi inversa e Taq DNA polimerasi.
    12. Spostare TruTips di campione 4 colonna piastra e ciclo 5 volte in tampone di eluizione A. L'acido nucleico estratto e purificato è ora nel tampone di eluizione del campione in piastre colonna 4 pozzi.
    13. Espellere TruTips nel bidone dei rifiuti epMotion.
    14. Quando il programma è finito, rimuovere manualmente la piastra campione dallo strumento e trasferire l'acido nucleico purificato per nuovi tubi per la conservazione a lungo termine o ulteriore utilizzo. EpMotion utenti avanzati possono aggiungere istruzioni per il file di esecuzione per trasferire i campioni eluiti in provette di storage separati o piastre PCR, se lo si desidera.

Il programma per 16 campioni totali ripeterà passaggi 10.1 a 10.13 con colonne piatto del campione 5-8. Per il programma di 24 campioni, a pochi passi da 10.1 a 10.13 si ripetono 2x utilizzando campione colonne piastra 5-8 e 9-12, rispettivamente.

2. 96 pozzi di estrazione del DNA genomico da sangue intero

Un Hamilton STAR liquido movimentazione del robot è utilizzato per dimostrare l'estrazione automatica di 96 campioni contemporaneamente da sangue intero. La Hamilton STAR differisce dal sistema epMotion in che un riscaldatore opzionale / un'unità di vibrazione è disponibile sul ponte, che è importante per la digestione enzimatica di alcuni Clinimatrici cal, come sangue intero. Poiché il sistema può essere dotato di una testa pipetta a 96 canali, vi è una piastra a 96 pozzetti dedicato per ognuno dei passaggi TruTip e reagenti.

Setup

1. Accendere lo strumento STAR e computer.
2. Aprire il software di controllo Run Hamilton.
3. Aprire il file di esecuzione fornito da Akonni per 96 campioni.
4. Labware posto sul ponte STAR come mostrato in Figura 3.
5. Dispensare i reattivi nelle loro corrispondenti depressioni (volumi denotano il minimo richiesto per processare 96 campioni):

Reattivo	Volume (ml)	Attraverso Posizione
Lysis e Binding Buffer F	75	5
95% di etanolo	100	6
Tampone di lavaggio J	175	7
LavareBuffer K	175	8
Tampone di eluizione A2	12	9
Proteinasi K (20 mg ml -1)	8	15

6. Lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente.

7. Mettere le provette in rack portacampioni (posizione ponte 4 nella Figura 3). Luogo di esempio 1 nella parte posteriore del vettore più a sinistra e spostare in sequenza giù ogni vettore con il campione 96 finale in posizione anteriore destra.

Programma automatico

8. Selezionare il pulsante Play nella parte superiore sinistra della finestra del file Esegui e immettere il numero di campioni in fase di elaborazione. Lo script automatico si sposterà attraverso le seguenti fasi senza l'intervento dell'utente:
   Lisi di campioni e reagenti Distribution
   1. Trasferire 200 microlitri da ogni provetta alla piastra di incubazione in posizione 14 sulla egliater / shaker modulo (Figura 3).
   2. Dispensare 80 ml proteinasi K in ciascun pozzetto della piastra di incubazione.
   3. Pipettare 600 microlitri tampone di lisi F in ciascun pozzetto della piastra di incubazione.
   4. Miscelare la soluzione per 10 cicli, e incubare per 20 min a 70 ° C e 500 rpm. I 70 ° C impostati i risultati della temperatura in un ~ 60 ° C di temperatura del campione all'interno della piastra ben profondo, che è all'interno della gamma di attività proteinasi K. Mentre i campioni sono incubando, il sistema di gestione dei liquidi continua operativo dal dosaggio di reagenti nei loro piatti e pozzi corrispondenti:
      • 100 microlitri tampone di eluizione A in ogni pozzetto della piastra così profondo alla posizione 13.
      • 800 microlitri di etanolo in ogni pozzetto della piastra pozzo profondo alla posizione 10.
      • 1,6 ml di tampone di lavaggio K in ciascun pozzetto della piastra così profondo alla posizione 12.
      • 1,6 ml di tampone di lavaggio J in ciascun pozzetto della piastra così profondo alla posizione 11.
   5. Dopo 20 minuti di incubazione, la miscela campione è trasferito dalla piastra incubazione alla piastra pozzo profondo alla posizione 10, e mescolato con 12 cicli di pipettaggio.
   6. Espellere punte dei reagenti nel bidone dei rifiuti.
      Estrazione
      Questa porzione della procedura di sangue gDNA è molto simile al protocollo influenza epMotion, tranne per la composizione di reagenti di lavaggio e numeri di ciclo. I Hamilton TruTips punte sono nere, in modo che il flusso di liquidi attraverso la TruTip non è visibile.
   7. Caricare 96 TruTips dalla posizione ponte 3.
   8. Aspirare e dispensare il campione / tampone / etanolo lisi miscela in posizione 10 per 10 cicli di legare gli acidi nucleici per il TruTip monolite.
   9. Spostare TruTips per posizionare 11 e il ciclo di tampone di lavaggio J 5x sopra il monolite per rimuovere residui di tampone di lisi e matrice del campione.
   10. Spostare TruTips per posizionare 12 e il ciclo di tampone di lavaggio K 5x per rimuovere le proteine ​​e altri contaminanti da acido nucleico legato.
   11. Ciclo del TruTip 40x ad alta velocità per asciugare.
   12. Spostare TruTips alla posizione 13 e il ciclo di 5 volte in tampone di eluizione A2. L'acido nucleico estratto e purificato è ora in tampone di eluizione nella piastra pozzo profondo.
   13. Espellere TruTips nel bidone dei rifiuti.

Quando il programma è terminato, rimuovere la piastra di eluizione dallo strumento e trasferire i campioni estratti per i tubi adeguati per lo stoccaggio o applicazioni a valle.

3. Estrazione del DNA da campioni di plasma di grande volume

Lo strumento Hamilton STARPLUS viene utilizzato per dimostrare un protocollo automatizzato per l'estrazione circolando liberamente DNA fetale da 5 ml di plasma materno. Il sistema STARPLUS può supportare due bracci del canale pipette automatiche, una con 8 x 5 canali ml e una con 8 x 1 canali ml. Queste armi possono operare in parallelo per la trasformazione scaglionata in gruppi di 8 campioni ciascuna. A 5 ml TruTip è utilizzato per il l inizialeestrazione arge-volume e un 1 ml TruTip è usato per la separazione e l'ulteriore dimensione concentrazione dell'acido nucleico estratto.

Set-up

1. Accendere lo strumento STARPLUS e computer.
2. Aprire il software di controllo Run Hamilton.
3. Aprire il file di esecuzione fornito da Akonni per 8 campioni di plasma di grande volume.
4. Labware posto sul ponte STARPLUS come mostrato in Figura 4.
5. Dispensare i reattivi nei loro rispettivi serbatoi:

Reattivo	Volume (ml)	Attraverso Posizione
CN-W1	17	5A
CN-W2	17	5B
CN-W4	21	5C
Proteinasi K (20 mg ml -1)	5	6A
EBB	17	6B
EBA2	5	6C
CN-W3	5	6D
CN-B2	5	6E
CN-B3	5	6F
CN-L1	52	7
CN-B1	175	8

6. Lasciare che il campione raggiunga la temperatura ambiente.
7. Mettere le provette in rack portacampioni (posizione ponte 3 nella figura 4). Campione 1 posto nella parte posteriore e spostare sequenzialmente verso la parte anteriore del ponte.

Programma automatico

A causa del grande volume di campione di ingresso, lisi e omogeneizzazione procedura deve essere eseguita fuori dello strumento Hamilton STARPLUS a bagnomaria. Passaggi che richiedono l'intervento dell'utente all'interno del protocollo automatizzato sono indicati con un asterisco (*) alla beginning della frase, e grassetto.

Lysis campione e reagente Distribuzione: Il campione viene incubato con proteinasi K e tampone di lisi per omogeneizzare il campione e rilasciare il DNA.

8. Selezionare il pulsante Play nella parte superiore sinistra della finestra del file Run. Inserire il numero di campioni in fase di elaborazione, la posizione dei puntali sul ponte, e la posizione di TruTips sul ponte.
9. Lo script automatico aggiunge 615 ml proteinasi K, 5 ml di plasma, e di 6,2 ml di tampone di lisi CN-L1 per ogni 50 ml tubo conico, e sarà poi PAUSE.
10. * Rimuovere le provette coniche da 50 ml dalla coperta campione, vortex per 30 sec a velocità elevata, e incubare off-line per 30 min a 60 ° C a bagnomaria o termoblocco. Dopo che i tubi conici vengono rimossi dal ponte di Hamilton, riprendere lo script automatico per continuare il dosaggio di reagenti nelle rispettive piastre e pozzi (Figura 4B e 4C):
    • 2 ml CN-W1 a ogni altro bene in posizione 9 colonna 1.
    • 2 ml CN-W2 ad ogni altro bene in posizione 9 colonna 2.
    • 2 ml CN-W4 ad ogni altro bene in posizione 9 colonna 3.
    • 250 microlitri EBA2 ad ogni altro bene in posizione 9 colonne 4 e 5.
    • 495 microlitri CN-B2 ad ogni altro bene in posizione 10 colonna 1.
    • 1 ml EBB ad ogni altro bene in posizione 10 colonna 2.
    • 500 microlitri CN-W3 ad ogni altro bene in posizione 10 colonna 3.
    • 500 microlitri CN-W4 ad ogni altro bene in posizione 10 colonna 4.
    • 50 microlitri EBA2 ad ogni altro bene in posizione 10 colonna 5.

Perché i canali 5 ml sono troppo larghi per usare pozzetti adiacenti per ogni campione, il programma eroga reagenti automatizzati in ogni pozzetto della piastra pozzo profondo in posizione ponte 9. Il braccio meccanico utilizzato per i canali 1 ml richiede anche l'uso di ogni altra pozzetto in piastre reagenti per l'esclusione e st concentrazioneeps del protocollo.

Dopo reagenti di erogazione, il programma andrà in pausa.

11. * Dopo 30 min, 60 ° C incubazione, posizionare le provette coniche da 50 ml in ghiaccio per 5 min.
12. * Riportare le provette coniche da 50 ml alle loro posizioni originali all'interno del rack portacampioni in posizione ponte 4 e riprendere lo script automatizzato.
13. Aggiungere 12 ml di Binding Buffer CN-B1 a ciascuna provetta e mescolare 10x.

Grande Estrazione Volume: 5 ml TruTips sono utilizzati per l'estrazione del DNA totale dal campione di plasma lisato.

14. Pick up 5 TruTips ml dalla posizione 2 per il grande volume di estrazione di acidi nucleici.
15. Ciclo campione mixture15 volte nella provetta da 50 ml, a partire dalla parte inferiore del tubo e mobili a 3 mm più alto dopo ogni ciclo di pipettaggio. Questo passaggio si lega l'acido nucleico totale al TruTip monolito.
16. Spostare TruTips alle piastre pozzo profondo in posizione 6 colonna 1, e cycle 1x in tampone di lavaggio CN-W1.
17. Spostare TruTips per posizionare 9 colonna 2 e ciclo 1x in Wash CN-W2.
18. Spostare TruTips per posizionare 9 colonna 3 e ciclo di 2x in Wash CN-W4.
19. Spostare TruTips per posizionare 9 4 colonna e del ciclo di 40x ad alta velocità per asciugare matrice legante.
20. Spostare TruTips per posizionare 9 colonna 5 e il ciclo di 10x per eluire gli acidi nucleici legati dai 5 ml TruTips. Questo è eluizione di grande volume # 1.
21. Spostare TruTips alla colonna 6 e ripetere l'operazione con la seconda aliquota di tampone di eluizione. Questo è di grande volume di eluizione # 2.
22. Trasferire eluizione # 2 nella posizione 9 colonna 5 di combinarlo con eluizione # 1, e scartare le TruTips.

Esclusione e Concentrazione: Il DNA ad alto peso molecolare viene rimosso dal campione estratto, e il DNA rimanente è isolato e concentrato.

23. Aggiungi eluente combinato dal punto 22 alla posizione 10 colonna 1 e mescolare accuratamente 10x.
24. Raccogliere 1 ml trutips dalla posizione 13 e il ciclo di 20x per legare il DNA ad alto peso molecolare per il monolite.
25. Spostare i TruTips per posizionare 10 2 colonna e ciclo 5x per sciacquare la punta e rimuovere alto peso molecolare del DNA. Le TruTips vengono conservati e rimessi nel rack punta alla posizione 13.
26. Con punte di reagenti dalla posizione 12, aggiungere 575 ml di Binding Buffer CN-B3 per il campione in posizione 10 colonna 1 e mescolare 10x.
27. Raccogliete le TruTips dal punto 25, tornare alla posizione 10 colonna 1, e il ciclo di 20x per legare il DNA residuo dal campione al 1 ml TruTip.
28. Spostare TruTips per posizionare 10 colonna 4 e ciclo 1x in Wash CN-W3 per rimuovere eventuali inibitori rimanenti.
29. Spostare i TruTips per posizionare 10 colonna 5 e ciclo 1x in Wash CN-W4 per sciacquare i sali residui da CN-W3.
30. Sollevare TruTips oltre la posizione 10 della colonna 5 e l'aria scorrere le punte 35x per asciugare il monolito.
31. Spostare TruTips per posizionare 10 colonna 6 e il ciclo di 10x in EBA2 per eluire il purificata, size-selezioneTed e acido nucleico concentrato.
32. Scartare TruTips.
33. Trasferire il campione eluito dalla colonna 6-1,5 ml provette in posizione 11. Campioni estratti sono pronti per la conservazione o la trasformazione a valle.

Risultati

Dati real-time PCR per l'influenza RNA da NPA sono mostrati in Figura 5A. Acido nucleico efficienza di estrazione stimato è simile ai risultati ottenuti con la versione manuale del protocollo ^15. Una risposta lineare in media valori di C _t è osservata tra 10 ⁴ e 10 ⁶ copie del gene ml ^-1 modificato influenza (R ₂ = rispettivamente 0,99 e 0,98 per l'influenza A e B,), con deviazioni standard in media C _t valori inferiori a 1 ciclo. L'assenza di contaminazione incrociata con il sistema epMotion è dimostrato in Figura 5B, dove 12 campioni NPA positivi contenenti 10 ⁶ copie del gene ml ^-1 NPA sono stati intervallati con 12 spazi tampone. Il C _t media per i controlli positivi era 30,16 ± 0,14, e tutti gli spazi del buffer sono stati negativi. Il tempo di elaborazione totale del campione è 16, 28 e 40 min per 8, 16 e 24 campioni, rispettivamente.Poiché un tipico nasofaringeo clinico o tampone conterrà 10 ⁷ gene copie ml ^-1 (supponendo 1.000 virioni per TCID ₅₀ ¹⁶ e> 10 ⁴ TCID ₅₀ ml ^-1 influenzale ^17), il protocollo epMotion automatizzata dovrebbe essere efficace su una maggioranza di esemplari NPA clinici.

Data la gamma dei test molecolari condotti su DNA genomico umano, l'obiettivo primario di estrazione degli acidi nucleici da sangue intero è produrre senza contaminanti, ad alto peso molecolare del DNA genomico. Il protocollo automatizzato per 96 campioni è completata entro 1 ora, che è un miglioramento rispetto altri sistemi automatizzati (ad es Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 hr). Figura 6A mostra i profili di assorbanza UV / Vis per 45 campioni di sangue positivi trattati contemporaneamente con 45 reagenti bianchi sul protocollo Hamilton STAR, con una media A _{260/280 rapporto di 1,96 e media A 260/230 rapporto di 1,93. Un A 260/280 rapporto tra 1,7-2,0 e A 260/230 rapporto> 1,7 sono in genere indicativo di DNA molto pura, priva di sali residui, proteine ​​o solventi, e accettabile per le applicazioni molecolari più a valle. Il gel di agarosio 1% in Figura 6B mostra che il gDNA risultante è di alto peso molecolare (> 24 kb), con minima tranciatura. La resa media di acido nucleico, dal set di 45 campioni positivi è 5,26 ± 0,46 mg di DNA umano per 200 ml di sangue intero, sulla base della Life Technologies Quantifiler umana quantificazione Kit DNA. Studi cross-contaminazione simili a quelli mostrati nella Figura 5B sono state effettuate con sbozzati tampone controllo negativo intervallati da campioni positivi ed estratta in parallelo; tutti gli spazi erano nuovamente negativi mediante PCR (non mostrato). Il gDNA purificato è inoltre adatto per numerose altre analisi basate sulla PCR (non mostrato).}

Risultati in tempo reale da otto campioni replicati di un campione di plasma materno pooled processato con la procedura TruTip grande volume sono mostrati in Figura 7. Il protocollo completo (compreso off-line proteinasi K incubazione) è finito in circa 2,5 ore, simile al manuale Qiagen circolazione nucleici Kit Acids (senza kit di estrazione automatizzati comparabili sono ancora disponibili). I valori medi C _t oltre tutte le repliche sono 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 per il maschio fetale (CHY) e DNA totale (CH1), rispettivamente, che dimostra eccellente ripetibilità del metodo di estrazione automatica. La concentrazione di DNA fetale all'interno della piscina DNA totale (in equivalenti genoma), viene calcolata sulla base del confronto analisi punto di adattamento agli standard, con la conseguente% DNA fetale media per tutti i campioni di 2,8%. Il DNA fetale effettivo% per questo campione è sconosciuto poiché i campioni sono stati aggregati prima di eseguire l'estrazione. Composizione del DNA fetalecampioni di plasma in non aggregati estratti utilizzando il metodo TruTip sono tipicamente 1,5 volte superiore rispetto ai risultati con un kit Qiagen circolazione Acidi Nucleici (non mostrato).

Figura 1. Il processo di estrazione TruTip e flusso di lavoro, indipendentemente dal sistema di gestione dei liquidi. Altra preparazione del campione o fasi di manipolazione di liquidi possono essere incorporati nella routine automatizzate seconda delle capacità dello strumento di gestione dei liquidi e software specifici.

Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 campione layout di piastra. (B) Disposizione dei reagenti / ConsumaBles sul piano di lavoro. piatto del campione può essere configurato per un massimo di 24 campioni (colonne 1, 5 e 9, rispettivamente), anche se il epMotion elaborerà solo un massimo di 8 campioni simultaneamente. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Hamilton STAR disposizione della piattaforma per la purificazione di DNA genomico da sangue intero (non in scala) Deck posizione 1 = Hamilton 1 ml suggerimenti filtrato. 2 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrati, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 millimetri TruTips; 4 = ingresso vettori campione di sangue (provette o tubi microcentrifuga); 5-9 = 290 ml depressioni reagenti per Lysis Buffer F, Etanolo, il tampone di lavaggio J, K e il tampone di lavaggio tampone di eluizione A2, rispettivamente; 10 = 96 dEEP piastra ben Binding; 11 = 96 pozzo profondo Lavare J; 12 = 96 pozzo profondo Lavare K; 13 = 96 Piatto fondo eluizione bene; 14 = Hamilton HHS2 riscaldatore / shaker con Nunc 96 profondo piastra di incubazione bene; 15 = 50 ml di reagente trogolo contenente proteinasi K. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Hamilton STARPLUS disposizione della piattaforma per purificare il DNA da campioni di plasma di grande volume (non in scala). Il sistema è dotato di 8 x 5 canali e 8 ml x 1 ml canali (non mostrato nel layout ponte). Deck Posizione 1 = Hamilton 4 ml punte filtrati; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = campioni di plasma di origine; 4 = 50 ml provette coniche; 5 = 120 ml depressioni reagenti contenenti CN-W1, W2 e CN-CN-W4 Reagenti; 6 = depressioni reagente a basso volume contenente proteinasi K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagenti; 7 = 290 ml attraverso reagente contenente reagente CN-L1; 8 = 290 ml di reagente recipiente contenente CN -B1 reagente; 9 = 96 pozzetti profondi per la Fase 1, 10 = 96 piatti fondi e per la fase 2, 11 = porta campioni per purificato, prodotto finale; 12 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrate; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. (A). PCR in tempo reale i risultati di estrazione TruTip automatizzata del virus dell'influenza aggiunte in aspirato nasofaringeo (NPA). INPUT VOLUME NPA = 100 l, volume di eluizione = 50 ml. Risultati sono la media di 3 replicare extractions da 5 distinti ambiti di NPA (n = 15) per livello di diluizione e di destinazione influenza. qPCR è stata eseguita sul sistema LightCycler 480 con condizioni descritte in precedenza ^15. (B) n contaminazione incrociata viene rilevata quando 12 campioni NPA positivi si alternano senza controlli template e sulla base della procedura di estrazione automatica. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Risultati di estrazione di DNA genomico umano da sangue intero a.) Tracce UV-visibile da un NanoDrop 1000 (ThermoFisher) di 10 selezionati in modo casuale repliche. B) 1% gel di TruTip purificato gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificato gDNA da quattro selezionati casualmente repliche. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. PCR in tempo reale i risultati di otto replica TruTip estrazioni di DNA circolante liberamente dal plasma. Campioni indicati da asterischi (* o **) sono stati estratti in giorni separati. CHY quantifica il DNA fetale maschio e CH1 quantifica il DNA totale presente (fetale e materna). qPCR è stata eseguita su un sistema 480 LightCycler (Roche) con saggi precedentemente pubblicati rivolte CHY e CH1 ^18.

Discussione

La semplicità del concetto TruTip e workflow (Figura 1) lo rendono facilmente adattabile, automatizzato, efficiente ed efficace per una serie di matrici di campioni clinici, volumi di campionamento in ingresso, e sistemi di manipolazione dei liquidi. Va riconosciuto, tuttavia, che ogni campione clinico è unico, e varierà uno all'altro in viscosità, particolati, muco, contaminanti, microbici, e / o sfondi genetiche umane. Dato variazioni previste nella composizione del campione clinico e usi previsti per un protocollo di preparazione del campione TruTip automatizzato, può quindi essere necessario modificare alcuni passaggi in una procedura TruTip al fine di ottenere i risultati desiderati per un tipo specifico campione. Indipendentemente dal tipo di campione, tuttavia, TruTip parametri che in genere hanno l'impatto più significativo sulla purezza dell'acido nucleico e / o recupero comprendono:

1. Campione miscelazione ed omogeneizzazione con tampone di lisi (e alcool). Mentre TruTips hanno una rilatively grande dimensione dei pori, omogeneizzazione del campione e liquefazione è molto importante per la lisi cellulare efficiente, e le successive fasi di legame alla TruTip monolito. Con un lisato omogeneo e ben liquefatto, i campioni possono muoversi attraverso il TruTip con portate maggiori, il che riduce il tempo di elaborazione del campione complessivo. Il grande volume di plasma protocollo dimostra il potenziale per gli utenti di omogeneizzare accuratamente e liquefare campioni difficili (on-line o off-line), nonostante il volume del campione di ingresso di grandi dimensioni.
2. Portate. Portate più lenti durante legame dell'acido nucleico o l'eluizione tipicamente producono una maggiore resa di acido nucleico, sia pure a scapito del tempo di elaborazione totale. Portate più lenti possono anche ridurre l'entità del taglio del DNA.
3. Numero di cicli. Il numero ottimale di aspirazione e dispensazione dei cicli dipende dal tipo di campione, il volume totale del campione e le portate. Fase 1 nella figura 1 è tipicamente il punto in cui il ciclo numbers (e portata) può richiedere alcuni ottimizzazione empirica, con campioni come nasofaringeo (Figura 5) rappresenta uno dei lisati più impegnative per ottimizzare dovuto la gamma di NPA viscosità da pazienti diversi.
4. Asciugatura. Completa asciugatura della TruTip monolite è indispensabile per evitare che residui di solventi organici da co-eluizione con il campione di acido nucleico purificato e processi a valle inibendo o prove. Perché TruTip non viene essiccato tramite centrifugazione o filtrazione sotto vuoto, è importante massimizzare sia la portata e numeri del ciclo durante la fase di essiccazione. A volte c'è una goccia residuo di soluzione di lavaggio sul capolinea del TruTip dopo i cicli di essiccazione sono stati completati. La Hamilton robot ha la capacità di effettuare un "tocco punta" sul lato del pozzo per rilasciare la gocciolina, assicurando così una eluizione solventi. Il sistema epMotion non ha questa funzione, ma un pre-risciacquo del capolinea TruTip a elution tampone può essere programmato per ottenere lo stesso effetto.

Perchè la geometria, materiale pipetta punta, e il metodo di fissaggio ai bracci robotici canale sono unici per ogni marca di strumenti, è richiesto un diverso costrutto TruTip per ogni sistema di gestione dei liquidi. Le dimensioni monolite TruTip (diametro, spessore e dimensione dei pori) sono correlate con l'acido nucleico capacità di legame (e l'efficienza di eluizione), come previsto per qualsiasi tecnica di estrazione in fase solida. Mentre spessi (> 4 mm), matrici possono essere incorporati in un TruTip 1 ml di acido nucleico per aumentare capacità di legame per campioni di grande volume e / o equalizzare la capacità di legame di tutti i formati TruTip specifici, vi è un compromesso tra lo spessore TruTip e portate durante la fase di legame iniziale (in presenza di lisati greggio). Così, a volte è vantaggioso incorporare monoliti di diametro maggiore in grandi volumi puntali per le fasi iniziali di un protocollo automatizzato, (ad es </ Em> i 5 ml Hamilton / Akonni TruTips per estrazioni di grande volume). Date le configurazioni TruTip specifiche dettate dai costruttori di robot di manipolazione dei liquidi, tuttavia, non necessariamente aspettiamo TruTip rendimenti di acidi nucleici per essere identici per tutte le piattaforme di gestione dei liquidi di diversi produttori, o attraverso diverse dimensioni TruTip.

Campioni clinici (per definizione) conterranno quantità significative di DNA genomico umano a meno che non sono acquisite da siti normalmente sterili (ad esempio liquido cerebro-spinale). A volte il DNA genomico umano è desiderato (come in figura 6), mentre in altre applicazioni del DNA umano rappresenta un fondo genomico indesiderato (come per la Figura 5). La presenza di DNA di sfondo non è solitamente problematico finché la quantità totale di acido nucleico nel campione non supera la capacità di legame del monolito, e il DNA sfondo può servire come un trasportatore, se il nucleico target desideratoacido è presente in tracce. L'obiettivo del protocollo di estrazione del plasma ad alta disponibilità (Figura 7) è isolare (frammentato) DNA fetale in presenza di un eccesso di piega 10-20 DNA materno, che è simile all'obiettivo preparazione del campione di test di malattie infettive tranne che le sequenze sono altamente congruenti e possono essere distinti da collaudo molecolare altamente specifico e / o di discriminazione dimensione. In questo caso, il DNA totale circolante viene isolato utilizzando un 5 ml TruTip, e successiva DNA fetale peso molecolare elevato e basso peso molecolare vengono separati mediante eluizione e successivo legame ad un 1 ml TruTip alterando le condizioni del tampone di legame. Separazione dimensionale selettivo e arricchimento di acidi nucleici bersaglio in base alle loro proprietà di legame e di eluizione di un monolito di silice è una modalità di azione significativamente diverso rispetto raggiunto da membrane o esclusione dimensionale colonne di rotazione. Separazione dimensione e l'arricchimento del DNA microbico da DNA genomico umano può essere unccomplished in future applicazioni tramite la personalizzazione TruTip vincolante e tamponi di eluizione.

I protocolli automatizzati dimostrato qui sottolineare l'utilità del TruTip monolite stesso per l'elaborazione di diversi campioni clinici, e come può essere adattato per grandi volumi e specifiche robot di manipolazione dei liquidi. I metodi semplificati di solito sfociano in protocolli di estrazione più veloce rispetto ad altri sistemi automatizzati. La semplicità della tecnologia TruTip, tuttavia, offre anche alcuni vantaggi di costo per coloro che sono interessati all'acquisto di un nuovo sistema automatizzato di purificazione acido nucleico, perché l'hardware primaria necessaria per l'automazione delle procedure TruTip è il braccio pipetta canale stesso, piuttosto che barrette magnetiche, sistemi per il vuoto , oppure a bordo centrifughe. Utilizzando le piastre dei reagenti preriempite può anche ridurre lo spazio e materiali di consumo necessari, e raddoppiare la velocità per corsa. Riducendo al minimo spazio della piattaforma con i protocolli TruTip consente inoltre agli utenti avanzati di integrare a monte o dprocessi automatizzati ownstream con il TruTip. Per esempio soluzione easyBlood di Hamilton al sangue intero frazionare può essere incorporato con il metodo di estrazione TruTip automatizzato, che sarebbe snellire significativamente i processi bio-banking. Processi di post-estrattivi, come la quantificazione degli acidi nucleici, la normalizzazione, PCR set-up, o sequenziamento del DNA sono anche facilmente integrati con TruTip sulle grandi piattaforme di gestione dei liquidi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-11120
95% Ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
99% Acetone	Sigma-Aldrich	270725-4L
DEPC-treated water	Life Technologies	AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml	Eppendorf	960050100
Deep well plate 96/2,000 μl	USA Scientific	30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl	Eppendorf	960050100
Equipment
epMotion 5070 System	Eppendorf	5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8	960001061
Reservoir rack	960002148
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-20341
95% ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235904
50 ml Reagent Trough	Hamilton Robotics, Inc.	187297
Deep Well 2 ml plate	USA Scientific	1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml	Thermofisher	27874
Reagent Trough	Fisher	14-222-412
Equipment
Hamilton STAR System	Hamilton Robotics, Inc.	173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173050
1 ml 96-channel head	Hamilton Robotics, Inc.	199090
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
Sample Carriers/Inserts	Hamilton Robotics, Inc.	173400/182238
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
HHS2 Heater Shaker Unit	Hamilton Robotics, Inc.	199033
Rack Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188047
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	Call to inquire
100% ethanol	Sigma-Aldrich	459828-1L
Isopropanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC327270010
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
Filtered 4 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	184022
Unfiltered 1 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	235939
96-Deep Well Plates	USA Scientific	1896-2800
50 ml Conical Tubes	Corning/ThermoFisher Scientific	05-526B
50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	187297
120 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs	ThermoFisher Scientific	14-222-412
Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module	Hamilton Robotics, Inc.	173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	184090/173050
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	188047
120 ml Reagent trough carrier	Hamilton Robotics, Inc.	185290
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
50 ml Tube Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182245
24 Position Sample Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	173400
32 Position Sample Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	173410
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.