Biyobozunur Plastik Malç Filmler Aşağı Breaking potansiyeli ile Yerli Toprak Mikroorganizmaların izolasyonu Tarımda Kullanılan

Özet

Etiketli plastik film "biyolojik" malç olarak tarımsal kullanım için ticari olarak kullanılabilir. Toprak çekici bir bertaraf yöntemi temsil eder, ama saha şartlarında bozulma kötü anlaşılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, alanında mezar sonra plastik malç filmleri kolonize yerli toprak mantar ve bakterileri izole etmek için yöntemler geliştirmektir.

Özet

Piyasada bulunan biyolojik malç (BDM) filmler kolonize tarım topraklara yerli mantar izole ve plastik aşağılamak için potansiyel için değerlendirildi. Tipik olarak, plastikten formülasyonlar bilinen ve ham madde kaynağı mevcuttur zaman, toz haline getirilmiş plastik temizleme bölgeleri görselleştirilmesi ile belirlenir ağar bazlı ortam ve bozulma içinde süspanse edilebilir. Ancak, bu yaklaşım kötü BDMs yerinde bozulması taklit eder. İlk olarak, BDMs toprak matrisi boyunca küçük parçacıklar halinde dağılmış değildir. İkinci olarak, BDMs saf polimerler olarak ticari olarak satılan değil, mikrobiyal büyümeyi etkileyebilir katkılar (örneğin dolgu maddeleri, yumuşatıcılar ve boyalar) içeren filmler gibi değildir. Burada tarif edilen prosedürler toprak gömülü malç filmleri elde izolatları için kullanılmıştır. Kazı BDMs elde mantar izole bir karbon kaynağı E içeren tanımlanan orta üstünde belirtilen yeni, disinfested BDMs parçaları üzerinde büyüme için ayrı ayrı test edildiagar xcept. BDMs büyüdü izolatlar daha BDMs tek karbon kaynağı ilave edildi sıvı ortam içinde test edildi. Yaklaşık on hafta sonra, mantar kolonizasyon ve BDM bozulması taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirildi. İzole edilen RNA gen dizilerinin analizi ile tespit edilmiştir. Bu rapor, mantar izolasyonu için yöntemleri açıklar fakat bakteriler de ikame ortam bakteriler için uygun olan bu metodlar kullanılarak izole edilmiştir. Bizim metodoloji plastik hammadde kullanılabilir ya bilinmeyen ya da hangi için sağlam plastik filmler ya da ürünlerin arıza araştıran çalışmalar için yararlı ispatlamak zorundadır. Ancak bizim yaklaşım BDM yıkımı oranları karşılaştırmak için kantitatif bir yöntem sağlamaz.

Giriş

Arıza ürün ömrü ve dayanıklılığı kısaltır çünkü bozulması tarihsel, plastik polimer istenmeyen bir özellik olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, doğal ortamda ^1,2,3 plastik atık tarafından sunulan çevre sorunlarının bilincini biyolojik olarak parçalanabilen plastik geleneksel plastik malzeme için cazip bir alternatif haline getirmiştir. Bozulması (yapısal değişiklikler, parçalanma ve molekül ağırlığı azalma, bütünlüğü ve gücü ^4,5 olarak tanımlanan) hem abiyotik süreçler (termal stres, fotoğraf-oksidasyon, hidroliz, erozyon ve mekanik stres) dahil olmak üzere bir dizi etkinlik,, ile gerçekleşir ve biyolojik bozulma ^6. Abiyotik işlemleri parçası boyutu ve plastiklerin özelliklerini değiştirmek mümkün olmakla birlikte, mikroorganizmaların su ve karbon dioksit (aerobik şartlar altında) ve / veya metan (anaerobik koşullar altında) için nihai mineralizasyonu için gereklidir.

Için önemli bir nişplastik malç toprak nemi korumak için ve toprak sıcaklıkları ^7,8 artırmak için, yabancı ot gelişimini engellemek için kullanıldığı yerlerde biyolojik olarak parçalanabilen plastik, tarım var. Sadece ABD'de dönüm yüz binlerce biyolojik olarak parçalanabilen plastik oluşan malç dahil plastik malç ^9, kaplıdır. Bir ürün büyüme mevsimi ardından, biyolojik malç (BDMs) imha için seçenekleri bir depolama bertaraf, enerji geri kazanımı ¹⁰ yakma, kompost ile bozulmalarını veya toprak işleme ¹¹ sonra toprakta bozulması içerir. Bunlardan, en az emek yoğun kaderi toprağa BDMs çiftçilik, ama olmayan kırpma ay (genellikle kışın) sırasında etkin bozulması ve mineralizasyon olmadan, plastik parçaları kalır ve tarım ekipmanları ile müdahale ilkbahar toprak işleme ve ekim sırasında, ve olabilir önemli ölçüde yaban hayatı, bitki, ve Mikrobiyota ^1,2,3,10 etki ortamda devam etmektedir.

tarım malç filmleri dahil olmak üzere birçok plastik ürünler, uygulamada, etiket "biyolojik" veya "gübrelenebilir" ayı olsa da, bozulma ve mineralizasyon in-toprak ayrışma için çok verimsiz ve / veya çok eksik olabilir bir olmak Bu ürünlerin bertarafı için alternatif. Örneğin, biyo-bozunur polietilen kompost sıcaklığı 25 ° C ¹² yaşındayken ° C kompost ve mineralizasyon yarısından az miktarda meydana gelen 58 hava bir yıl ve takip eden üç ay sonra sadece% 12.4 mineralizasyonu elde etti. Kışın, çok noktada toprak sıcaklığı muhtemelen daha düşük mikrobiyal aktivite ve sonuç olarak, daha az mineralizasyon ile sonuçlanan, bu sıcaklıklarda ya da daha düşük olacaktır. Degradasyon oranı yavaş ilave olarak, terim "biyolojik olarak parçalanabilir" kötüye tarım sektöründe olanlar dahil olmak üzere tüketicilere ^13,14 ile, bu ürünlerin güvensizlik yol açmıştır. Biyolojik dönüşümKarbon dioksit (ve / veya metan) ve mikroorganizmalar ⁴ doğal olarak meydana gelen suyun ¹⁴ için, polimerler. Bu nedenle, biyolojik kimyasal olarak ölçülmesi gereken, bir alt-tabaka ile mikroorganizmaların fiziksel ilişki, o malzemenin mikrobiyal bozulma anlamına gelmez.

Tarımda BDMs sürdürülebilir kullanımı incelemek için bir çabanın bir parçası olarak, bu çalışmada kolonize ve piyasada bulunan BDMs aşağılamak tarım topraklara yerli mikroorganizmalar keşfetmek odaklanmıştır. Standart test yöntemleri kimyasal abiyotik ve biyolojik yollarla ^15,16,17 ile biyolojik olarak parçalanabilen plastik dağılımı ölçmek için yayınlanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek tek mikrop türleri ile plastik bozulması adres, ya da izolasyonu için yöntem sağlamaz. Metodoloji Burada daha yakından mantar sporları ile numuneler aşılama sonrası mikrobik arıza direnci için plastik değerlendirmek için standart yöntemler benzer18,19.

Plastik formülasyonlar bilinen ve ham madde kaynağı mevcuttur zaman, toz haline getirilmiş plastik temizleme bölgeleri ¹³ görselleştirilmesi ile belirlenir ağar bazlı ortam ve bozulma içinde süspanse edilebilir. Bu yöntem, bu gibi poliüretan ²⁰ gibi polimer düşürebilir mikroorganizmalar, poli-(bütilen süksinat-ko-adipat) ^21, ve poli (laktik asit), ²² tanımlamak için önceden kullanılmıştır. Benzer bir yöntem, plastik tek karbon kaynağı ^20,23 olduğu sıvı bir ortam içinde süspansiyon haline saf toz haline getirilmiş plastik içerir. Bu yöntemler tanımlanmış bir sistemin avantajı var, onlar kötü BDMs yerinde bozulması taklit. BDMs toprak matrisi boyunca küçük parçacıkların içerisinde dağılmış, daha ziyade, satılan ve filmler olarak kullanılmaz, çünkü İlk olarak, yüzey alanı farklı şekilde dağıtılır. İkinci olarak, BDMs kimyasal yapısına saf polimer farklıdır. BDMs genellikle gibi katkı maddeleri içerirdolgu maddeleri, yumuşatıcılar ve renklendiriciler, ve bu katkı maddeleri böylece mikrobiyal büyüme ve mineralizasyon oranını etkileyebilir. Bu çalışmada, ticari amaçlı film, bileşimin kendi alanında kullanıma hazır bir şekilde özel bir plastik film olduğu için, bu nedenle, ve mantar ve bakterilerin izole edilmesi için kullanılmıştır. Nerede bakteri izolasyonları için uygun değişiklikler dikkat ile basitlik için, aşağıdaki yöntemleri, mantarlar için sadece açıklanmıştır.

Toprakta bir kış için yeni bir çalışmada ^24, üç piyasada bulunan BDMs ve bir deneysel film bir büyüme mevsimi için ABD'nin üç farklı bölgelerinde tarım bölgelerinde kullanılan ve daha sonra örgü (250 mikron) torbalara yerleştirilir ve gömülü Aynı sitelerde. 250 mikron elek boşluğu kök ve en toprak fauna hariç ve toprak tecavüz ^25,26 en aza indirirken, mantar hif nüfuz sağlar. Naylon malzeme toprakta çanta bozulmasını önlemek. Ardından kazı, fungal izole DGM adet geri kazanılmış ve agar haricinde bir karbon kaynağı ve bir 5 cm'lik önceden disinfested olduğu yeni, kullanılmamış DGM filmin x 5 cm yüzey disinfested kare olmadan minimal ortam üzerinde büyüme için değerlendirildi. Film olarak kullanılan çoğu plastik bütünlüğü kaybı olmadan Otoklava, böylece UV ışığı plastik üzerinde bulunan herhangi bir mikrobiyal hücreleri öldürmek için kullanıldı. ISO 846 ^19% 70 etanol ve sonraki kurutma yüzey-disinfesting önerir, ancak bu yöntem kullanıyorsanız, bir filmin herhangi bir bileşen veya katkı maddesi olumsuz etanol etkilenir sağlamalıdır. BDMs muhtemelen güneş ışığına dayanacak şekilde imal olduğundan, UV bir dekontaminasyon yöntemi olarak seçildi.

Tek başına minimum ortamda daha iyi BDM parçaları üzerinde büyüdü izolatları daha fazla çalışma için seçilmiştir. Genellikle tarım ve tıbbi değil tarafından metabolik olarak kullanılmaz, çünkü Agar, deniz yosunları tarafından üretilen bir polisakkarit, mikrobiyal medya kuvvetlendirmek için kullanılırMikroorganizmaların mümkün olmakla birlikte, agar-hidrolize edici enzimler, aynı zamanda toprağın ²⁸ izole edilmiş bakteriler deniz ²⁷ ve agar-hidrolize bakterilerden izole edilmiştir. BDM polimerler ve agar potansiyel besin kaynağı olarak bu polimerlerin içeren ortamlarda gelişmiş değil toprak mantar, salgıladığı enzimler için nadir yüzeyler olması bekleniyor, ancak her iki yüzeylerde (Adım 7) burada tarif edilen plaka biyo mevcut her iki. Bir karbon kaynağı olarak BDMs değil Agar kullanmak mantar BDM film (deneysel)) agar (negatif kontrol), ii dışında i) ilave karbon kaynağı içeren agar-katılaşmış ortamda büyüme karşılaştırarak, sadece agar kullanmak mantar ayırt edilebilir ve iii), glukoz (pozitif kontrol). Tüm izolatların Büyüme az orta artı glikoz üzerinde bekleniyor; mantar kaynaklanan değil glukoz içeren plakalar deneyde kullanılan özel minimal ortamda büyüme yeteneğine sahip olmayabilir. Potential BDM degraders agar-katılaşmış az orta + yalnız agar-katılaşmış minimal ortamda büyümeye daha iyi BDM film büyümek gerekir. Az orta plakaları üzerinde büyüyen mantar agar-degraders veya oligotrophs ve aynı zamanda bioassay plakalar BDM filmlerle ilgili agar üzerinde büyümesi bekleniyor, ancak filmler kendilerini (onlar tesadüfen da BDM polimerler aşağılamak sürece) üzerinde.

Agar kullanımı değil, BDMs bir nedeniyle mikrobiyal büyüme görme olasılığını ortadan kaldırmak için, tanımlanmış suyu orta (Adım 9) bir biyo ile agar plaklarına BDM kolonizasyon için ilk test izledi. DGM adet biyo-tüpler içinde bilinen tek karbon kaynağı temsil etmektedir.

Ön değerlendirme ve izolatların gliserol stokları yeniden canlandırmak üzerine, bazı bilinen bir karbon kaynağı içeren sıvı tanımlanan ortamda kıt ama görünür misel kurdu. Bu sonuçlar alınan izolatlar, bazı oligot olduğunu düşündürmektedirrophs - karbon, nitrojen, ve sulu bir ortam veya hava ^29,30,31 içinde uçucu olarak mevcut ya çözünmüş diğer besin maddeleri çok küçük miktarlarda atma büyümesi organizmalar. 18S ribozomal DNA analizi ile tür tayini bu görüşü destekler gibi eşleşen izolatların birçok mantar cins önce Besin düzeyinin düşüklüğü ³² ​​gösterdiği bildirilmiştir. Yaygın saprofit olarak Oligotrophs, ortamlarda ^30, bir dizi madde kullanımının metabolik kapasitesi geniş bir yelpazede gerektirir. Bu nedenle, BDMs (muhtemelen sıradışı enzimatik yetenekleri gerektiren) dışında biz izole aynı mantar oligotrofik kapasiteleri gösterdi ve bu havada parmak izi, toz veya iz uçucu alınan deri yağları gibi iz kirleticiler büyümeye başardık şaşırtıcı değildir. Oligotrophs ve izolasyon nedeniyle, bir BDM yüzeye büyümenin tek başına BDM arıza anlaması için kullanılamadı sonucuna vardı. Yöntemleri burada sc için çabalarımızı yansıtan tarifiyi niyetli BDM arıza için tarımsal topraklardan reen yerli BDM sömürgecilerin.

Protokol

Bu işlem toprakta BDM film kuluçka süresi için en az birkaç ay gerektirir ve agar plaklarına ve kolonizasyon ve bozulma değerlendirmek için agar-ücretsiz, kimyasal yapısı suyu hem sıralı biyoanalizlere için birkaç ay daha. Bireysel yöntemleri onlar yapılacak sırayla listelenir.

1. Toprak BDM Filmleri Kuluçka

Onlar aşağılamak beklenir altında olanlar taklit koşullar altında toprağa BDM filmler dahil. Yerleşik toprak ve sandviç bir 13 x 13 cm naylon örgü (250 mikron) çantanın içindeki toprak ile 10 cm x 10 cm BDM 400 g (kuru ağırlık eşdeğeri) edinin. Naylon iplik ile kapatın. Kuluçka kez deneyci kararına bağlıdır. Monitör ve / veya uygun şekilde kuluçka dönemi boyunca düzenli aralıklarla mikrobiyal aktivite (örneğin toprak sıcaklığı, besin ve nem) ile ilgili parametrelerini değiştirin.

2. Medya hazırlanmasıve Reaktifler

Medya ve kültür tüpleri içine yanlışlıkla besin kaynakları tanıtan önlemek için, reaktif dereceli kimyasallar, yeni satın alınan kültür tüpleri, ben saf (örneğin NANOpure) su yazın ve karıştırma medya için sıkı-yıkanmış cam kullanın. Reaktiflerin çapraz bulaşmayı önlemek - bu amaç için ayıraç özel bir kümesi kullanmak ve züccaciye en iyisidir. Bu mantar olan büyüme aşağıdaki reaktifleri bir madde tarafından inhibe edilir izole edilebilir mümkün olduğunu not edin. Böyle bir durumda, bazı optimizasyon gerekebilir.

1. Önce medya hale getirmek için, sonra bir laboratuar deterjan ve asit-yıkama (örneğin 10% HCl gece emmek) ile gerekli tüm cam yıkayın. Distile su içinde on iki kez en az durulama ve iki kez ultra saf su. Toz dışlamak için temiz alüminyum folyo ile tüm cam kapak. Eldiven giyin ve parmak izi alınan deri yağları dışlamak için damarlarının iç ve kenarları dokunmaktan kaçının. Herhangi bir sabun resi önlemek içinaidat ve, (kullanılmayan) yeni satın durulanır ve otoklav cam kültür tüpler ve kapaklar kolonizasyon, kültür mantar kolaylaştırmak cam çizikler.
2. Patates dekstroz agar (PDA) topraktan mantar ilk izolasyonu için kullanılan ve tek izole koloniler ve uzun süreli depolama için inokulum nesil kurulması için. Olduğunu Üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve ortam (50 ° C'ye kadar soğutuldu olduğunda) otoklav sonrası, 30 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona eklenmiştir kloramfenikol (EtOH, 10 mg / ml' lik stok çözeltiden), bakteriler dahil etmek. Bu ortam, hemen PDA CHL ³⁰ olarak adlandırılır.
3. Mantar az orta (FMM) potansiyel mantar plastik degraders ile aşılanmış BDMs için sağlam bir temel olarak kullanılır. Kenara agar (orta katılaşmaya kullanıldığında), aynı karbon ücretsizdir. Deiyonize _H2O arasında yaklaşık olarak 800 ml, 6.0 g NaNO _3, 0.52 g KCI, 0.52 g MgSO ₄ eklemek · 7H2 O, 1.52 g KH ₂ PO _4, ve 1 ml Hutner en eser elementler stok solüsyonu (2.2 g ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1.1 g H ₃ BO _3, 0.5 g MnCl ₂ · 4H ₂ O, 0.5 g FeSO ₄ · 7H ₂ O, 0.16 g CoCl ₂ · 5H ₂ O, 0.16 g CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0.11 g (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O ve 100 ml 5.0 g Na ₄ EDTA distile H ₂ O ^{33 , 34.} NaOH ile 6.5 'e pH ayarlama ve sıvı Biyoassay hacmi 1 L'ye getirin, tuzların çökelmesinin önüne geçmek için FMM filtre sterilize. katı ortam isteniyorsa, 16 g agar ve otoklav ekleyin. yan katı olduğunda, ağar 50 ° ye soğutulmuş gerekli olduğunda, 8 g / L ağar azaltmak ° C, 30 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar kloramfenikol ekleyin. Bu ortam hemen FMM CHL ³⁰ olarak adlandırılır. Bir kontrol olarak, mantar izolatı büyümesini sağlamak için Bu orta, FMM ma olmalıdırde yukarıdaki gibi ancak litre başına 10 g glikoz içeren. Bu glikoz az orta ³⁵ (GMM) denir.
4. Fosfat tamponlu tuz ³⁶ (PBS), toprak maruz BDMs ilk seri seyreltme toprak partikülleri ve mikrobiyal hücreleri askıya almak için kullanılır. PBS ettirmek için, 8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g Na ₂ HPO _4, ve distile su ve 0.24 g KH ₂ PO _4-800 ml ilave edilir. Tuzları çözülür ve HCl ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ultra saf su ile 1 L toplam hacmi getirin. 9.5 ml ve tüp başına 4,5 ml PBS ile temiz kültür tüpleri doldurun. Otoklavlayın.
5. % 30 (v / v) gliserol, -80 ° C'de saklama sırasında dondurarak saklanan bakteri ve maya hücreleri, sporlar ve mantar miselyum askıya almak için kullanılan Ultra saf su bu çözüm olun. Otoklavlayın.
6. % 0.01 (v / v) Triton X-100, mantar sporları askıya almak için kullanılan, deterjan hidrofobik sporlar için toksik olmayan bir ıslatıcı olarak görev yapar. 100 ul Triton X çözülürUltra saf su 1 L -100. Otoklavlayın.
7. 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.2) SEM sabitleme sırasında glutaraldehit için çözücü madde olarak kullanılır. 1 M Na ₂ HPO ₄ 68,4 ml ve 1 M NaH ₂ PO ₄ 31.6 ml karıştırın ve ultra saf su ³⁶ ile 1 L toplam hacmi getirmek.

3. Biyoassay Malzeme Hazırlanması: BDM Filmlerin Yüzey atım

1. Kesme aletleri kağıt ve bant gibi kirleticilerin kalıntıları potansiyel karbon kaynağı olduğu için, yeni satın alınan makas veya taze tıraş bıçakları ve kesim için bir inorganik yüzey kullanın. Cilt yağları ile BDM filmlerin kirlenmesini önlemek için eldiven giyin. Küçük kareler (4.25 x 4.25 cm) içine BDM filmleri kesin. Bu boyut kare standart bir 100 x 15 mm Petri plaka sığar.
2. BDM filmler temizlemek için bir antiseptik UV lamba (emisyon dalga boyu = 253.7 nm) kullanın. Böyle bir lamba genellikle standart bir biyogüvenlik kabini bulunur. Emin olun zamanUV ışığı çalışırken, BDM filmler kontamine olabilir biyogüvenlik kabini içine dış hava akış yoktur.
3. % 70 EtOH ve hava temizlemek için 15 dakika fan çalışmasına izin ile kaput içinde ıslak zeminlerde. Daha sonra, kanat kapatın ve 2 saat için UV ile kaputun yüzey dekontamine.
4. Satır dekontamine kaputu BDM filmler, yerleştirin. UV ışığı 2 saat filmlerde parlaklık sağlar.
5. BDM film çevirmek için temiz, steril forseps kullanın. Eller ve kollar doğrudan yeni dekontamine BDM yüzeyler üzerinde olduğunu süresini en aza indirmek için arka satıra ön sırada ve iş başlayın. BDMs saygısız zaman, filmin olmayan disinfested yüzü değil, daha önce temas UV ışığına maruz kalan temiz bir alanda üzerinde aşağı yönlü yeni disinfested tarafı yerleştirin.
6. Her iki tarafta UV tedavisi 2 saat sonra, steril bir forseps ile biyogüvenlik kabini gelen BDM filmler kaldırmak tekrar zaten-dekontaminasyon ve üzerinde ellerini ve kollarını yerleştirerek önlemek için önden arkaya doğru çalışmayanmakta olan filmler. Bu folyo kaplı bardak gibi steril, kuru, kapalı kaplara BDM filmleri yerleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.

4. Plaka Biyoassay Kurulum

Aseptik teknik kullanarak, steril bir transfer başlık tüm adımları uygulayın.

1. Agar plakalarının yüzeyinde UV disinfested DGM parçaları yerleştirin. İlk bir köşesinde aşağı ayarlayın ve yavaşça agar ile temas kare rulo kalan sağlar. Kırışıklıkları önlemek. Bazı filmler depolama sırasında olarak kırışıklıkları oluşturacak, bu kaçınılmazdır. Özellikle ince filmler parça düz koymak için iki forseps kullanılması gerekebilir.
2. Bir su ve hidrofobik plastik ilk kolonizasyonu için besin kaynağı sağlamak için plastik film üstünde yarı katı FMM chl ³⁰ agar Yeri boncuk. Boncuk su-geçirgen film için gerekli değildir. Mikrodalga agar yeniden erime ve (her kor bir malç üzerine erimiş agar dört 10 ul damla aktarmak için bir mikropipet kullanınner). Doğrudan delinme olabilir gibi malç için pipet ucu dokunmayın. Plakaları ters zaman malç aşırı kilo agar yüzeyinden plastik indirebiliriz çünkü, damla başına 10 ul aşmayın.
3. Plakaları tamamen katılaşmaya gecede kapaklı sağ tarafı oturup, ve sonra ° C karanlıkta 4 de kapalı kollu agar tarafı kadar saklamanızı. Ne zaman Biyoassay (Adım 7) yapmaya hazır,) bir FMM chl ³⁰ (negatif kontrol) plaka, ii) bir yarı katı FMM plastik film chl ^30, ve iii dört 10 ul damla içeren bir biyo plaka) bir tabak i kullanın GMM (pozitif kontrol). Bu şekilde, her biri dört adet izole çoğaltır orta plaka başına test edilebilir.

5. Sıvı Biyoassay Kurulum

1. Adım 3.1 'de BDM kesim için yönergeleri izleyin. Önce sıvı biyoassay için plastik filmler kesim, kültür tüp sığar bir boyut seçin.Birçok plastik türleri arasında homojen bir kütle elde etmek için gerekli olan alan film kalınlığına bağlı olacaktır. Biz 0.0175 g eşdeğer adet 15 x 150 mm kültür tüplerinde iyi uyum bulundu.
2. Yukarıda adım 3'te açıklandığı gibi UV ışığı ile filmlerin yüzey-bekletiniz.
3. Mikrobiyal bir izole her bir deney için, aşılama için üç tüp hazırlamak: i) DGM önceden belirlenmiş bir büyüklükteki fragmanı (deney), ii) herhangi bir karbon kaynağı (negatif kontrol) ile birlikte 5 ml FMM ve III ihtiva eden 5 ml FMM), 5 mL GMM (pozitif kontrol). Ayrıca, test edilecek her BDM içeren FMM tüpler çoğaltmak hazırlamak, ama onları aşılamak yok. Bu kontrol tüpler kirlenme kaynaklanan herhangi bir mikrobiyal büyüme ortaya çıkaracaktır.

6. Mantarlar izolasyonu

Aşağıdaki toprak kuluçka ve örnek kaldırma, mantar BDM filmleri yapışır topraktan izole edilmiştir. Eğer arzu edilirse, bakteri olabilir simultaneousinsi gibi mantar büyümesinin ³⁷ engellemek için 50 ug / ml siklohegzimid ile desteklenmiş 1/10X seyreltik triptik soya maya agar gibi toprak bakterileri izolasyonu için uygun bir araç kullanılarak aynı yöntemle izole edilebilir. Tanımlı bir orta Adım 5 ve 7'de bakteriyel izolasyonlar için gerekli olduğu zaman M9 ³⁸ (artı sikloheksimid) iyi bir seçimdir.

1. Örnek işleme önce, PBS ve PDA chl ³⁰ hazırlar. PDA plakaları ³⁰ CHL kapakları ve agar yüzeyi üzerinde yoğunlaşma ortadan kaldırmak için yaklaşık olarak 24 saat süre ile oda sıcaklığında (unbagged) kurumaya bırakın. Ön etiket PDA chl ³⁰ plakaları.
2. Adım 1 seçilen mezar sitelerinden BDM parçalar içeren örgü çanta kazı. 4 de Gemi ve mağaza ° C topraktan çıkardıktan sonra 48 saat daha uzun.
3. Steril spatula ve forseps kullanarak, hafifçe plastik maruz kalmaktadır kadar toprak çıkarmak ama BDM film yüzeyine tutunarak olan toprak fırça yok. 1 cm içine BDM filmi CutMalzeme, 0.5 g kadar 2 parça toplam dört tekrarlamalı her biri için geri kazanılır. 9.5 ml PBS içeren 25 ml'lik kültür tüpleri ile 0,5 g DGM film ve ekli toprak aktarın. Malç tamamen bozulmuş ya da bir toprak-tek kontrol işleniyor ise, PBS için toprağın 0.5 g ekleyin; mümkünse, hala kalan malç gelen renksiz parçaları seçin.
4. 9.5 ml PBS ve yüksek hızda 30 saniye boyunca 0.5 g içeren malç vorteks kültür tüpleri, 30 saniye boyunca tekrar 10 dakika, ve vorteks için bir su banyosu içinde sonikasyon sonicating. Ajitasyon, biyofilm parçalayın fiziksel ya da malç parçalara kalarak gömülü hücreleri çıkarmak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için tasarlanmıştır.
5. Seri kaplamalar tek tek koloni oluşturan birim elde etmek için PBS / toprak çözeltisi sulandırmak için hazırlayın. Her numune için, 4.5 ml steril PBS ile dolu bir laminar akış başlığı bir kültür tüpü yer. Her numune için, 450 ul PBS ile doldurulmuş bir kuyulu 96-kuyulu plakanın üç kuyu doldurun.
6. Orijinal plastik / kir süspansiyonu (0.5 g malç artı PBS çözeltisinden 9.5 ml) bir plastik yapışan mikrobiyal malzemenin bir 5.0 x 10 ^-2 seyreltme temsil eder. Bir 5.0 x 10 ^-3 seyreltme elde etmek için bir kültür tüpü steril PBS içinde 4.5 ml bu özgün tüpten süspansiyonu 0.5 ml ilave edilir. Yüksek hızda 30 saniye vorteks. 96 oyuklu plaka PBS 450 ul 50 ul ekle. / Çoğaltır tüm örnekler için tekrarlayın. Topluca örnekleri sulandırmak için çok kanallı pipet kullanın. On kez aşağı yukarı pipetleme ve her bir yeni seyreltme karıştırın. Seyreltme arasında ipuçları değiştirin. 5.0 x 10 ^-6 için seyreltme Makyaj.
7. (İsteğe bağlı) Bakteriyel izolatların burada açıklanan örneklerde mantar izole daha bol; aynı anda bakteri izole böylece, o zaman adım yukarıda 6.6 5 x 10 ^-8 seri dilüsyonları kadar gerçekleştirmek.
8. 5.0 x ile 5,0 x 10 ^-3 her birinden yayılır 100 ul 10 ^-6alev sterilize bükülmüş cam çubuklar ile PDA chl ³⁰ plakaların agar yüzeyi boyunca seyreltme. Mağaza tabak dik 30 dakika sonra kimliği belirsiz izole edilen sporların kaçış önlemek için Parafilm ile plakaları mühür, sıvı emmek izin. ° C karanlıkta hem de hızlı ve yavaş büyüyen mantar koloniler oluşturmak için 5 gün boyunca 20 ters inkübe edin.

7. Plastik-aşağılayıcı Mantarlar ilk seçimi

Önemli: Bu noktadan bütün kültürler sadece bilinmeyen kimlik sporları ile çevrenin kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabini (bir laminer akış kaputu) açılmalıdır. Bazı toprak mantar ve bakteriler potansiyel insan patojenlerdir.

1. Iyi izole koloniler içeren seyreltme plakları inceleyin. Başka bir koloni dokunmadan olmayan bir koloni seçin.
2. Tek steril kürdan kullanarak, yavaşça FMM en agar (Adım 2.3 'de yapılan bir koloni dokunun ve ardından dokunmatik ), FMM bu sırayla + plastik (Adım 4 yapılan) ve GMM (Adım 2.3 'de yapılan) levhalar,. Plastik filmler üstüne Agar boncuk aşılamak için, plastik film arasında daha sonra agar nokta ve tokatlamak yüzeyinde hafifçe kürdan sürün. Her plaka üzerinde dört çoğaltmak çizgiler kalmayıncaya kadar aynı kaynaktan kolonisinden aşılama tekrarlayın.
3. Birkaç her görsel-benzersiz koloni türü çoğaltır her BDM örnek seçilir kadar tekrarlayın 7.2 ile 7.1 adımları.
4. Parafilm ile Seal plakalar, ters ve 20 inkübe ° C karanlıkta 5 gün.
5. Onlar FMM büyümeye daha iyi BDMs yetişen izole belirleyin. Büyüme belli değilse, kolonizasyon ya da bunların eksikliği (Şekil 1) doğrulamak için bir mikroskop altında örnek görüntüleyin. Kapağı tutun, kapağı yoğunlaşma varsa, yeni bir kapak ile değiştirin ama biyogüvenlik kabini içinde yapabilirsiniz.
6. Bir kez potansiyel BDM degraders seçilir, olarak kullanmakterile kürdan plastik kendisi kolonize mantar inokulum kazımak ve PDA chl ³⁰ plakaları tek koloni oluşturan birimlerin izolasyonu için çizgi için.
7. Parafilm ve inkübe PDA chl ³⁰ plakalı Seal plakalar karanlıkta 5 gün boyunca 20 ° C'de plastik-aşağılayıcı izolatları ile aşılanmış.
8. Tek izole koloniler arıtılmış Şimdi, onlar test edilen plastik filmler kolonize gerçekten mümkün olduğundan emin olun. Steril bir kürdan ile tek bir koloni oluşturucu birim aşı (sporların, maya hücreleri veya hif) toplayın. Tekrar 7.5 ile 7.2 adımları. 20 ° C'de inkübasyon 5 gün sonra, mantar büyümesi için biyo-plakaları inceleyin. Izole etmek, hem birinci (7,5) ve ikinci (7.8) çalışmalarda FMM üzerinde yetişen göre daha iyi bir DGM film üzerinde yetişen, o ve Adım 8'de tarif izole saklayın.

8. Plastik degraders uzun süreli Depolama

(Genel olarak, plastik-bozucu izole plaka tekrar biyoassay ile (7.8) içinde test tek izole edilmiş koloni oluşturucu birim (7.6), ile yeniden arıtılmış, plaka biyoassay ile (7.5) içinde test edilecek, ve son olarak, biyo-sıvı test 9,1-9,5). Testler sırasında, izole her ay taze ortama transfer edilmelidir ve çalışma stok plakaları ° C en kısa sürede yeterli büyüme görülebilir olarak 4 saklanan. İzolatlar da ° C ve / veya steril filtre diskleri kuru sporlar gibi 4 ° C'de -80 gliserol stokları olarak saklanmalıdır Hem saklama yöntemleri aşağıda tarif edilmiştir.

1. Her her iki ilk (7.5) ve (7.8) ikinci plaka biyoanalizlere FMM büyüdü daha iyi bir BDM film üzerinde büyüdüğünü izole için, iki veya üç sterilize filtre kağıdı diskler ile çapı yaklaşık 1 cm iki PDA chl ³⁰ plakaları hazırlamak , yüzey üzerinde. Bu iki tabak aşılamakAynı tek bir koloni adım yukarıda 7.8 'de seçilmiş. Büyüme maksimize etmek için agar üzerinde eşit inokulum yayarak bir çim olun. 5 gün boyunca 20 ° C'de Parafilm ve inkübe ile plakaları Seal. Bu adım verimlilik için adım 7.8 ile aynı anda başlatılabilir.
2. Agar yüzeyinde filtre diski misel / sporlar ile örtülmelidir. Steril bir Eppendorf tüp içine agar steril forseps ile yüzey ve yerden filtre diskleri çıkarın. Hava bir biyogüvenlik kabini veya çapraz bulaşmayı önlemek için en az hava hareketi ile diğer kuru, steril bir ortamda (kapak kapalı) Eppendorf tüpleri içinde gece filtre diskleri kurulayın. Daha sonra 4 ° C'de Parafilm ve mağaza ile mühür
3. Çim plakalardan sporları ve misel hasat steril bir pamuklu bir bez veya kürdan kullanın. Cryovials% 30 gliserol sporları ve hif Askıya, -80 sıvı azot ve mağaza flaş dondurma ° C

9. Sıkı CoSıvı Biyoassay ile Plastik Kullanımı nfirmation

1. Potansiyel plastik aşağılayıcı izole edilen sporlar ile inoküle PDA chl ³⁰ plakaları: sıvı kültür aşılamak için hangi ile taze sporları ve / veya hücreleri oluşturmak. Parafilm ile plakaları Seal ve mantar sporları görünür ° C kadar 20 kuluçkaya yatmaktadır.
2. Bir biyo-güvenlik kabini, plaka ile yıkanarak hasat sporlarının% 0.01 Triton X-100 (15 x 100 mm Petri plakası iyi çalışır başına 5 mi) ve steril bir bükülmüş bir cam çubuk ile yüzeyden sporlar (veya maya hücreleri) ovma . Aspire spor (veya hücre) steril bir kap içine süspansiyon ve transfer.
3. Hemasitometre ile hücre sayımı veya sporlar ve 1 x 10 ⁶ spor / tüp toplam FMM suyu, 5 ml eklemek için uygun birim belirler. Hacmi 10 ul 'den az olmalıdır. % 0.01, konsantre spor süspansiyonuyla seyreltilmesi Triton X-100, gerekli olabilir.
4. Steril bir transferi kaputu, hazırlanan kültür tüpleri aşılamak 6 sporlar (veya maya hücreleri) ile birlikte> 5. Adım. Özellikle tanımlanamayan izolatlar için, spor herhangi bir kaçış önlemek için Parafilm ile kapaklar mühür. 20 ° C'de karanlıkta inkübe ve büyüme için haftalık örnekleri gözlemlemek.
5. Plastik filmlerde mantarların misel büyüme, özellikle plastik filmlerin kenarlarında, aşılama sonraki ilk hafta içinde görülebilir. Planktonik maya (bulutlu olarak ortam ile kanıtlandığı) için, büyüme ve 600 nm de optik yoğunluk okumaları ile izlenebilir. Mantar plastik film doğrudan bağlanan, büyük olasılıkla nedeni, büyüme gözü ile değerlendirilebilir ve ışık mikroskobu ve / veya taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile teyit edilebilir.
6. FMM-sadece kontrollerde, spektrofotometrik yöntemler kullanılarak optik yoğunluk bir değişiklik kayıt çok küçük minik beyaz lekeler arayın. Bu benekler Pasteur pipeti ile aspire ve diferansiyel girişim (DIC) mikroskopi kullanılarak görülebilir. Benekler genellikle tanımlanamayan preci vardırpitate, ancak bazı durumlarda bu çimlenmiş ama önemli ölçüde büyüdü olmasaydı orijinal aşı kümeleri olabilir.
7. Deneysel örnekleri ve kontrollerin kolonizasyon karşılaştırmak için görsel ve mikroskobik gözlemler kullanın ve BDM filmin her bir numune üzerinde büyümesine derecelendirme atayın. Birçok BDMs koyu renkli ve kenarlarda dışında mikroskopi üzerinden en az gözlem izin verir, ve film kalınlığı bir yağ daldırma lens altında gözlem vermez, çünkü SEM) 'de açıklanan değerlendirme sistemi ile örneğin mikrobiyal büyüme varlığında i tahmin etmek için yararlıdır Tablo 1 ve ii) BDM bozulması ölçüde.

10. SEM Numune Hazırlama

1. Çoğaltmak örneklerinden BDM küçük parçalar kesmek için temiz, steril makas kullanın. 24-48 saat 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7.2)% 2.5 gluteraldehit içinde daldırarak BDMs Fix.
2. Sabitleme meydana olsa da,% 5-10 vo eklenerek% 100 saf etanol kurutmakLume 3 A moleküler elek (175-260 ° C sıcaklıkta bir kurutucu fırın içinde aktive edilen ve bir desikatör içinde soğutulmuş) ve toplam su kaybı sağlamak için gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
3. 15 dakika her biri dört yıkama için 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.2) içinde bırakın BDMs.
4. 5 dakika her üç yıkama için ultra saf suda bırakın BDMs.
5. En az% 50,% 70,% 80,% 90,% 95, ve% 100: her bir konsantrasyonda 20 dakika için daldırma ile, bir etanol serisi DGM örnekleri kurutmak. Durulama başına 20 dakika boyunca% 100 etanol içinde iki kez daha BDMs durulayın.
6. Kritik nokta kurutma ve konu örnekleri kaplama sıçramasına.

Sonuçlar

Bir çalışmada ^24, dört, "biyolojik" etiketli üç piyasada bulunan BDMs her, artı bir deneysel film ve geleneksel bir plastik kontrolü, Mount Vernon, WA de 2010 yılının bahar aylarında domates üretimi için malç olarak toprak üzerinde yerleştirildi çoğaltır Knoxville, TN ve Lubbock, Teksas. 2010 yılı sonbaharında, BDM filmi kareler dört çoğaltmak parsellerde malç yıpranmış her birinden kesilmiş, ve yerli toprak malç örnek eksize edilmiş alanı hemen altında çıkarıl...

Tartışmalar

Işlem burada toprak potansiyeli DGM degraders izole etmek için bir birinci geçiş tekniği temsil açıklanan ve başarılı bir şekilde yedi ay boyunca toprağa gömülü BDMs mantarlar izole etmek için kullanılmıştır. Mantarlar filmler mantar büyüme önleyici değildi aynı türden taze DGM malzeme üzerine reinoculated zaman izole edilmiş mantar gerçekten koloniciler olduğunu gösteren, büyümüş ve. Plastik-bozucu mantar ve bakterilerin izolasyonu potansiyel plastik bozulmuş olması gerekir toprak v...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents