בידוד של מיקרואורגניזמים באדמה אינדיאני עם פוטנציאל לפירוק סרטים מאלצים פלסטיק מתכלים המשמש בחקלאות

Summary

סרטי פלסטיק שכותרתו "מתכלה" זמינים מסחרי לשימוש חקלאי כmulches. עבוד האדמה מייצגת שיטת סילוק אטרקטיבית, אבל השפלה בתנאי שדה הוא הבין היטב. מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח שיטות לבידוד פטריות וחיידקים אדמת מולדת שליישב סרטים מאלצים פלסטיק לאחר קבורת שדה.

Abstract

פטריות ילידים לקרקעות חקלאיות שיישבו מאלץ (BDM) סרטים מתכלים זמינים מסחרי היו מבודדות והעריכו לפוטנציאל לבזות פלסטיק. בדרך כלל, כאשר ניסוחים של פלסטיק ידועים ומקור לחומרי גלם זמין, יכול להיות מושעה פלסטיק אבקה בתקשורת מבוססת אגר והשפלות שנקבעו על ידי הדמיה של אזורי סליקה. עם זאת, גישה זו מחקה בצורה גרועה בשפלה באתרו של BDMs. ראשית, BDMs אינם מפוזר כחלקיקים קטנים ברחבי מטריצת האדמה. שנית, BDMs לא נמכרים מסחרי כמו פולימרים טהורים, אלא כסרטים המכילים תוספים (חומרי מילוי, plasticizers וצבעים למשל) שעשוי להשפיע על התפתחותם של חיידקים. את ההליכים המתוארים במסמך זה שמשו למבודד שנרכש מהאדמה קבורה סרטים מאלצים. מבודדת פטרייתיים נרכשו מBDMs נחפר נבדקו בנפרד לצמיחה על פיסות BDMs החדש, שהונחו על גבי disinfested בינונית מוגדרים המכיל לא דואר פחם מקורxcept אגר. מבודדים שצמחו על BDMs נבדקו נוסף במדיום נוזלי בי BDMs היה מקור פחמן הוסיף הבלעדי. אחרי כעשרה שבועות, קולוניזציה פטרייתי והשפלה BDM הוערכו על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. מבודד זוהו באמצעות ניתוח של רצפי גנים RNA ריבוזומלי. דו"ח זה מתאר שיטות לבידוד פטרייתי, אבל גם חיידקים היו מבודדים תוך שימוש בשיטות אלה על ידי החלפת מדיה מתאימה לחיידקים. המתודולוגיה שלנו צריכה להיות שימושית עבור מחקרים חוקרים פירוט של סרטי פלסטיק שלמים או מוצרים שחומרי גלם פלסטיק הם או ידועים או שאינם זמינים. עם זאת הגישה שלנו אינה מספקת שיטה כמותית להשוואת מחירים של השפלה BDM.

Introduction

השפלה היסטורי נחשבת תכונה לא רצויה של פולימרים פלסטיק, כי התמוטטות מקצרת את תוחלת החיים של מוצר ועמידות. לאחרונה, מודעות לבעיות הסביבתיות שהוצגו על ידי פסולת פלסטיק בסביבה הטבעית ^1,2,3 הפכה פלסטיק מתכלה חלופה אטרקטיבית לחומרים פלסטיים קונבנציונליים. השפלה (שהוגדר כשינויים מבניים, פיצול, והפחתה במשקל מולקולרי, יושרה, וכוח ^4,5) מתרחשת דרך סדרה של אירועים, כולל שני התהליכים אביוטי (תרמית מתח, צילום חמצון, הידרוליזה, שחיקה ולחץ מכאני), והשפלה ביולוגית ^6. בעוד תהליכים אביוטי יכולים לשנות את הגודל והמאפיינים של שבר פלסטיק, מיקרואורגניזמים נחוצים למינרליזציה האולטימטיבית שלהם למים ופחמן דו חמצני (בתנאים אירוביים) ו / או מתאן (בתנאים אנאירוביים).

נישה משמעותית עבור פלסטיק מתכלה קיים בחקלאות, שבו mulches פלסטיק משמש כדי למנוע צמיחת עשב, כדי לשמור על לחות קרקע ולהגדיל את טמפרטורת קרקע ^7,8. מאות אלפי דונמים בארצות הברית לבדה מכוסים בפלסטיק mulches ^9, כולל mulches מורכב מפלסטיק מתכלה. בעקבות עונת גידול יבול, האפשרויות לסילוק mulches מתכלה (BDMs) כוללות סילוק במזבלה, שריפת אנרגיה להתאוששות ^10, השפלה באמצעות קומפוסט, או השפלה באדמה אחרי החריש ^11. מבין אלה, הגורל עתיר עבודה לפחות הוא חורש BDMs לתוך האדמה, אך ללא השפלה יעילה ומינרליזציה במהלך חודשים שאינם הצומח (בדרך כלל בחורף), שברי פלסטיק יכולים להישאר ולהפריע לציוד חקלאי בחריש באביב ובשתילה, ו להתמיד בסביבה שבה הם להשפיע באופן משמעותי חיות הבר, מפעל חיים, וחיידקי ^1,2,3,10.

ss = "jove_content"> למרות שמוצרי פלסטיק רבים, כוללים סרטים מאלצים חקלאיים, לשאת את התווית "מתכלה" או "compostable", בפועל, השפלה ומינרליזציה עשויה להיות לא יעילים ו / או לא מלאים מדי מכדי שפירוק ב- אדמה להיות חלופה לסילוקם של מוצרים אלה. לדוגמה, פוליאתילן אוקסו מתכלה השיג רק 12.4% מינרליזציה לאחר שנה אחת של בליה ושלושה חודשים שלאחר מכן ב58 מעלות צלזיוס קומפוסט, ופחות ממחצית הסכום ששל מינרליזציה התרחש כאשר טמפרטורת הקומפוסט הייתה 25 מעלות צלזיוס ^12. בחורף, טמפרטורת קרקע ברוב המקומות תהיה נמוכה יותר מאשר באחת מהטמפרטורות האלה, וכתוצאה מן הסתם בפעילות חיידקים אפילו נמוכה יותר וכתוצאה מכך, פחות מינרליזציה. בנוסף להאטת שיעורי השפלה, שימוש לרעה במושג "מתכלה" הובילה לחוסר אמון של מוצרים אלה על ידי צרכני ^13,14, כולל אלה בתעשייה החקלאית. פירוק ביולוגי הוא הגיורשל פולימרים לפחמן דו חמצני (ו / או מתאן) ומים ¹⁴ טבעיים המתחוללים על ידי מיקרואורגניזמים ^4. לכן, יש למדוד פירוק ביולוגי כימי; העמותה הפיסית של מיקרואורגניזמים עם מצע אינה מעיד השפלה המיקרוביאלי של חומר זה.

כחלק ממאמץ לבחינת שימוש בר קיימא של BDMs בחקלאות, מחקר זה התמקד בגילוי מיקרואורגניזמים ילידים לקרקעות חקלאיות שליישב ולבזות BDMs, זמין מסחרי. שיטות בדיקה סטנדרטיות כבר פורסם למדידה כימית הפירוט של פלסטיק מתכלה באמצעות אביוטי וביולוגי ^15,16,17. עם זאת, שיטות אלה אינן מטפלות בשפלה של פלסטיק על ידי מינים של חיידקים בודדים, או לספק שיטות לבידוד שלהם. מתודולוגיה דומה בזאת באופן הדוק יותר שיטות סטנדרטיות שנועדו להעריך את הפלסטיק לעמידות לחיידקים לאחר התמוטטות inoculating דגימות עם נבגי פטריות18,19.

כאשר ניסוחים של פלסטיק ידועים ומקור לחומרי גלם זמין, יכול להיות מושעה פלסטיק אבקה בתקשורת מבוססת אגר והשפלות שנקבעו על ידי הדמיה של סליקת אזורים ^13. בשיטה זו נעשתה שימוש בעבר כדי לזהות מיקרואורגניזמים שפוגעים בפולימרים כגון פוליאוריטן, ²⁰ פולי-(butylene succinate-CO-adipate) ^21, ופולי (חומצה לקטית) ^22. שיטה דומה כרוכה בהשעיית פלסטיק אבקה טהורה במדיום נוזלי שבו הפלסטיק הוא מקור פחמן היחיד ^20,23. אמנם יש לי שיטות אלה יתרון של מערכת מוגדרת, הם מחקים בצורה גרועה בשפלה באתרו של BDMs. ראשית, שטח הפנים הוא מופץ באופן שונה בגלל BDMs אינם מפוזר בחלקיקים קטנים ברחבי מטריצת האדמה, אלא נמכר ומשמש כסרטים. שנית, את המבנה הכימי של BDMs שונה מפולימרים טהורים. BDMs בדרך כלל מכיל תוספים כגוןחומרי מילוי, plasticizers, וצבע, ותוספים אלה עלולים להשפיע על התפתחותם של חיידקים ועל ידי כך, השיעור של מינרליזציה. מסיבה זו, ובגלל ההרכב של סרטים מסחריים מסוימים במחקר זה היה סרט קנייני, פלסטיק בשדה הטופס המוכן שלה נוצל לבודד את פטריות וחיידקים. לשם פשטות, השיטות שלהלן מתוארות רק לפטריות, עם שינויים שבו ציינו מתאים לבידודי חיידקים.

במחקר שנערך לאחרונה ^24, שלוש BDMs, זמין מסחרי וקולנוע ניסיוני אחד שמשו באתרים חקלאיים בשלושה אזורים של ארצות הברית שונות לעונה גידול אחת, ולאחר מכן הניח ברשת (250 מיקרון) שקיות ונקברו לחורף אחד באדמה באותם אתרים. 250 פתחי רשת מיקרון לאפשר קורי פטרייה לחדור תוך נטרול שורשים ורוב בעלי חיים אדמה, ומזעור הסגת גבול אדמת ^25,26. חומרי ניילון למנוע השפלה שקית באדמה. בעקבות חפירה, Fמבודדת ungal היו התאושש מחתיכות BDM והעריך לצמיחה על מדיום מינימאלי ללא מקור פחמן פרט לאגר ו5 ס"מ x רבוע משטח disinfested 5 ס"מ של סרט BDM חדש, שאינו בשימוש, שהיה מראש disinfested. לא יכול להיות autoclaved רוב הפלסטיק המשמש כסרטים ללא אובדן של יושרה, ולכן אור UV שימש כדי להרוג את כל תאי חיידקים המתגוררים על חלקי הפלסטיק. ISO 846 ¹⁹ ממליצה משטח disinfesting באתנול 70% וייבוש שלאחר מכן, אבל אם משתמש בשיטה זו, יש לוודא ששום מרכיב או תוסף של הסרט מושפע לרעה על ידי אתנול. מאז BDMs ככל הנראה מיוצרים כדי לעמוד באור שמש, קרינת UV נבחר כשיטת טיהור.

מבודדים שצמחו על BDM חתיכות טובות יותר מאשר במדיום מינימאלי בלבד, שנבחרו למחקר נוסף. אגר, פוליסכריד המיוצר על ידי אצות ימיות, משמש כדי לחזק את התקשורת של חיידקים משום שהוא בדרך כלל לא מנוצל על ידי חילוף חומרים חקלאי ורפואי לאמיקרואורגניזמים יכולים, עם זאת, האנזימים אגר hydrolyzing היו מבודדים מחיידקים ימיים ²⁷ וחיידקים אגר hydrolyzing יש גם מבודדים מהקרקע ^28. פולימרים ואגרו BDM שניהם צפויים להיות מצעים נדירים לאנזימים מופרשים על ידי פטריות קרקע, שלא התפתחו בסביבות המכילות פולימרים אלו כמקורות תזונתיים פוטנציאליים, אך שני מצעים נמצאים במבדק הצלחת תואר לעיל (שלב 7). יכולים להיות מובחנות המשתמשות בפטריות BDMs אך לא אגר כמקור פחמן מפטריות המשתמשות אגר בלבד, על ידי השוואת צמיחה באגר הגדילו מדיום המכיל i) מקור פחמן הוסיף שום פרט אגר (ביקורת שלילית), ii) BDM סרטים (ניסיוני) וIII) גלוקוז (ביקורת חיובית). צמיחה של כל הבידודים צפויה על מדיום בתוספת סוכר מינימאלי; פטריות לא נוצרו ברמת סוכר המכיל לוחיות עשוי שלא להיות מסוגל צמיחה על המדיום מינימאלי המסוים בשימוש בניסוי. Potentiאל BDM degraders צריך לגדול על אגר הגדילו מדיום מינימאלי + סרט BDM טוב יותר מאשר הם גדלים על אגר הגדילו מדיום מינימאלי בלבד. פטריות גדלות על צלחות בינוניות מינימאליות הן אגר degraders או oligotrophs, וגם צפויים לגדול על אגר קשור עם סרטי BDM במבדק צלחות, אבל לא על הסרטים עצמם (אלא אם כן הם serendipitously גם להשפיל פולימרים BDM).

כדי לשלול את האפשרות לראות את התפתחותם של חיידקים כתוצאה מניצול של אגר ולא של BDMs, אנחנו אחרי assay הראשוני שלנו להתיישבות BDM על צלחות אגר עם מבדק במדיום מרק מוגדר (שלב 9). BDM חתיכות ייצגו את מקור פחמן הידוע רק בצינורות המבדק.

לאחר הסינון הראשוני, ועל החייאת מניות גליצרול של הבידודים, קצת יצר mycelia מועט אך גלוי במדיום נוזלי מוגדר המכיל מקור פחמן לא ידוע. תוצאות אלו הציעו כי חלק מהבידודים שנרכשו היו oligotrophs - אורגניזמים שגדלים על ידי הדחה כמויות קטנות מאוד של פחמן, חנקן, וחומרים מזינים אחרים מומסים או בסביבה המימית או קיימים כנדיפים באוויר ^29,30,31. זיהוי מינים באמצעות ניתוח ה-DNA ריבוזומלי 18S תמך בדעה זו, כפי שרבים מבידודי בהתאמה סוגי פטריות שדווחו בעבר להציג oligotrophy ^32. Oligotrophs, שהם בדרך כלל saprophytes, דורש מגוון רחב של יכולות מטבוליות לניצול מצע במגוון של סביבות ^30. לפיכך, אין זה מפתיע שאותם הפטריות שאנו מבודדים מBDMs (הדורש מן הסתם יכולות אנזימטיות חריגות) הפגינו יכולות oligotrophic, והצליחו לגדל במזהמי קורט כגון שמנים מעור טביעות אצבעות, אבק, או נדיפים קורט באוויר. בשל בידודו של oligotrophs, הגיע למסקנה כי צמיחה על משטח BDM לבדו לא יכול לשמש כדי להסיק התמוטטות BDM. השיטות שתוארו במסמך זה משקף את מאמצינו לSCמתיישבי BDM ילידים ירוקים מקרקעות חקלאיות להתמוטטות BDM בתום לב.

Protocol

הליך זה דורש לפחות כמה חודשים לדגירה של סרטי BDM בקרקע, ועוד מספר חודשים לbioassays רציף גם על צלחות אגר ובמרק ללא אגר, הגדרה כימית להעריך קולוניזציה והשפלה. שיטות אישיות רשומות על פי הסדר שהם יבוצעו.

1. דגירה של סרטי BDM באדמה

לשלב סרטי BDM לאדמה בתנאים יועתקו מתחתו הם יהיו צפויים לבזות. לרכוש 400 גרם (שווה ערך משקל יבש) של אדמת תושב וכריך ס"מ x 10 ס"מ BDM 10 עם האדמה בתוך רשת 13 x 13 ס"מ ניילון (250 מיקרון) תיק. לסגור עם חוט ניילון. פעמים דגירה הן בשיקול דעתו של הנסיין. צג ו / או לשנות את הפרמטרים רלוונטיים לפעילות חיידקים (למשל קרקע טמפרטורה, חומרי הזנה ולחות) במרווחים קבועים לאורך תקופת הדגירה כמתאימה.

2. הכנה של מדיהוריאגנטים

כדי למנוע החדרת מקורות תזונתיים בטעות לתקשורת ובצינורות התרבות, להשתמש בחומרים כימיים מגיב בדרגה, צינורות תרבות חדש שנרכשו, סוגי המים ultrapure (למשל NanoPure), וכלי זכוכית מקפידה שטופות לתקשורת ערבוב. הימנע מזיהום צולב של חומרים כימיים - עדיף להשתמש בערכה ייעודית של חומרים כימיים ומוצרי זכוכית למטרה זו. שים לב שזה אפשרי, כי פטריות עשויות להיות מבודדות הצמיחה שלו הוא מעוכב על ידי מרכיב בחומרים הכימיים המפורטים להלן. במקרה כזה, ייתכן שיידרש כמה אופטימיזציה.

1. לפני ביצוע תקשורת, לשטוף את כל כלי הזכוכית הכרחית עם חומר ניקוי מעבדה ולאחר מכן לשטוף את החומצה (למשל להשרות למשך הלילה ב10% HCl). יש לשטוף את מינימום של שנים עשר פעמים במים מזוקקים ופעמים במי ultrapure. לכסות את כל כלי הזכוכית עם רדיד אלומיניום נקי להוציא אבק. לבש כפפות ולהימנע מלגעת בפנים ובקצוות של כלי להוציא שמני עור מטביעות אצבעות. כדי להימנע מכל סבון רזהדמי חבר ושריטות בזכוכית המאפשרות קולוניזציה, פטריות תרבות בצינורות תרבות זכוכית חדשה שנרכשו (שאינם בשימוש), שטופים וautoclaved וכובעים.
2. אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) משמש לבידוד הראשוני של פטריות מאדמה, ולהקמת מושבות מבודדות בודדות והדור של הבידוד לאחסון לטווח ארוך. הכן את אמצעי התקשורת על פי הוראות היצרן ולאחר מעוקר (כאשר התקררו ל -50 מעלות צלזיוס), להוסיף chloramphenicol (מפתרון מניות מ"ל 10 מ"ג / בEtOH) לריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל, שלא לכלול חיידקים. בינוני זה עכשיו מכונה PDA CHL ^30.
3. מדיום מינימאלי פטרייתי (FMM) משמש כבסיס מוצק לBDMs מחוסן עם degraders פלסטיק פטרייתיים פוטנציאלי. מלבד אגר (כאשר משתמשים בו כדי לחזק את המדיום), הוא נטול פחמן. לכ -800 מ"ל של deionized H ₂ O, להוסיף 6.0 גר _'3 Nano, 0.52 גרם KCl, 0.52 גרם MgSO ₄ · 7H1 אלמנטי פתרון מניות העקבות של מיליליטר הוטנר (2.2 גר 'ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1.1 גר' H ₃ BO _3, 0.5 גר 'MnCl ₂ · 4H ₂ O, 0.5 גרם FeSO ₄ 2 O, גרם KH ₂ PO 1.52 _4, ו· 7H ₂ O, G CoCl ₂ · 5H ₂ O, G CuSO ₄ · 5H O, 0.11 גר _'2 (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O, ו 5.0 G Na ₄ EDTA ב 100 מ"ל מזוקק H ₂ O 0.16 0.16 ^{33 , 34.} התאם את ה-pH ל 6.5 באמצעות NaOH, ולהביא את הנפח ל '1 למבדק הנוזלי, מסנן לעקר FMM כדי למנוע משקעים של מלחים. אם מדיום מוצק הוא רצוי, להוסיף אגר גרם 16 וחיטוי. כאשר אגר מוצק למחצה הוא נדרש, להפחית אגר עד 8 ​​גר '/ ל' כשהתקרר עד 50 מעלות צלזיוס, להוסיף chloramphenicol לריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל. בינוני זה עכשיו מכונה FMM CHL ^30. כמו שליטה על מנת להבטיח שבודד פטריות לגדול ב המדיום הזה, FMM צריך להיות MAדה כאמור לעיל, אך המכילים גרם גלוקוז 10 לליטר. זה נקרא גלוקוז מדיום מינימאלי ³⁵ (GMM).
4. מלוח פוספט שנאגרו ³⁶ (PBS) משמש להשעות חלקיקי אדמה ותאים של חיידקים בדילול הסדרה הראשוני של BDMs אדמה חשופה. כדי להפוך את PBS, להוסיף 8 גרם NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 גרם Na ₂ HPO _4, ו _-4 כדי 800 מיליליטר 0.24 גרם KH ₂ PO של מים מזוקקים. ממיסים מלחים ולהתאים את pH 7.4 עם HCl. להביא את הנפח הכולל עד 1 ליטר עם מים ultrapure. מלא צינורות תרבות נקיים עם 9.5 מ"ל ו -4.5 מ"ל PBS לכל צינור. חיטוי.
5. 30% גליצרול (V / V) משמש להשעות תאי cryopreserved חיידקים ושמרים, נבגים ותפטיר פטרייה במהלך האחסון ב -80 ° C. להפוך את הפתרון הזה במי ultrapure. חיטוי.
6. 0.01% (V / V) טריטון X-100 משמש להשעות נבגי פטריות; חומר הניקוי פועל כסוכן הרטבה אינו רעילה לנבגים הידרופובי. ממיסים 100 X טריטון μl-100 ב1 ליטר של המים ultrapure. חיטוי.
7. 0.1 חיץ פוספט נתרן M (pH 7.2) משמש כממס לglutaraldehyde במהלך קיבעון SEM. לערבב 68.4 מ"ל של M Na ₂ HPO 1 ₄ ו 31.6 מ"ל של 1 M אא ₂ PO ₄ ולהביא את נפח הכולל עד 1 ליטר עם ultrapure מים ^36.

3. הכנת חומרי מבדק: טיהור שטח של סרטי BDM

1. בגלל שאריות של חומרים מזהמים כמו נייר וקלטת בכלי חיתוך הן מקורות פחמן פוטנציאליים, להשתמש במספריים שזה עתה רכש או סכיני גילוח טריים, ומשטח אורגני לחיתוך. לבש כפפות כדי למנוע זיהום של סרטי BDM עם שמני עור. לחתוך סרטי BDM לריבועים קטנים (4.25 ס"מ x 4.25). ריבוע בגודל כזה מתאים ל100 x 15 מ"מ צלחת פטרי סטנדרטי.
2. השתמש במנורת UV קוטלת חיידקים (פליטת אורך גל = 253.7 nm) כדי לטהר סרטי BDM. כגון מנורה נמצאת לעתים קרובות בארון biosafety סטנדרטי. ודא כי כאשראור UV פועל, אין זרימת האוויר חיצוני לתוך ארון הבטיחות הביולוגי שעלולים לזהם את סרטי BDM.
3. משטחים רטובים בתוך מכסה המנוע עם EtOH 70% ולתת מפוח לרוץ במשך 15 דקות כדי לשטוף אוויר. לאחר מכן, סגור את האבנט ולטהר את שטח מכסה המנוע עם UV במשך שעה 2.
4. מניחים את סרטי BDM במכסת המנוע לחטא, בשורות. לאפשר אור UV לזרוח על סרטים במשך שעה 2.
5. השתמש במלקחיים נקיים, מעוקרים כדי להעיף את סרטי BDM. תתחיל בשורה הראשונה והעבודה לשורה האחורית כדי לצמצם את הזמן שידי והזרועות נמצאות ישירות מעל משטחי BDM עתה לחטא. כאשר רפרף BDMs, הנח את הצד שזה עתה disinfested כלפי מטה על אזור נקי נחשף לאור UV, אבל לא קודם לכן במגע עם הצד הלא disinfested של הסרט.
6. לאחר 2 שעות של טיפול קרינת UV בכל צד, הסר את סרטי BDM מארון biosafety עם מלקחיים סטריליים, שוב עובד מ מלפנים לאחור כדי למנוע הצבת ידי והזרועות שכבר מעל decontamiסרטים מעוטרים. מניחים את סרטי BDM לתוך מכולות סטריליים, יבשות, מכוסה כגון כוסות נייר אלומיניום מכוסות. אחסן על RT בחושך.

4. התקנת צלחת מבדק

לבצע את כל השלבים במכסת מנוע העברת סטרילי באמצעות טכניקה מזוהם.

1. הנח את חתיכות BDM UV-disinfested על פני השטח של צלחות אגר. הגדירו את אחת פינות ראשונה, ובעדינות תן את שארית הלחמנייה מרובעת במגע עם אגר. למנוע קמטים. סרטים מסוימים יהוו קמטים כבמהלך אחסון, זה בלתי נמנע. במיוחד סרטים דקים עשויים לדרוש שימוש בשני מלקחיים על מנת להניח את פיסה שטוחה.
2. חרוזים מקום של אגר מוצק למחצה FMM CHL ³⁰ על גבי סרט הפלסטיק כדי לספק מים ומקור תזונתי להתיישבות ראשונית של פלסטיק הידרופובי. חרוזים שאינם נחוצים עבור סרטים חדירי מים. Re-להמס את אגר במיקרוגל, ולהשתמש micropipettor להעביר ארבע 10 טיפות של μl אגר מותך על מאלץ (אחד בכל corנר). אל תיגע בקצה פיפטה ישירות למאלץ כפי שהוא עלול לנקב. לא יעלה על 10 μl לכל טיפה, בגלל משקל עודף על מאלץ יכול למשוך פלסטיק מעל פני השטח, כאשר אגר צלחות הפוכות.
3. בואו הצלחות לשבת בצד ימני של דבר עם מכסים בלילה כדי לחזק לחלוטין, ולאחר מכן לאחסן שרוולים אטומים אגר בצד עד שעת 4 ° C בחושך. כאשר מוכן לביצוע המבדק (שלב 7), השתמש) צלחת אחת FMM CHL ³⁰ (ביקורת שלילית), ii) צלחת מבדק אחד המכילה ארבע 10 טיפות של μl מוצק למחצה FMM CHL ³⁰ בסרט פלסטיק, וIII) צלחת אחת GMM (ביקורת חיובית). בדרך זו, ארבע חזרות של כל הבודד יכולות להיבדק לכל צלחת של מדיום.

5. הגדרת מבדק נוזלית

1. בצע את ההוראות לחיתוך BDM בשלב 3.1. לפני חיתוך סרטי פלסטיק למבדק הנוזלי, לבחור גודל שמתאים לתוך צינור התרבות.השטח הדרוש כדי להשיג מסה אחידה בין כמה סוגי פלסטיק יהיה תלוי בעובי השכבה. מצאנו כי חלקים שווי 0.0175 גרם משתלבים היטב ב15 150 צינורות תרבות מ"מ x.
2. Surface-לטהר סרטים עם אור האולטרה סגול כמתואר בשלב 3 לעיל.
3. ללשכפל כל אחד מחיידקי בודד, להכין שלושה צינורות לחיסון: ט) מיליליטר FMM 5 המכיל בר BDM של גודל קבוע מראש (ניסיוני), ii) FMM 5 מ"ל ללא מקור פחמן (ביקורת שלילית), וג) 5 מ"ל GMM (ביקורת חיובית). בנוסף, להכין לשכפל שפופרות של FMM המכיל כל אחד BDM להיבדק, אבל לא לחסן אותם. צינורות בקרה אלה יגלו כל התפתחותם של חיידקים כתוצאה מזיהום.

6. בידוד של פטריות

הדגירה אדמה הבאה והסרת מדגם, פטריות מבודדות מהקרקע ששומרת על סרטי BDM. אם תרצה, חיידקים יכולים simultaneouערמומי להיות מבודד באותה השיטה באמצעות תקשורת המתאימה לבידוד של חיידקי אדמה, כגון אגר 1/10X לדלל tryptic סויה שמרים בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide להרתיע צמיחת פטרייתי ^37. כאשר מדיום מוגדר נדרש לבידודי חיידקים בשלבים 5 ו -7, M9 ³⁸ (בתוספת cycloheximide) הוא בחירה טובה.

1. לפני עיבוד מדגם, להכין PBS ומחשבי כף היד CHL ^30. הרשה ³⁰ צלחות CHL מחשב כף יד לייבוש (unbagged) בטמפרטורת חדר למשך כ 24 שעות לחסל עיבוי על עפעפיים ועל פני השטח אגר. טרום תווית צלחות ³⁰ CHL מחשבי כף יד.
2. לחפור שקיות רשת המכילות חתיכות BDM מאתרי הקבורה שנבחרו בשלב 1. הספינה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לא יותר מ 48 שעות לאחר חילוץ מאדמה.
3. באמצעות מרית ומלקחיים סטרילית, בעדינות להסיר את האדמה עד שהפלסטיק חשוף, אבל לא לצחצח את האדמה שהוא נצמד למשטח סרט BDM. לחתוך סרט BDM ל1 ס"מ2 חתיכות עד 0.5 גרם חומר הוא התאושש לכל אחת מארבע חזרות בסך הכל. העבר את סרט BDM גרם 0.5 ואדמה מצורפת ל25 צינורות תרבות מ"ל המכילים 9.5 מ"ל של PBS. אם מאלץ הוא מושפל לחלוטין, או נמצא בתהליך עיבוד שליטת קרקע בלבד, תוסיף 0.5 גרם של קרקע לPBS; אם אפשר, לבחור חתיכות כי הם עדיין דהויים מהמאלץ שיורית.
4. וורטקס צינורות התרבות המכילים 9.5 מ"ל PBS ומאלץ 0.5 גרם במשך 30 שניות במהירות גבוהה, בsonicate waterbath sonicating למשך 10 דקות, ושוב מערבולת למשך 30 שניות. התסיסה נועדה להתפרק biofilms, פיזי להסיר תאים משובצים באו הקפדה על חתיכות קש, וליצור השעיה הומוגנית.
5. הכן לדלל פתרון PBS / אדמה סדרה להשיג יחידות מושבה להרכיב בודדות מציפויים. עבור כל דגימה, מקום בצינור זרימה למינרית מכסה המנוע מלא בתרבות אחת 4.5 מ"ל סטרילי PBS. עבור כל דגימה, למלא שלוש בארות של צלחת 96 היטב היטב עמוק מלאה ב450 PBS μl.
6. ההשעיה הפלסטיק / אדמה המקורית (מאלץ 0.5 גרם בתוספת 9.5 מ"ל של PBS פתרון) מייצגת 10 ^-2 דילול 5.0 X של חומר חיידקים העמידה לפלסטיק. הוסף 0.5 מ"ל של השעיה מצינור מקורי זה לרמה של 4.5 מ"ל של PBS סטרילי בצינור התרבות להשיג דילול ^-3 x 10 5.0. מערבולת למשך 30 שניות במהירות גבוהה. הוסף ל50 μl μl 450 של PBS בצלחת 96 היטב. חזור על פעולה עבור כל הדגימות / משכפל. השתמש pipettor רב לדלל דגימות בהמוניהם. מערבבים את כל דילול חדש על ידי pipetting למעלה ולמטה עשר פעמים. שינוי עצות בין דילולים. הפוך דילולים עד 5.0 x 10 ^-6.
7. (אופציונלי) בודד חיידקים היו שופעים יותר מבודדים פטרייתיים בדגימות המתוארים במסמך זה, ולכן אם בו זמנית בידוד חיידקים, ולאחר מכן לבצע דילולים סדרתי של עד 5 x 10 ^-8 בשלב 6.6 לעיל.
8. להתפשט באופן שווה 100 μl מכל אחד מ5.0 x 10 ^-3 עד 5.0 x 10 ^-6דילולים פני השטח של ³⁰ צלחות אגר CHL מחשב כף יד עם שעוקרה או סורס בעירה מוטות זכוכית מקופלות. צלחות חנות זקופות למשך 30 דקות כדי לאפשר לנוזל להשרות ב, ואז לאטום צלחות עם Parafilm כדי למנוע בריחה של נבגים מבידודים בלתי מזוהים. דגירה צלחות הפוכות ב 20 מעלות צלזיוס בחושך במשך 5 ימים כדי לאפשר את שתי הפטריות מהירות וצמיחה איטית ליצור מושבות.

7. בחירה ראשונית של פטריות פלסטיק-משפילות

חשוב: כל תרבויות מכאן ולהבא יש לפתוח רק בארון בטיחות ביולוגי (לא מכסה המנוע זרימה למינרית), כדי למנוע זיהום של הסביבה עם נבגים של זהות לא ידועה. פטריות וחיידקים קרקע מסוימות הם פתוגנים אנושיים פוטנציאליים.

1. לבחון צלחות דילול המכילות מושבות מבודדות היטב. בחר מושבה שאינה נוגעת ללב מושבה אחרת.
2. באמצעות קיסם סטרילי אחת, לגעת בעדינות מושבה ולאחר מכן גע באגר של FMM (שנעשה בשלב 2.3 ), FMM + פלסטיק (שנעשה בשלב 4), וGMM (שנעשה בשלב 2.3) צלחות, לפי הסדר הזה. לחסן חרוזים אגר על גבי סרטי פלסטיק, לשפשף בעדינות את הקיסם על פני השטח של הנקודה אגר ולאחר מכן לסחוב מעבר לסרט פלסטיק. חזור על החיסון מאותו המקור ועד המושבה יש ארבעה פסים לשכפל על כל צלחת.
3. חזור על שלבי 7.1 עד 7.2 עד כמה משכפל של כל סוג מושבה חזותית ייחודי שנבחרו מכל מדגם BDM.
4. צלחות חותם עם Parafilm, להפוך, ולדגור על 20 מעלות צלזיוס בחושך במשך 5 ימים.
5. זהה מבודדים הגדלים על BDMs טוב יותר ממה שהם גדלים על FMM. אם הצמיחה לא מובן מאליו, להציג את הדגימה תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לוודא מן קולוניזציה או חוסר (איור 1). שמור את המכסה על, אם יש מכסה עיבוי, להחליף עם מכסה חדש, אבל לעשות זאת בארון הבטיחות הביולוגי.
6. ברגע שdegraders BDM הפוטנציאלי שנבחרו, השתמש כterile קיסם כדי לגרד הבידוד מהפטרייה מיישבת את הפלסטיק עצמו, ופס לבידודה של מושבה יוצרי יחידות בודדות על ³⁰ צלחות CHL מחשב כף יד.
7. צלחות חותם עם Parafilm וצלחות דגירה PDA CHL ³⁰ מחוסן עם בידודי פלסטיק משפילים ב 20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים בחושך.
8. עכשיו שמושבות מבודדות בודדות הם מטוהרים, להבטיח כי הם באמת מסוגלים ליישב את סרטי הפלסטיק נבדקים. לאסוף הבידוד (נבגים, תאי שמרים, או העובש) מיחידת מושבה יוצרים יחידה עם קיסם סטרילי. חזור על שלבי 7.2 עד 7.5. לאחר 5 ימים של דגירה על 20 מעלות צלזיוס, לבחון את צלחות המבדק לצמיחת פטריות. אם יבודד גדל על סרט BDM טוב יותר מאשר שהוא גדל על FMM בשני ראשונה (7.5) ושנייה (7.8) הניסויים, ולאחר מכן לאחסן לבודד כפי שיתואר להלן בשלב 8.

8. אחסון לטווח ארוך של Degraders פלסטיק

בסך הכל, מבודד פלסטיק משפיל ייבחן במבדק הצלחת (7.5), מחדש מטוהר ליחידות בודדות מבודדות מושבה יוצרי (7.6), שנבדקו במבדק הצלחת שוב (7.8), ולבסוף, נבחן במבדק הנוזלי ( 9.1-9.5). במהלך בדיקה, מבודדים יש להעביר לתקשורת טריות בכל חודש ומאוחסנות צלחות מניות עובדות על 4 מעלות צלזיוס ברגע שהצמיחה די גלויה. מבודד גם צריך להיות מאוחסן כמו מניות גליצרול ב -80 ° C, ו / או כנבגים מיובשים בדיסקים סינון סטרילי ב 4 ° C. שתי שיטות האחסון מתוארות להלן.

1. לכל בודד שגדל על סרט BDM טוב יותר מזה גדל בFMM בשני bioassays הצלחת ראשונה (7.5) ושנייה (7.8), להכין שתי צלחות ³⁰ CHL מחשב כף יד עם שניים או שלושה דיסקי נייר סינון מעוקרים, כ 1 ס"מ קוטר , על פני השטח. לחסן שני לוחות אלה מבאותה מושבה אחת בחרה בשלב 7.8 לעיל. הפוך את דשא על ידי הפצת הבידוד אחידה על פני אגר על מנת למקסם את הצמיחה. לאטום צלחות עם Parafilm ולדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. צעד זה יכול להיות יזם בו זמנית עם שלב 7.8 לשימוש יעיל.
2. דיסק המסנן על פני אגר צריך להיות מכוסה בתפטיר / נבגים. הסר את מסנן דיסקים מהשטח אגר עם מלקחיים מעוקרים, והמקום לתוך צינור אפנדורף סטרילית. אוויר לייבש את דיסקי סינון הלילה בתוך צינורות אפנדורף (עם הכובע כבוי) בארון biosafety או סביבה אחרת יבשה, סטרילי עם תנועת אוויר מינימאלית, כדי למנוע זיהום צולב. אז לאטום עם Parafilm, ולאחסן ב 4 ° C.
3. השתמש במטלית כותנה סטרילי או קיסם למסוק נבגים וmycelia מצלחות הדשא. להשעות את נבגי העובש ובגליצרול 30% בcryovials, פלאש להקפיא בחנקן הנוזלי, ולאחסן ב -80 ° C.

9. קו מחמירnfirmation ניצול פלסטיק באמצעות מבדק נוזלי

1. ליצור נבגים טריים ו / או תאים שבי לחסן תרבויות נוזליות: ³⁰ צלחות CHL כף יד לחסן עם נבגים מפלסטיק מבודד משפיל פוטנציאלי. לאטום את הצלחות עם Parafilm, דגירה על 20 מעלות צלזיוס עד נבגי פטריות הם גלויים לעין.
2. בארון בטיחות ביולוגי, נבגי קציר על ידי שטיפת הצלחת עם 0.01% טריטון X-100 (5 מ"ל לכל צלחת 15 x 100 מ"מ פטרי עובד היטב) ומקרצף את הנבגים (או תאי שמרים) מהמשטח עם מוט כפוף זכוכית סטרילית . לשאוב נבגים (או סלולרי) השעיה והעברה למכל סטרילי.
3. לספור נבגים או תאים עם hemacytometer ולקבוע את הנפח המתאים להוסיף עד 5 מ"ל של מרק FMM עבור סכום כולל של 1 x 10 ⁶ נבגים / צינור. הנפח צריך להיות פחות מ 10 μl. דילול של מתלי נבג מרוכזים ב0.01% טריטון X-100 עשויים להיות נחוץ.
4. במכסת מנוע העברת סטרילי, לחסן צינורות התרבות שהוכנו ב שלב 5 עם 1 x 10 ⁶ נבגים (או תאי שמרים). לאטום את המכסים עם Parafilm כדי למנוע כל בריחה של נבגים, במיוחד עבור מבודדים בלתי מזוהה. דגירה בחושך על 20 מעלות צלזיוס ולבחון דגימות שבועיות לצמיחה.
5. צמיחת Mycelial של פטריות על סרטי פלסטיק עשויה להיות גלויה בתוך השבוע הראשון לאחר חיסון, במיוחד בקצוות של סרטי הפלסטיק. לשמרי planktonic (כפי שמעיד מעונן תקשורת), יכולה להיות במעקב צמיחה על ידי קריאות צפיפות אופטיות ב 600 ננומטר. בגלל פטריות עשויות לצרף ישירות לסרט הפלסטיק, צמיחה עשויה להיות מוערכת על ידי העין, והוא יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופ אור ו / או במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
6. בFMM בלבד פקדים, לחפש כתמים לבנים זעירים שהם קטנים מדי כדי לרשום את שינוי בצפיפות אופטית תוך שימוש בשיטות spectrophotometric. ניתן aspirated כתמים אלה עם טפטפת פסטר ונצפו באמצעות מיקרוסקופ הפרעות ההפרש (DIC). כתמים הם לעתים קרובות בלתי מזוהה Precipitate, אך במקרים מסוימים הם עשויים להיות גושים של Inoculant המקורי שניבט, אבל לא גדל באופן משמעותי.
7. השתמש בתצפיות חזותיות ומיקרוסקופיות להשוות קולוניזציה של דגימות ובקרות ניסיוניות, ולהקצות את דירוגים לצמיחה בכל דגימה של סרט BDM. בגלל BDMs רבים בצבע כהה ומאפשר תצפית מינימאלית באמצעות מיקרוסקופיה למעט בקצוות, ועובי סרט אוסר על תצפית תחת עדשת נפט טבילה, SEM הוא שימושי להערכתי) את נוכחותו של גידול חיידקים, למשל באמצעות מערכת הדירוג שתוארה ב טבלת מס '1, וii) במידה של השפלה BDM.

10. לדוגמא הכנת SEM

1. השתמש במספריים נקיים, סטרילי לחתוך חתיכות קטנות של BDM מדגימות לשכפל. תקן BDMs ידי טבילה ב2.5% glutaraldehyde ב0.1 חיץ פוספט נתרן M (pH 7.2) במשך 24-48 שעות.
2. בעוד קיבעון מתרחש, מייבשים 100% אתנול טהור על ידי הוספת 5-10% VOlume 3 מסננת המולקולרית (מופעל בתנור ייבוש ב175-260 מעלות צלזיוס ומקוררת בייבוש), ולאפשר לשבת בטמפרטורת חדר למשך הלילה על מנת להבטיח התייבשות מוחלטת.
3. BDMs לטבול ב0.1 חיץ פוספט נתרן M (pH 7.2) במשך ארבעה שוטף של 15 דקות כל אחד.
4. BDMs לטבול במי ultrapure לשלושה שוטף של 5 דקות כל אחד.
5. מייבש את דגימות BDM בסדרת אתנול, טבילה למשך 20 דקות בכל ריכוז: 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, ו -100%. יש לשטוף BDMs עוד פעמיים ב100% אתנול במשך 20 דקות לכל לשטוף.
6. דגימות כפופות לייבוש נקודה קריטי וגמגום ציפוי.

תוצאות

במחקר שנערך לאחרונה ^24, ארבע חזרות כל אחד משלושה BDMs, זמין מסחרי שכותרתו "מתכלה", בתוספת סרט ניסיוני ושליטה קונבנציונלית פלסטיק, הונחו על אדמה כפי שמאלץ לייצור עגבניות באביב של שינה 2010 במאונט ורנון, וושינגטון, נוקסוויל, טנסי, וובק, טקסס. בסתיו של 2010, ריבועי סרט ...

Discussion

ההליך מתואר במסמך זה מייצג את הטכניקה הראשונה לעבור לבידוד degraders BDM הפוטנציאלי מהקרקע, והצלחה היה בשימוש כדי לבודד פטריות מBDMs קבורות באדמה במשך שבעה חודשים. פטריות גדלו כאשר reinoculated על חומר BDM טרי מאותו הסוג, המציינות את הפטריות המבודדות אכן היו מתיישבים, ושהסרטים לא ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents