El aislamiento de los microorganismos del suelo nativo con potencial para romper biodegradables Mantillo películas de plástico utilizados en la agricultura

Resumen

Las películas de plástico con la etiqueta "biodegradable" están disponibles comercialmente para uso agrícola como coberturas. Labranza representa un método de tratamiento atractiva, pero la degradación en condiciones de campo es poco conocida. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos para el aislamiento de hongos del suelo nativo y las bacterias que colonizan las películas de mantillo de plástico después del entierro de campo.

Resumen

Los hongos nativos en los suelos agrícolas que colonizaron películas mantillo biodegradables disponibles comercialmente (BDM), se aislaron y evaluaron de potencial de degradar plásticos. Típicamente, cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima está disponible, de plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de las zonas de compensación. Sin embargo, este enfoque mal imita en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, BDM no se dispersan en forma de partículas pequeñas en toda la matriz del suelo. En segundo lugar, BDM no se venden comercialmente como polímeros puros, sino más bien como las películas que contienen aditivos (por ejemplo, cargas, plastificantes y colorantes) que pueden afectar el crecimiento microbiano. Los procedimientos descritos en este documento se utilizan para los aislamientos obtenidos de películas mantillo de enterramiento. Aislados fúngicos obtenidos de BDMs excavadas fueron probados individualmente para el crecimiento en pedazos de nuevos BDMs, desinfestadas establecidos sobre medio definido que no contiene fuente de carbono ealvo agar. Los aislados que crecían en BDMs fueron probados en medio líquido donde BDMs eran la única fuente de carbono adicional. Después de aproximadamente diez semanas colonización fúngica y la degradación de BDM se evaluaron por microscopía electrónica de barrido. Los aislados fueron identificados a través de análisis de secuencias de genes de ARN ribosomal. Este informe describe métodos para el aislamiento de hongos, pero las bacterias también se aisló usando estos métodos por los medios de sustitución apropiadas para las bacterias. Nuestra metodología puede ser muy útil para los estudios de investigación de desglose de las películas de plástico intactas o productos para los que las materias primas de plástico o bien son desconocidos o no están disponibles. Sin embargo, nuestro enfoque no proporciona un método cuantitativo para comparar las tasas de degradación de BDM.

Introducción

La degradación ha sido históricamente considerada un atributo deseable de polímeros plásticos, debido desglose reduce su vida útil y durabilidad del producto. Recientemente, la conciencia de los problemas ambientales presentados por los residuos de plástico en el entorno natural ^1,2,3 ha hecho plásticos biodegradables una alternativa atractiva a los materiales plásticos convencionales. Degradación (definida como los cambios estructurales, la fragmentación y la reducción en el peso molecular, la integridad, y la fuerza de ^4,5) se produce a través de una serie de eventos, incluyendo tanto los procesos abióticos (estrés térmico, la foto-oxidación, la hidrólisis, la erosión y el estrés mecánico), y la degradación biológica ^6. Si bien los procesos abióticos pueden cambiar el tamaño de los fragmentos y las características de los plásticos, se requieren los microorganismos para su último mineralización al agua y dióxido de carbono (en condiciones aeróbicas) y / o metano (en condiciones anaerobias).

Un nicho importante paraplásticos biodegradables existe en la agricultura, donde se utilizan coberturas de plástico para evitar el crecimiento de malezas, para retener la humedad del suelo y para aumentar la temperatura del suelo ^7,8. Cientos de miles de acres en los Estados Unidos solamente están cubiertas con mulch de plástico ^9, incluyendo coberturas compuestas de plástico biodegradable. Después de una temporada de crecimiento de los cultivos, las opciones para disponer de coberturas biodegradables (BDM) incluyen la eliminación en un vertedero, la incineración para recuperar energía ^10, la degradación a través de compostaje, o degradación en el suelo después de la siembra ^11. De éstos, el destino menos mano de obra intensiva está arando BDM en el suelo, pero sin la degradación eficiente y la mineralización durante meses no cultivadas (generalmente en el invierno), fragmentos de plástico podrían permanecer y interferir con los equipos agrícolas durante la labranza y la siembra de primavera, y persistir en el medio ambiente en el que impactan significativamente la fauna, la flora y microbiota ^1,2,3,10.

Aunque muchos productos plásticos, incluyendo películas agrícolas, llevan la etiqueta de "biodegradable" o "compostables", en la práctica, la degradación y la mineralización pueden ser demasiado ineficiente y / o demasiado incompleta para la descomposición en el suelo a ser un alternativa viable para la eliminación de estos productos. Por ejemplo, polietilenos oxo-biodegradables lograrse sólo 12,4% de mineralización después de un año de la intemperie ya los tres meses posteriores en un 58 ° C de compost, y menos de la mitad de esa cantidad de mineralización tuvieron lugar cuando la temperatura de la composta era 25 ° C ^12. En el invierno, la temperatura del suelo en la mayoría de lugares serían más bajos que cualquiera de estas temperaturas, presumiblemente como resultado aún menor actividad microbiana y, en consecuencia, menor mineralización. Además de disminuir las tasas de degradación, el mal uso del término "biodegradable" ha llevado a desconfiar de estos productos por los consumidores ^13,14, incluidos los de la industria agrícola. La biodegradación es la conversiónde polímeros a dióxido de carbono (y / o metano) y agua ¹⁴ por microorganismos de origen natural ^4. Por lo tanto, la biodegradación se debe medir químicamente; la asociación física de microorganismos con un sustrato no implica la degradación microbiana de ese material.

Como parte de un esfuerzo para examinar el uso sostenible de BDM en la agricultura, este estudio se centra en el descubrimiento de los microorganismos nativos de suelos agrícolas que colonizan y degradan BDMs disponibles comercialmente. Métodos de ensayo normalizados se han publicado para medir químicamente la descomposición de los plásticos biodegradables mediante abióticos y biológicos ^15,16,17. Sin embargo, estos métodos no se refieren a la degradación de plásticos por especies microbianas individuales, o proporcionan métodos para su aislamiento. La metodología se asemeja más estrechamente en este documento métodos estándar diseñados para evaluar plásticos para la resistencia a la degradación microbiana después de la inoculación de las muestras con esporas de hongos18,19.

Cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima es disponible, el plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de zonas de compensación ^13. Este método se ha utilizado anteriormente para identificar microorganismos que degradan polímeros tales como poliuretano ^20, poli-(butileno succinato-co-adipato) ^21, y poli (ácido láctico) ^22. Un método similar implica la suspensión de plástico en polvo puro en un medio líquido, donde el plástico es la única fuente de carbono ^20,23. Si bien estos métodos tienen la ventaja de un sistema definido, que mal imitar en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, el área de superficie se distribuye de manera diferente porque BDMs no se dispersan en partículas pequeñas en toda la matriz del suelo, sino más bien, venden y utilizan como películas. En segundo lugar, la composición química de BDM es diferentes de los polímeros puros. BDMs generalmente contienen aditivos tales comomateriales de relleno, plastificantes y colorantes, y estos aditivos pueden afectar el crecimiento microbiano y de ese modo, la tasa de mineralización. Por esta razón, y debido a la composición de ciertas películas comerciales en este estudio eran de propiedad, película de plástico en su forma de campo-listo se utilizó para aislar los hongos y las bacterias. Por simplicidad, los siguientes métodos se describen sólo para los hongos, con modificaciones observaron en su caso para aislamientos bacterianos.

En un estudio reciente ^24, tres BDMs comercialmente disponibles y una película experimental se utilizaron en los sitios agrícolas en tres diferentes regiones de los Estados Unidos durante un período de crecimiento, y posteriormente colocados en mallas (250 micras) bolsas y enterrados en un invierno en el suelo en los mismos sitios. Las aberturas de la malla de 250 micras permiten hifas del hongo penetre excluyendo raíces y la mayoría de la fauna del suelo, y reducir al mínimo la intrusión del suelo ^25,26. Materiales de nylon evitan la degradación de la bolsa en el suelo. Después de la excavación, fuNGAL aislamientos fueron recuperados a partir de piezas BDM y se evaluaron para el crecimiento en medio mínimo sin una fuente de carbono, excepto el agar y unos 5 cm x 5 cm cuadrados de superficie desinfestados de nuevo, película BDM no utilizada que fue pre-desinfestados. La mayoría de los plásticos que se utilizan como películas no pueden ser esterilizados en autoclave sin pérdida de integridad, se utiliza la luz ultravioleta para matar las células microbianas que residen en los plásticos. ISO ¹⁹ 846 recomienda superficie-desinfestación en 70% de etanol y posterior secado, pero si se utiliza este método, uno debe asegurarse de que ningún componente o aditivo de la película se ve afectada negativamente por el etanol. Desde BDMs presumiblemente se fabrican para soportar la luz del sol, UV fue elegido como un método de descontaminación.

Los aislados que crecían en BDM piezas mejor que en un medio mínimo solo se seleccionaron para su posterior estudio. Agar, un polisacárido producido por las algas marinas, se utiliza para solidificar medios microbianos, ya que no es utilizada típicamente metabólicamente por agrícolamente y médicamente nomicroorganismos capaces, sin embargo, agar enzimas que hidrolizan se han aislado a partir de bacterias marinas ²⁷ y agar que hidrolizan las bacterias también se han aislado de suelo ^28. Polímeros BDM y agar tanto se espera que sean sustratos raras para enzimas secretadas por hongos del suelo, que no se han desarrollado en ambientes que contienen estos polímeros como posibles fuentes de nutrientes, pero ambos sustratos están presentes en la placa de bioensayo descrito en este documento (Paso 7). Los hongos que utilizan BDMs pero no de agar como una fuente de carbono pueden ser diferenciados de los hongos que sólo utilizan agar, comparando el crecimiento en agar-medio solidificado que contiene i) fuente de carbono sin añadido excepto agar (control negativo), ii) BDM películas (experimental) y iii) la glucosa (control positivo). El crecimiento de todas las cepas se espera que en un medio mínimo más la glucosa; hongos no derivada de la glucosa que contienen placas puede no ser capaz de crecer en el medio mínimo particular usado en el experimento. Potential BDM degradadores debe crecer en agar solidificado medio mínimo + film BDM mejor que crecen en agar solidificado medio mínimo solo. Los hongos que crecen en placas de medio mínimo de agar-son degradadores o poblaciones de ecosistemas oligotróficos, y también se espera que crezcan en el agar asociado con películas BDM en placas de bioensayo, pero no en las propias películas (a menos que casualmente también degradan polímeros BDM).

Para eliminar la posibilidad de ver el crecimiento microbiano debido a la utilización de agar y no de BDM, seguimos nuestro ensayo inicial para la colonización BDM en placas de agar con un bioensayo en medio de caldo definido (Paso 9). BDM piezas representaban la fuente de carbono sólo se conoce en los tubos de ensayo biológico.

Después de la selección inicial, y después de la reactivación de las existencias de glicerol de las cepas aisladas, algunos formaron micelios escasa pero visible en medio definido líquido que no contiene fuente de carbono conocido. Estos resultados sugieren que algunos de los aislados fueron adquiridos oligotrophs - organismos que crecen por barrido de cantidades muy pequeñas de carbono, nitrógeno y otros nutrientes disueltos ya sea en el ambiente acuoso o que existe como volátiles en el aire ^29,30,31. La identificación de especies a través de análisis de ADN ribosómico 18S apoya este punto de vista, ya que muchos de los aislados emparejados géneros fúngicos se informó anteriormente para exponer oligotrofía ^32. Poblaciones de ecosistemas oligotróficos, que son comúnmente saprofitos, requieren una amplia gama de capacidades metabólicas para la utilización del sustrato en una gama de entornos de ^30. Por lo tanto, no es sorprendente que los mismos hongos que aislamos de la BDM (presumiblemente requieren capacidades enzimáticas inusuales) demostraron capacidades oligotróficos, y fueron capaces de crecer en trazas de contaminantes, tales como aceites de la piel de las huellas dactilares, el polvo o volátiles traza en el aire. Debido al aislamiento de poblaciones de ecosistemas oligotróficos, llegamos a la conclusión de que el crecimiento en una superficie BDM por sí solo no podría ser utilizado para inferir BDM avería. Los métodos descritos en este documento reflejan nuestros esfuerzos para screen colonizadores BDM nativas de suelos agrícolas bona fide desglose BDM.

Protocolo

Este procedimiento requiere por lo menos varios meses para la incubación de las películas de BDM en el suelo, y varios meses más para bioensayos secuenciales tanto sobre placas de agar en caldo y agar-libre, definido químicamente para evaluar la colonización y la degradación. Métodos individuales se enumeran en el orden en que se realizarán.

1. La incubación de las películas BDM en suelo

Incorporar películas BDM en el suelo en condiciones que imitan las de las que se espera que se degrade. Adquirir 400 g (peso seco equivalente) de suelo residente y un sándwich cm x 10 cm BDM 10 con el suelo dentro de una 13 x 13 cm de nylon bolsa de malla (250 micrones). Cierre con hilo nylon. Los tiempos de incubación son a discreción del experimentador. Supervisar y / o modificar los parámetros relevantes para la actividad microbiana (por ejemplo, temperatura del suelo, nutrientes y humedad) en intervalos regulares durante todo el período de incubación, según corresponda.

2. Preparación de los medios de comunicacióny Reactivos

Para evitar la introducción de fuentes de nutrientes inadvertidamente en los medios de comunicación y los tubos de cultivo, utilizar productos químicos de grado reactivo, tubos de cultivo que acaba de adquirir, Tipo I ultrapura (por ejemplo nanopura) Agua y cristalería estrictamente lavado para los medios de mezclado. Evite la contaminación cruzada de los reactivos - lo mejor es utilizar un conjunto específico de reactivos y material de vidrio para este fin. Tenga en cuenta que es posible que los hongos se pueden aislar cuyo crecimiento se inhibe por un ingrediente en los reactivos enumerados a continuación. Si esto ocurre, se puede requerir alguna optimización.

1. Antes de hacer los medios de comunicación, lavar el material de vidrio es necesario con un detergente de laboratorio y luego ácido-lavado (por ejemplo, remojo toda la noche en HCl 10%). Enjuague un mínimo de doce veces en agua destilada y dos veces en agua ultrapura. Cubra el material de vidrio con papel de aluminio limpio para excluir el polvo. Use guantes y evitar el contacto con el interior y los bordes de los vasos para excluir los aceites de la piel de las huellas dactilares. Para evitar cualquier jabón resicuotas y los arañazos en el vidrio que facilitan la colonización, los hongos de cultivo en tubos de cultivo de vidrio recién adquiridas (sin usar), enjuagados y autoclave y gorras.
2. Agar de dextrosa de patata (PDA) se utiliza para el aislamiento inicial de los hongos del suelo, y para el establecimiento de colonias aisladas individuales y la generación de inóculo para el almacenamiento a largo plazo. Preparar los medios de comunicación de acuerdo con las instrucciones del fabricante y después de la esterilización en autoclave (cuando se enfría a 50 ° C), complemento cloranfenicol (a partir de una 10 mg / ml de solución madre en EtOH) a una concentración final de 30 mg / ml, para excluir bacterias. Este medio que ahora se conoce como PDA chl ^30.
3. Medio mínimo fúngica (FMM) se utiliza como una base sólida para la BDM inoculados con potenciales hongos degradadores de plástico. Aparte de que el agar (cuando se utiliza para solidificar el medio), que es libre de carbono. A unos 800 ml de _H2O desionizada, añadir 6,0 g _NaNO3, 0,52 g de KCl, 0,52 g _MgSO4 · 7H2 O, 1,52 g KH ₂ PO _4, y 1 oligoelementos solución madre de ml Hutner (2,2 g _ZnSO4 · 7H ₂ O, 1,1 g de H ₃ BO _3, 0,5 g _MnCl2 · 4H ₂ O, 0,5 g _FeSO4 · 7H ₂ O, 0,16 g _CoCl2 · 5H ₂ O, 0,16 g de CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0,11 g (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O y 5,0 g de Na ₄ EDTA en 100 ml _{de H2O} destilada ^{33 , 34.} Ajustar el pH a 6,5 utilizando NaOH, y llevar el volumen a 1 L. Para el bioensayo de líquido, filtro de esterilizar-FMM para evitar la precipitación de sales. Si se desea medio sólido, añadir 16 g de agar y autoclave. Cuando agar semisólido es requiere, reducir agar a 8 g / L. Cuando se enfrió a 50 ° C, añadir cloranfenicol hasta una concentración final de 30 g / ml. Este medio se denomina ahora como FMM CHL ^30. Como control para asegurar que los aislados fúngicos crecen en este medio, FMM debe ser made que el anterior pero que contiene 10 g de glucosa por litro. Esto se llama glucosa medio mínimo ³⁵ (GMM).
4. Solución salina tamponada con fosfato ³⁶ (PBS) se usa para suspender las partículas del suelo y de las células microbianas en la serie de dilución inicial de BDM del suelo-expuestas. Para hacer PBS, añadir 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, y 0,24 g de KH ₂ PO ₄ a 800 ml de agua destilada. Disolver sales y ajustar el pH a 7,4 con HCl. Llevar a un volumen total de 1 l con agua ultrapura. Llenar los tubos de cultivo limpio, con 9,5 ml y 4,5 ml de PBS por tubo. Autoclave.
5. 30% de glicerol (v / v) se usa para suspender las células criopreservadas bacterianas y de levadura, esporas y micelio de hongos durante el almacenamiento a -80 ° C. Haga esta solución en agua ultrapura. Autoclave.
6. 0,01% (v / v) de Triton X-100 se usa para suspender las esporas de hongos; el detergente actúa como un agente humectante no tóxico para las esporas hidrófobos. Disolver 100 l de Triton X-100 En 1 L de agua ultrapura. Autoclave.
7. Tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 7,2) se utiliza como disolvente para glutaraldehído durante la fijación SEM. Mezclar 68,4 ml de 1 M Na ₂ HPO ₄ y 31,6 ml de 1 M NaH ₂ PO ₄ y traer volumen total de 1 l con agua ultrapura ^36.

3. Preparación de los materiales de bioensayo: descontaminación de la superficie de la BDM Películas

1. Debido a los restos de contaminantes como el papel y la cinta en los utensilios de corte son potenciales fuentes de carbono, usar tijeras recién adquiridas o cuchillas de afeitar frescas, y una superficie inorgánica para el corte. Use guantes para evitar la contaminación de las películas de BDM con aceites de la piel. Cortar películas BDM en pequeños cuadrados (4,25 x 4,25 cm). Esta plaza tamaño cabe en un x 15 mm placa de Petri estándar de 100.
2. Utilice una lámpara germicida UV (longitud de onda de emisión = 253,7 nm) para descontaminar películas BDM. Esta lámpara se encuentra a menudo en un gabinete de bioseguridad estándar. Asegúrese de que cuandola luz UV está funcionando, no hay flujo de aire exterior en la cabina de bioseguridad que puedan contaminar las películas BDM.
3. Las superficies mojadas dentro de la campana con EtOH al 70% y dejar ventilador funcione durante 15 minutos para eliminar el aire. A continuación, cierre la hoja y descontaminar la superficie de la campana con UV durante 2 h.
4. Coloque las películas BDM en el capó descontaminado, en filas. Permite que la luz UV para brillar en películas durante 2 horas.
5. Utilice un paño limpio, pinzas esterilizadas para voltear las películas BDM. Comience en la primera fila y el trabajo de la fila de atrás para minimizar el tiempo que las manos y los brazos están justo encima de las superficies BDM recién descontaminados. Al voltear BDMs, coloque la parte recién desinfectar la baja sobre un área limpia expuesto a la luz UV, pero no previamente en contacto con el lado no desinfestados de la película.
6. Después de 2 horas de tratamiento UV en cada lado, retire las películas BDM de la cabina de bioseguridad con unas pinzas esterilizadas, nuevo trabajo de adelante hacia atrás para evitar la colocación de las manos y los brazos por encima ya de por descontaminaciónpelículas nados. Coloque las películas BDM en recipientes estériles y secos, cubiertos, tales como vasos de papel de aluminio cubiertas. Guarde a temperatura ambiente en la oscuridad.

4. Configuración del ensayo biológico, Plato

Realice todos los pasos en una campana de transferencia estéril utilizando una técnica aséptica.

1. Colocar las piezas BDM UV-desinfestadas en la superficie de placas de agar. Conjunto abajo una esquina primero, y dejar suavemente el resto del rollo cuadrado en contacto con el agar. Evite las arrugas. Algunas películas se forman arrugas como durante el almacenamiento, lo que es inevitable. Particularmente películas delgadas pueden requerir el uso de dos pinzas para tender la pieza plana.
2. Coloque las gotas de semisólidos FMM chl ³⁰ agar encima de la lámina de plástico para proporcionar una fuente de agua y de nutrientes para la colonización inicial de plásticos hidrófobos. Los granos no son necesarias para las películas permeables al agua. Vuelva a fundir el agar en el microondas, y utilizar una micropipeta para transferir cuatro 10 l gotas de agar fundido sobre el mantillo (uno en cada corner). No toque la punta de la pipeta directamente al abono ya que pueden perforar. No superar los 10 l por gota, porque el exceso de peso en el mulch puede tirar de plástico de la superficie de agar cuando las placas están invertidas.
3. Deje que los platos se sientan del lado derecho con las tapas en la noche para solidificar por completo, y luego almacenar mangas selladas agar hacia arriba a 4 ° C en la oscuridad. Cuando esté listo para realizar el bioensayo (Paso 7), utilizar i) una placa de FMM CHL ³⁰ (control negativo), ii) una placa de bioensayo que contiene 10 l cuatro gotas de semisólido FMM CHL ³⁰ en película de plástico, y iii) una placa de GMM (control positivo). De esta manera, cuatro repeticiones de cada aislamiento se puede probar por placa de medio.

5. Configuración del ensayo biológico líquido

1. Siga las instrucciones para el corte de BDM en el paso 3.1. Antes de cortar las películas de plástico para el bioensayo de líquido, elegir un tamaño que encaja en el tubo de cultivo.El área necesaria para lograr una masa uniforme entre los varios tipos de plástico dependerá del espesor de la película. Encontramos que las piezas equivalentes a 0,0175 g encajan bien en tubos de cultivo de 15 x 150 mm.
2. Superficie descontaminar las películas con la luz UV como se describe en el paso 3 anterior.
3. Para cada réplica de un microbiana aislar, preparar tres tubos para la inoculación: i) 5 ml FMM que contiene un fragmento de BDM del tamaño predeterminado (experimental), ii) 5 ml FMM con ninguna fuente de carbono (control negativo), y iii) 5 ml GMM (control positivo). Además, preparar replicar tubos de FMM que contiene cada uno de BDM para ser probado, pero no inocular ellos. Estos tubos de control revelarán cualquier crecimiento microbiano que resulta de la contaminación.

6. Aislamiento de hongos

Tras la incubación del suelo y retiro de la muestra, los hongos son aislados de la tierra que se adhiere a las películas BDM. Si se desea, las bacterias pueden simultaneouSly aislarse con el mismo método utilizando los medios apropiados para el aislamiento de las bacterias del suelo, tales como 1/10X diluida de agar de soja tríptica de levadura suplementado con 50 g / ml de cicloheximida para disuadir el crecimiento de hongos ^37. Cuando se requiere un medio definido para aislamientos bacterianos en los pasos 5 y 7, M9 ³⁸ (además de cicloheximida) es una buena opción.

1. Antes del procesamiento de la muestra, preparar PBS y PDA chl ^30. Permitir PDA chl ³⁰ placas se sequen (sin embolsar) a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 h para eliminar la condensación en los párpados y la superficie del agar. Pre-label PDA chl ³⁰ placas.
2. Excavar bolsas de malla con trozos BDM de enterramientos elegido en el paso 1. Enviar y almacenar a 4 ° C no más de 48 horas después de la extracción de la tierra.
3. Usando una espátula y pinzas estériles, retire suavemente el suelo hasta el plástico está expuesto pero no sacudir el suelo que se aferra a la superficie de la película BDM. Cortar película BDM en 1 cm2 piezas de hasta 0,5 g de material se recupera para cada una de cuatro repeticiones totales. Transferir 0,5 g película BDM y tierra unidos a tubos de cultivo de 25 ml que contienen 9,5 ml de PBS. Si el abono es completamente degradado o un control de sólo el suelo se está procesando, añadir 0,5 g de suelo para la PBS, y si es posible, elegir las piezas que aún están descoloridos del mulch residual.
4. Vortex los tubos de cultivo que contienen 9,5 ml de PBS y 0,5 g de mantillo durante 30 segundos a alta velocidad, se somete a ultrasonidos en un baño de agua a sonicación durante 10 min, y agitar de nuevo durante 30 segundos. La agitación se pretende romper los biofilms, retirar físicamente células embebidas en o adherirse a piezas mantillo, y crear una suspensión homogénea.
5. Prepárese para diluir en serie la solución PBS / suelo para obtener las unidades formadoras de colonias individuales de recubrimientos. Para cada muestra, lugar en una campana de flujo laminar un tubo de cultivo de llenado de 4,5 ml de PBS estéril. Para cada muestra, llenar tres pocillos de una placa de 96 pocillos de pozo profundo lleno de 450 l de PBS.
6. La suspensión de plástico / suelo original (0,5 g mantillo, más 9,5 ml de solución de PBS) representa un x 10 ^-2 dilución de material microbiano adherirse al plástico 5.0. Añadir 0,5 ml de suspensión de este tubo original a 4,5 ml de PBS estéril en un tubo de cultivo para obtener una dilución x 10 ^-3 5.0. Vortex durante 30 segundos a alta velocidad. Añadir 50 l a 450 l de PBS en la placa de 96 pocillos. Repita el procedimiento para todas las muestras / repeticiones. Use una pipeta multicanal para diluir las muestras en masa. Mezcle cada nueva dilución pipeteando arriba y abajo diez veces. Cambiar las puntas entre diluciones. Hacer diluciones de hasta 5,0 x 10 ^-6.
7. (Opcional) Aislados bacterianos fueron más abundantes que los aislados fúngicos en las muestras descritas en este documento, por lo que si aislar simultáneamente bacterias, a continuación, realizar diluciones en serie de hasta 5 x 10 ^-8 en el paso por encima de 6,6.
8. Repartir uniformemente 100 l de cada uno de los 5,0 x 10 ^-3 a través de la 5,0 x 10 ^-6diluciones través de la superficie del agar PDA chl ³⁰ placas con llama esterilizados varillas de vidrio dobladas. Tienda de placas en posición vertical durante 30 minutos para dejar que penetre en el líquido, a continuación, sellar las placas con Parafilm para evitar el escape de las esporas a partir de aislados no identificados. Incubar las placas invertidas a 20 ° C en la oscuridad durante 5 días para permitir que ambos hongos rápidas y de crecimiento lento para formar colonias.

7. La selección inicial de Hongos plástico que degradan

Importante: Todos los cultivos de este punto en adelante deben ser abiertos solamente en una cabina de bioseguridad (no una campana de flujo laminar) para evitar la contaminación del medio ambiente con esporas de identidad desconocida. Algunos hongos y bacterias del suelo son potenciales patógenos humanos.

1. Examinar las placas de dilución contienen colonias bien aisladas. Seleccione una colonia que no está en contacto con otra colonia.
2. Usando un solo palillo estéril, toque suavemente y entonces colonia tocar el agar de FMM (hecho en el paso 2.3 ), FMM + plástico (hecho en el paso 4) y GMM (hecho en el Paso 2.3) placas, en ese orden. Para inocular perlas de agar encima de películas de plástico, frotar suavemente el palillo de dientes en la superficie del punto de agar y luego deslizar a través de la película de plástico. Repita la inoculación de la misma colonia de origen hasta que hay cuatro vetas replicados en cada placa.
3. Repita los pasos 7.1 a 7.2 hasta varias repeticiones de cada tipo de colonia visual única se seleccionan de cada muestra BDM.
4. Placas de sello con Parafilm, invertir, y se incuba a 20 ° C en la oscuridad durante 5 días.
5. Identificar cepas que crecen en BDMs mejor que crecen en FMM. Si el crecimiento no es obvia, ver la muestra bajo un microscopio de disección para verificar la colonización o la falta de ella (Figura 1). Mantenga la tapa, si la tapa tiene condensación, cámbiela por una nueva tapa, pero hacerlo en la cabina de bioseguridad.
6. Una vez que los posibles microorganismos degradadores BDM se seleccionan, utilizan comoterile palillo de dientes para raspar inóculo del hongo colonizar el propio plástico, y consecutivas para el aislamiento de colonias formadoras de unidades individuales en placas de PDA chl ^30.
7. Placas de sello con Parafilm y se incuban PDA chl ³⁰ placas inoculadas con aislamientos plásticos que degradan a 20 ° C durante 5 días en la oscuridad.
8. Ahora que las colonias aisladas individuales se purifican, asegúrese de que son realmente capaces de colonizar las películas de plástico que se están probando. Recoger inóculo (esporas, células de levadura, o hifas) de una unidad formadora de colonias solo con un palillo de dientes estéril. Repita los pasos 7.2 a 7.5. Después de 5 días de incubación a 20 ° C, examinar las placas de bioensayo para el crecimiento de hongos. Si el aislar crece en una película BDM mejor de lo que crece en FMM tanto en el primero (7.5) y segunda (7.8) ensayos, a continuación, almacenar el aislado como se describe a continuación en el Paso 8.

8. Almacenamiento a largo plazo de microorganismos degradadores de plástico

En general, los aislados de plástico de degradación se ensayaron en el bioensayo de la placa (7.5), volvió a purificar a las unidades formadoras de colonias aisladas individuales (7,6), probados en la placa de bioensayo de nuevo (7,8), y finalmente, se prueban en el bioensayo líquido ( 9.1 a 9.5). Durante las pruebas, los aislados deben ser transferidos a medio fresco cada mes y placas madre de trabajo se almacenaron a 4 ° C tan pronto como un crecimiento suficiente es visible. Los aislamientos también deben almacenarse como existencias de glicerol a -80 ° C, y / o en forma de esporas secas en discos de filtro estériles a 4 ° C. A continuación se describen dos métodos de almacenamiento.

1. Para cada cepa que crecía sobre una película BDM mejor de lo que creció en FMM tanto en el primero (7.5) y segunda (7.8) bioensayos placa, preparar dos placas de PDA chl ³⁰ con dos o tres discos de papel de filtro esterilizado, aproximadamente 1 cm de diámetro , en la superficie. Inocular a partir de estas dos placasla misma colonia individual elegido en el paso por encima de 7,8. Hacer un césped mediante la difusión de inóculo de manera uniforme sobre el agar para maximizar el crecimiento. Sellar las placas con parafilm y se incuba a 20 ° C durante 5 días. Este paso puede iniciarse simultáneamente con la etapa 7.8 para la eficiencia.
2. El disco de filtro sobre la superficie del agar debe estar cubierta con micelio / esporas. Retire los discos de filtro de la superficie de agar con unas pinzas esterilizadas, y colocarlo en un tubo Eppendorf estéril. Secar las placas filtrantes durante la noche en el interior de los tubos Eppendorf (con la tapa fuera) en un gabinete de seguridad biológica u otro ambiente seco, estéril con un mínimo movimiento de aire para evitar la contaminación cruzada. Luego sellar con Parafilm y se almacenan a 4 ° C.
3. Use un hisopo de algodón estéril o un palillo para recoger las esporas y micelios de las placas de césped. Suspender las esporas e hifas en el 30% de glicerol en crioviales, flash a congelar en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.

9. Co estrictanfirmation de la utilización de plástico a través del ensayo biológico líquido

1. Generar esporas frescas y / o las células con la que para inocular cultivos líquidos: inocular placas de PDA chl ³⁰ con esporas de cepas potenciales degradantes de plástico. Sellar las placas con Parafilm, y se incuba a 20 ° C hasta que las esporas de hongos son visibles.
2. En una cabina de bioseguridad, las esporas de la cosecha por el lavado de la placa con 0.01% de Triton X-100 (5 ml por 15 x 100 mm de placa de Petri funciona bien) y fregar las esporas (o células de levadura) de la superficie con una varilla de vidrio estéril doblada- . Aspirar esporas (o células) de suspensión y la transferencia en un recipiente estéril.
3. Contar las esporas o células con un hemocitómetro y determinar el volumen adecuado para añadir a 5 ml de caldo de FMM para un total de 1 x 10 ⁶ esporas / tubo. El volumen debería ser inferior a 10 l. La dilución de suspensiones de esporas concentradas en 0,01% de Triton X-100 puede ser necesario.
4. En una campana de transferencia estéril, inocular tubos de cultivo preparados en Paso 5 con 1 x 10 ⁶ esporas (o células de levadura). Sellar las tapas con Parafilm para evitar cualquier fuga de esporas, en particular para los aislados no identificados. Incubar en la oscuridad a 20 ° C y examinar muestras semanales para el crecimiento.
5. El crecimiento del micelio de los hongos en las películas de plástico puede ser visible dentro de la primera semana después de la inoculación, especialmente en los bordes de las láminas de plástico. Para las levaduras planctónicas (como se evidencia por los medios de comunicación nublados), el crecimiento puede ser monitoreado por las lecturas de densidad óptica a 600 nm. Debido a que los hongos son propensos a conectar directamente a la película de plástico, el crecimiento puede ser evaluado por el ojo, y puede ser confirmada por microscopía de luz y / o microscopía electrónica de barrido (SEM).
6. En FMM-sólo los controles, buscar manchas blancas minúsculas que son demasiado pequeños para registrar un cambio en la densidad óptica utilizando métodos espectrofotométricos. Estas manchas se pueden aspirar con una pipeta Pasteur y se observaron usando microscopia de interferencia diferencial (DIC). Las manchas son a menudo inidentificable precisiónPitate, pero en algunos casos pueden ser grupos de la inoculante original que había germinado pero no crecido sustancialmente.
7. Use las observaciones visuales y microscópicos para comparar la colonización de las muestras experimentales y controles, y asignar calificaciones al crecimiento en cada muestra de película BDM. Debido a que muchos BDMs son de color oscuro y permiten la observación mínima a través de microscopía, excepto en los bordes, y el espesor de la película prohíbe la observación bajo una lente de inmersión en aceite, SEM es útil para estimar i) la presencia de crecimiento microbiano, por ejemplo, a través del sistema de clasificación descrito en Tabla 1, y ii) el alcance de la degradación de BDM.

10. Preparación de la muestra SEM

1. Use tijeras limpias y estériles para cortar pequeños trozos de BDM de muestras replicadas. Fijar BDM por inmersión en glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 7,2) durante 24-48 h.
2. Mientras que la fijación se está produciendo, deshidratar etanol puro al 100% mediante la adición de 5-10% VOlume 3 Å tamiz molecular (que se activa en una estufa a 175-260 ° C y se enfrió en un desecador) y dejar reposar a temperatura ambiente durante la noche para asegurar la deshidratación total.
3. BDMs Sumergir en tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 7,2) para cuatro lavados de 15 min cada uno.
4. BDMs Sumergir en agua ultrapura para tres lavados de 5 minutos cada uno.
5. Deshidratar muestras BDM en una serie de etanol, inmersión durante 20 minutos a cada concentración: 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, y 100%. Enjuague BDMs dos veces más en etanol al 100% durante 20 minutos por enjuague.
6. Muestras de sujetos a secado de punto crítico y recubrimiento por pulverización catódica.

Resultados

En un estudio reciente ^24, cuatro repeticiones cada uno de tres BDMs disponibles comercialmente etiquetados como "biodegradable", además de un cine experimental y un control convencional de plástico, fueron colocados sobre el suelo como abono orgánico para la producción de tomate en la primavera de 2010 en Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, y Lubbock, TX. En el otoño de 2010, las plazas de cine BDM fueron cortadas de cada resistido mulch en cuatro parcelas de reproducción, y el suelo nativo fue ...

Discusión

El procedimiento descrito en este documento representa una técnica de primer paso para el aislamiento de microorganismos degradadores potenciales BDM del suelo, y se utilizó con éxito para aislar los hongos de BDM enterrados en el suelo durante siete meses. Los hongos crecieron cuando se inoculó sobre el material de BDM fresco del mismo tipo, lo que indica que los hongos aislados eran de hecho colonizadores, y que las películas no fueron inhibitorios para el crecimiento de hongos. Aislamiento de los hongos que degr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents