Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l'agriculture

Résumé

Les films plastiques étiquetés «biodégradable» sont disponibles dans le commerce à des fins agricoles comme paillis. Travail du sol représente une méthode d'élimination attrayant, mais la dégradation des conditions sur le terrain est mal comprise. Le but de cette étude était de développer des méthodes pour isoler les champignons du sol indigènes et les bactéries qui colonisent les films de paillage plastique après l'enterrement de terrain.

Résumé

Les champignons indigènes sur les terres agricoles qui ont colonisé paillis films disponibles dans le commerce biodégradables (BDM) ont été isolés et évalués pour le potentiel de dégrader les plastiques. En règle générale, lorsque des formulations de matières plastiques sont connues, et une source de la charge d'alimentation est disponible, en matière plastique en poudre peut être mis en suspension dans un milieu et la dégradation de la gélose à base déterminés par visualisation des zones de compensation. Cependant, cette approche imite mal dégradation in situ de la BDM. Tout d'abord, BDM ne sont pas dispersés sous forme de petites particules à travers la matrice du sol. Deuxièmement, BDM ne sont pas commercialisés en polymères purs, mais plutôt comme des films contenant des additifs (par exemple des charges, des plastifiants et colorants) qui peuvent affecter la croissance microbienne. Les procédures décrites dans les présentes ont été utilisés pour les isolats acquis de sols enfouis films de paillage. Isolats fongiques acquis de BDM fouilles ont été testés individuellement pour la croissance sur des morceaux de nouvelles, BDM désinfectées fixées au sommet milieu défini contenant aucune source de carbone eauf agar. Les isolats qui poussaient sur BDM ont encore été testés dans un milieu liquide où BDM étaient la seule source de carbone ajoutée. Après environ dix semaines colonisation fongique et la dégradation des BDM ont été évalués par microscopie électronique à balayage. Les isolats ont été identifiés par analyse de séquences de gènes d'ARN ribosomique. Ce rapport décrit les méthodes d'isolement des champignons, des bactéries, mais aussi ont été isolés en utilisant ces méthodes en remplaçant les médias appropriés pour les bactéries. Notre méthodologie devrait s'avérer utile pour des études portant répartition des films de plastique intacts ou produits pour lesquels matières premières en plastique sont soit inconnu ou n'est pas disponible. Cependant, notre approche ne fournit pas une méthode quantitative pour comparer les taux de dégradation BDM.

Introduction

La dégradation a toujours été considéré comme un attribut indésirable de polymères plastiques, parce répartition raccourcit produit durée de vie et de durabilité. Récemment, la sensibilisation aux problèmes de l'environnement présentés par les déchets plastiques dans l'environnement naturel ^1,2,3 a fait plastiques biodégradables une alternative intéressante aux matériaux plastiques conventionnels. Dégradation (définis comme des changements structurels, la fragmentation et la réduction de la masse moléculaire, l'intégrité et la force ^4,5) se fait par une série d'événements, y compris les processus abiotiques (stress thermique, photo-oxydation, l'hydrolyse, l'érosion et le stress mécanique), et la dégradation biologique ^6. Bien que les processus abiotiques peuvent changer la taille des fragments et les caractéristiques des matières plastiques, les microorganismes sont nécessaires pour leur minéralisation ultime à l'eau et le dioxyde de carbone (dans des conditions aérobies) et / ou le méthane (dans des conditions anaérobies).

Une niche importante pourplastiques biodégradables existent dans l'agriculture, où les paillis de plastique sont utilisés pour empêcher la croissance des mauvaises herbes, conserver l'humidité du sol et à augmenter la température du sol ^7,8. Des centaines de milliers d'hectares dans les seuls États-Unis sont recouverts de paillis de plastique ^9, y compris paillis composé de plastique biodégradable. Après une saison de croissance des cultures, les options pour l'élimination des paillis biodégradables (BDM) comprennent l'élimination dans un site d'enfouissement, l'incinération de récupération d'énergie ^10, la dégradation par le compostage ou la dégradation dans le sol après le labour ^11. Parmi ceux-ci, le sort moins de main-d'œuvre laboure BDM dans le sol, mais sans dégradation efficace et la minéralisation pendant les mois non cultivées (généralement en hiver), des fragments de plastique pourraient rester et interférer avec l'équipement agricole pendant le labour de printemps et la plantation, et persister dans l'environnement où ils ont un impact significatif faune, la flore, et microbiote ^1,2,3,10.

Bien que de nombreux produits en plastique, y compris les films de paillage agricole, portent l'étiquette «biodégradable» ou «compostable», dans la pratique, la dégradation et la minéralisation peut être trop inefficace et / ou trop incomplets pour la décomposition dans les sols d'être un alternative viable pour l'élimination de ces produits. Par exemple, les polyéthylènes oxo-biodégradables obtenus seulement 12,4% de minéralisation après un an de vieillissement et de trois mois à venir dans un 58 ° C compost, et moins de la moitié de ce montant de minéralisation sont survenus lorsque la température du compost est de 25 ° C ^12. En hiver, les températures du sol à la plupart des endroits seraient inférieurs à l'une de ces températures, résultant vraisemblablement de l'activité microbienne encore plus faible et, par conséquent, moins de minéralisation. En plus de ralentir la vitesse de dégradation, l'utilisation abusive du terme «biodégradable» a conduit à se méfier de ces produits par les consommateurs ^13,14, y compris dans le secteur agricole. La biodégradation est la conversionde polymères à dioxyde de carbone (et / ou du méthane) et de l'eau ¹⁴ par des micro-organismes d'origine naturelle ^4. Par conséquent, la biodégradation doit être mesurée chimiquement; l'association physique des micro-organismes avec un substrat n'implique pas la dégradation microbienne de ce matériau.

Dans le cadre d'un effort pour examiner l'utilisation durable de la BDM dans l'agriculture, cette étude se concentre sur la découverte de micro-organismes indigènes sur les terres agricoles qui colonisent et dégradent BDM disponibles dans le commerce. Méthodes d'essai normalisées ont été publiés pour mesurer chimiquement la décomposition des plastiques biodégradables par abiotiques et biologiques ^15,16,17. Cependant, ces méthodes ne tiennent pas compte dégradation des plastiques par des espèces microbiennes individuelles, ou fournissent des méthodes pour leur isolement. La méthode ressemble à présent plus étroitement méthodes normalisées visant à évaluer plastiques pour la résistance à la dégradation microbienne après inoculation des échantillons avec des spores fongiques18,19.

Lorsque les formulations de matières plastiques sont connues, et une source de la charge d'alimentation est disponible, le plastique en poudre peut être mis en suspension dans un milieu et la dégradation de la gélose à base déterminés par visualisation des zones de compensation ^13. Ce procédé a déjà été utilisé pour identifier les micro-organismes qui dégradent les polymères tels que le polyuréthanne, le ^poly-20 (butylène succinate-co-adipate) ^21, et le poly (acide lactique) ^22. Une méthode similaire consiste à suspendre plastique pur en poudre dans un milieu liquide où la matière plastique est la seule source de carbone ^20,23. Bien que ces méthodes ont l'avantage d'un système défini, ils imitent mal dégradation in situ de la BDM. Tout d'abord, la surface est répartie différemment parce BDM ne sont pas dispersés en petites particules à travers la matrice du sol, mais plutôt vendus et utilisés comme films. Deuxièmement, la composition chimique du BDM est différente de polymères purs. BDM contiennent généralement des additifs tels quedes charges, des plastifiants, et des colorants, ainsi que ces additifs peuvent influer sur la croissance microbienne, et de ce fait, le taux de minéralisation. Pour cette raison, et parce que la composition de certains films commerciaux dans cette étude étaient propriétaires, film plastique, dans sa forme utilisable sur le terrain a été utilisé pour isoler les champignons et les bactéries. Pour plus de simplicité, les méthodes suivantes sont décrites uniquement pour les champignons, avec des modifications ont noté le cas échéant pour isolements bactériens.

Dans une étude récente ^24, trois BDM disponibles dans le commerce et un film expérimental ont été utilisés sur des sites agricoles dans trois régions différentes des États-Unis pour une saison de croissance, et ensuite placés dans mesh (250 microns) sacs et enterrés pour un hiver dans le sol aux mêmes sites. Les ouvertures de maille 250 microns permettent hyphes de pénétrer tout en excluant les racines et la plupart faune du sol, et de minimiser l'empiètement des sols ^25,26. matériaux en nylon prévenir la dégradation du sac dans le sol. Après excavation, fisolats Ungal ont été récupérés à partir de morceaux BDM et évalués pour la croissance sur un milieu minimal sans une source de carbone à l'exception de l'agar-agar et de 5 cm x 5 cm carrés de surface désinfectée du nouveau film, encore utilisé de BDM qui a été pré-désinfectés. La plupart des plastiques utilisés comme films ne peuvent pas être passés à l'autoclave sans perte de l'intégrité, de la lumière UV a été utilisé afin de tuer toutes les cellules microbiennes résidant sur les matières plastiques. ISO 846 ¹⁹ recommande surface désinfestation dans 70% d'éthanol et séchage ultérieur, mais si vous utilisez cette méthode, on doit s'assurer qu'aucun composant ou additif du film subit les conséquences négatives de l'éthanol. Depuis BDM vraisemblablement sont fabriqués pour résister à la lumière du soleil, les UV a été choisie comme méthode de décontamination.

Les isolats qui poussaient sur BDM morceaux mieux que sur un milieu minimal seuls ont été retenus pour une étude plus approfondie. Agar, un polysaccharide produit par les algues marines, est utilisé pour solidifier les milieux microbiens, car il n'est généralement pas utilisé métaboliquement par l'agriculture et médicalement pasmicro-organismes capables, mais enzymes d'agar-hydrolyse ont été isolés à partir de bactéries marines ²⁷ et bactéries d'agar-hydrolyse ont également été isolées du sol ^28. Polymères BDM et de l'agar sont tous deux censés être des substrats rares pour les enzymes sécrétées par des champignons du sol, qui n'ont pas évolué dans des environnements qui contiennent ces polymères en tant que sources potentielles de substances nutritives, mais les deux substrats sont présents dans le bio-essai sur plaque décrit ci-après (étape 7). Les champignons qui utilisent BDM mais pas agar comme une source de carbone peuvent être différenciés des champignons qui utilisent agar seulement, en comparant la croissance sur gélose solidifiée contenant i) sans ajout d'une source de carbone à l'exception agar (contrôle négatif), ii) BDM films (expérimental) et iii) le glucose (témoin positif). Croissance de tous les isolats est prévu sur un milieu minimal ainsi glucose; champignons qui ne découlent pas de plaques contenant du glucose peut ne pas être capable d'une croissance sur le milieu minimal notamment utilisé dans l'expérience. Potential BDM dégradeurs devrait croître sur une gélose solidifiée milieu minimum + film BDM mieux que leur croissance sur gélose solidifiée milieu minimal seul. Les champignons qui poussent sur des plaques de milieu minimal sont agar-dégradeurs ou oligotrophes, et devraient également croître sur la gélose des films BDM dans des plaques d'essais biologiques, mais pas sur les films eux-mêmes (à moins qu'ils serendipitously également dégrader les polymères BDM).

Pour éliminer la possibilité de voir la croissance microbienne en raison de l'utilisation de l'agar et non de BDM, nous avons suivi notre analyse initiale de la colonisation BDM sur des plaques d'agar avec un essai biologique en milieu liquide défini (étape 9). Morceaux BDM représentés source de carbone seulement connu dans les tubes à essais biologiques.

Après l'examen initial, et sur la relance de stocks de glycérol des isolats, certains formé mycélium peu mais visible dans un milieu défini liquide contenant aucune source de carbone connu. Ces résultats suggèrent que certains des isolats étaient acquises oligotrophs - organismes qui poussent en piégeant très petites quantités de carbone, d'azote et d'autres nutriments dissous soit dans le milieu aqueux ou existant comme volatiles dans l'air ^29,30,31. L'identification des espèces par 18S analyse de l'ADN ribosomal soutenu ce point de vue, comme la plupart des isolats appariés genres fongiques précédemment rapporté exposer oligotrophie ^32. Oligotrophes, qui sont communément saprophytes, nécessitent un large éventail de capacités métaboliques pour l'utilisation du substrat dans une variété d'environnements ^30. Ainsi, il n'est pas surprenant que les mêmes champignons, nous isolées à partir de BDM (nécessitant vraisemblablement capacités enzymatiques inhabituelles) ont démontré des capacités oligotrophes, et sont capables de croître sur les traces de contaminants tels que les huiles de la peau à partir des empreintes digitales, la poussière ou les volatiles de traces dans l'air. En raison de l'isolement des populations oligotrophes, nous avons conclu que la croissance sur une surface de BDM seul ne pouvait pas être utilisée pour déduire BDM panne. Les méthodes décrites aux présentes reflètent nos efforts pour screen colonisateurs BDM indigènes provenant des sols agricoles pour la rupture du BDM de bonne foi.

Protocole

Cette procédure nécessite au moins plusieurs mois pour l'incubation des films BDM dans le sol, et plusieurs mois de tests biologiques séquentiels à la fois sur des plaques d'agar agar et frais, bouillon chimiquement définis pour évaluer la colonisation et de la dégradation. Différentes méthodes sont répertoriées dans l'ordre où ils seront effectués.

1. L'incubation de Films BDM dans le sol

Incorporer les films BDM dans le sol dans des conditions mimant celles dans lesquelles ils seront appelés à se dégrader. Acquérir 400 g (soit l'équivalent en poids sec) de sol et résident en sandwich une cm x 10 cm BDM 10 avec le sol à l'intérieur de 13 x 13 cm de maille de nylon (250 microns) de sac. Fermer avec un fil de nylon. Les temps d'incubation sont à la discrétion de l'expérimentateur. Surveiller et / ou modifier les paramètres relatifs à l'activité microbienne (par exemple la température du sol, des nutriments et de l'humidité) à intervalles réguliers tout au long de la période d'incubation, le cas échéant.

2. Préparation des milieuxet réactifs

Pour éviter d'introduire des sources d'éléments nutritifs par inadvertance dans les médias et les tubes de culture, utiliser des produits chimiques de qualité réactif, tubes de culture nouvellement acquis de type I ultra-pure (par exemple NANOpure) d'eau, et la verrerie rigoureusement à la chaux pour les médias de mélange. Éviter la contamination croisée des réactifs - il est préférable d'utiliser un ensemble dédié de réactifs et la verrerie à cet effet. Notez qu'il est possible que les champignons peuvent être isolées dont la croissance est inhibée par un ingrédient dans les réactifs indiqués ci-dessous. Si cela se produit, certains d'optimisation peut être nécessaire.

1. Avant de prendre médias, laver toute la verrerie nécessaire avec un détergent de laboratoire et ensuite de l'acide de lavage (par exemple tremper toute la nuit dans HCl à 10%). Rincer au moins douze fois à l'eau distillée et deux fois dans de l'eau ultrapure. Couvrir toute la verrerie avec du papier d'aluminium propre pour exclure la poussière. Porter des gants et évitez de toucher l'intérieur et les bords des navires à exclure les huiles de la peau avec les doigts. Pour éviter toute savon résidencerayures en verre qui facilitent la colonisation, les champignons de culture dans des tubes de culture en verre nouvellement acquises (non utilisé), rincé et stérilisé à l'autoclave et casquettes cotisations et.
2. Potato dextrose agar (PDA) est utilisé pour l'isolement initial des champignons du sol, et pour l'établissement de colonies isolées simples et la production d'inoculum pour le stockage à long terme. Préparez le support conformément aux instructions du fabricant et après l'autoclavage (lorsqu'il est refroidi à 50 ° C), ajouter du chloramphénicol (à partir de 10 mg / ml de solution mère dans de l'éthanol) à une concentration finale de 30 pg / ml, d'exclure les bactéries. Ce milieu est maintenant désigné comme PDA chl ^30.
3. Milieu minimal fongique (FMM) est utilisé comme une base solide pour BDM inoculés avec un potentiel dégradeurs plastique fongiques. En plus de la gélose (lorsqu'il est utilisé pour solidifier le milieu), il est exempt de carbone. Pour environ 800 ml d'eau désionisée H ₂ O, ajouter 6,0 g _NaNO3, 0,52 g de KCl, 0,52 g MgSO ₄ · 7H2 O, 1,52 g KH ₂ PO _4, et 1 solution mère d'oligo-éléments de ml Hutner (2,2 g ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1,1 g de H ₃ BO _3, 0,5 g _MnCI2 · 4H ₂ O, 0,5 g _FeSO4 · 7H ₂ O, 0,16 g _CoCI2 · 5H ₂ O, 0,16 g CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0,11 g (NH ₄₎ 6 Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O et 5,0 g Na ₄ EDTA dans 100 ml d'eau distillée H ₂ O ^{33 , 34.} Ajuster le pH à 6,5 en utilisant NaOH, et porter le volume à 1 L. Pour l'essai biologique liquide, filtre stériliser FMM pour éviter la précipitation des sels. Si milieu solide est souhaitée, ajouter 16 g d'agar et autoclave. Quand agar semi-solide est nécessaire, réduire agar à 8 g / L. Quand on le refroidit à 50 ° C, ajouter du chloramphénicol à une concentration finale de 30 pg / ml. Ce milieu est maintenant désigné comme FMM chl ^30. Comme un contrôle pour s'assurer que les isolats fongiques se développent dans ce milieu, FMM devrait être made comme ci-dessus mais contenant 10 g de glucose par litre. C'est ce qu'on appelle glucose milieu minimal ³⁵ (GMM).
4. Solution tampon phosphate ³⁶ (PBS) est utilisée pour suspendre les particules de sol et des cellules microbiennes dans la dilution en série initiale de BDM sol-exposées. Pour faire du PBS, ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, et 0,24 g de KH ₂ PO ₄ à 800 ml d'eau distillée. Dissoudre les sels et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Amener le volume total à 1 L avec de l'eau ultra-pure. Remplir des tubes de culture propres à 9,5 ml et 4,5 ml de PBS par tube. Autoclave.
5. 30% de glycérol (v / v) est utilisé pour suspendre cellules congelées bactéries et de levures, des spores et le mycélium fongique au cours du stockage à -80 ° C. Faire de cette solution dans de l'eau ultra-pure. Autoclave.
6. 0,01% (v / v) de Triton X-100 est utilisé pour suspendre les spores fongiques, le détergent agit comme un agent mouillant non-toxique pour les spores hydrophobes. Dissoudre 100 pi Triton X-100 À 1 L d'eau ultra-pure. Autoclave.
7. Un tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,2) est utilisé en tant que solvant pour le glutaraldéhyde pendant SEM fixation. Mélanger 68,4 ml de 1 M Na ₂ HPO ₄ et 31,6 ml de 1 M NaH ₂ PO ₄ et porter le volume total à 1 L avec de l'eau ultra-pure ^36.

3. Préparation des matériaux d'essais biologiques: Décontamination des surfaces de BDM Films

1. Parce que les restes de contaminants tels que le papier et le ruban sur les ustensiles de coupe sont des sources potentielles de carbone, utiliser des ciseaux nouvellement achetés ou des lames de rasoir propre, et une surface inorganique pour la coupe. Portez des gants pour éviter la contamination des films BDM avec des huiles de la peau. Couper films BDM en petits carrés (4,25 x 4,25 cm). Ce carré de la taille s'inscrit dans un x 15 mm plaque standard 100 Petri.
2. Utiliser une lampe UV germicide (onde d'émission = 253,7 nm) pour décontaminer les films BDM. Cette lampe se trouve souvent dans une enceinte de biosécurité standard. Assurez-vous que lorsquela lumière UV est en marche, il n'y a pas d'écoulement de l'air extérieur dans l'enceinte de biosécurité qui pourraient contaminer les films BDM.
3. Les surfaces mouillées à l'intérieur du capot avec EtOH à 70% et laisser fonctionner le ventilateur pendant 15 min pour chasser l'air. Ensuite, fermez le châssis et décontaminer la surface du capot avec UV pendant 2 heures.
4. Placez les films BDM dans la hotte décontaminé, dans les rangées. Laisser la lumière UV pour briller sur des films pendant 2 heures.
5. Utilisez un chiffon propre, pinces stérilisées pour retourner les films BDM. Commencez par le rang et le travail à la rangée arrière pour minimiser le temps que les mains et les bras sont directement au-dessus des surfaces de BDM nouvellement décontaminés. Lorsque retournement BDM, placez le côté nouvellement désinfectés à la baisse sur une zone propre exposé à la lumière UV, mais pas encore en contact avec le côté non désinfectées du film.
6. Après 2 h de traitement UV de chaque côté, retirez les films BDM du poste de sécurité microbiologique avec une pince stérile, travailler à nouveau à partir de l'avant vers l'arrière pour éviter de mettre les mains et les bras plus déjà décontaminationfilms NAT. Placez les films BDM dans des récipients stériles, sèches, couvertes comme béchers recouvert de papier aluminium. Stocker à température ambiante dans l'obscurité.

4. Configuration des essais biologiques de la plaque

Effectuez toutes les étapes d'une hotte de transfert stérile en utilisant une technique aseptique.

1. Disposer les morceaux de BDM UV-désinfectées sur la surface des plaques de gélose. Ensemble descendre un premier angle, et à faire doucement le reste du rouleau carrée en contact avec l'agar-agar. Éviter les rides. Certains films seront forment les rides que pendant le stockage, ce qui est inévitable. En particulier des films minces peuvent nécessiter l'utilisation de deux pinces afin de jeter le morceau plat.
2. Placer les perles de semi FMM chl ³⁰ gélose au sommet de la feuille de plastique pour fournir une eau et source de nutriments pour la colonisation initiale de plastique hydrophobe. Perles ne sont pas nécessaires pour les films perméables à l'eau. Re-fondre l'agar-agar dans le micro-ondes, et d'utiliser une micropipette pour transférer quatre gouttes 10 pl de l'agar fondu sur le paillis (un dans chaque corner). Ne touchez pas la pointe de la pipette directement sur le paillis en soit crevaison. Ne pas dépasser 10 pi par goutte, parce que l'excès de poids sur le paillis plastique peut tirer de la surface de l'agar lorsque les plaques sont inversés.
3. Laissez les plaques sont assis du côté droit avec des couvercles sur la nuit pour solidifier complètement, puis stocker manches scellés agar-side up à 4 ° C dans l'obscurité. Lorsque vous êtes prêt à exécuter le test biologique (étape 7), utilisez i) une plaque de FMM chl ³⁰ (contrôle négatif), ii) une plaque d'essai biologique contenant quatre 10 gouttes ul de semi FMM chl ³⁰ sur film plastique, et iii) une plaque d' GMM (témoin positif). De cette façon, quatre répétitions de chaque isolat peut être testé par plaque de milieu.

5. Configuration des essais biologiques liquide

1. Suivez les instructions pour la coupe de BDM à l'étape 3.1. Avant de couper les films plastiques pour l'essai biologique liquide, choisir une taille qui s'adapte dans le tube de culture.La surface nécessaire pour atteindre une masse uniforme entre plusieurs types de plastique dépendra de l'épaisseur du film. Nous avons constaté que les pièces équivalentes à 0,0175 g s'intègrent bien dans 15 x tubes de culture de 150 mm.
2. Surface-décontaminer films avec de la lumière UV comme décrit dans l'étape 3 ci-dessus.
3. Pour chaque répétition d'une microbienne isoler, préparer trois tubes pour l'inoculation: i) 5 ml FMM contenant un fragment BDM de la taille prédéterminée (expérimental), ii) 5 ml FMM sans source de carbone (contrôle négatif), et iii) 5 ml GMM (témoin positif). En outre, préparer reproduire tubes de FMM contenant chacun BDM à tester, mais ne pas inoculer eux. Ces tubes de contrôle ne révèle aucune croissance microbienne résultant de la contamination.

6. Isolement des champignons

Incubation du sol suivant et l'enlèvement de l'échantillon, les champignons sont isolés de la terre qui adhère aux films BDM. Si vous le souhaitez, les bactéries peuvent simultaneously être isolé avec la même méthode utilisant les médias appropriés pour l'isolement des bactéries du sol, tels que 1/10X diluée tryptique agar de levure de soja additionné de 50 pg / ml de cycloheximide à dissuader la croissance fongique ^37. Quand milieu défini est nécessaire pour isolements bactériens dans les étapes 5 et 7, M9 ³⁸ (plus cycloheximide) est un bon choix.

1. Avant le traitement de l'échantillon, préparer PBS et PDA chl ^30. Permettre PDA chl ³⁰ plaques à sec (non ensachées) à température ambiante pendant environ 24 heures pour éliminer la condensation sur les paupières et la surface de la gélose. Pré-étiquette PDA chl ³⁰ plaques.
2. Creuser des sacs contenant des morceaux BDM de lieux de sépulture choisi à l'étape 1. Expédier et entreposer à 4 ° C pas plus de 48 heures après l'extraction du sol.
3. Aide d'une spatule et pince stérile, retirez délicatement le sol jusqu'à ce plastique est exposée, mais ne pas brosser le sol qui s'accroche à la surface du film BDM. Couper film BDM de 1 cmDeux morceaux jusqu'à 0,5 g de matériau est récupéré pour chacun des quatre répétitions totales. Transférer 0,5 g films BDM et le sol attachés à des tubes de 25 ml de culture contenant 9,5 ml de PBS. Si le paillis est complètement dégradé ou un contrôle du sol seulement est en cours de traitement, on ajoute 0,5 g de sol à la PBS, si possible, choisir des morceaux qui sont encore décolorée par le paillis résiduel.
4. Vortex les tubes de culture contenant 9,5 ml de PBS et 0,5 g paillis pendant 30 secondes à une vitesse élevée, Soniquer dans un bain-marie à ultrasons pendant 10 min, et le vortex à nouveau pendant 30 secondes. L'agitation est destiné à briser biofilms, supprimer physiquement les cellules intégrées dans ou en adhérant à des morceaux de paillis et de créer une suspension homogène.
5. Préparez-vous à diluer en série la solution PBS / sol pour obtenir des unités formant des colonies individuelles à partir de placages. Pour chaque échantillon, placer dans un capot d'un tube de culture à flux laminaire remplie de 4,5 ml de PBS stérile. Pour chaque échantillon, remplir trois puits d'une plaque de 96 puits en puits profond rempli avec 450 pi de PBS.
6. La suspension de plastique / sol d'origine (0,5 g de paillis et 9,5 ml de solution PBS) représente un 5,0 x 10 ^-2 dilution des matières microbienne adhérant au plastique. Ajouter 0,5 ml d'une suspension à partir de ce tube d'origine à 4,5 ml de PBS stérile dans un tube de culture afin d'obtenir une dilution de 10 ^-3 x 5,0. Vortex pendant 30 secondes à grande vitesse. Ajouter 50 pi à 450 pi de PBS dans la plaque de 96 puits. Répétez l'opération pour tous les échantillons / doublets. Utiliser une pipette multicanaux de diluer les échantillons en masse. Mélanger chaque nouvelle dilution par pipetage de haut en bas dix fois. Changer les cônes entre dilutions. Faire des dilutions allant jusqu'à 5,0 x 10 ^-6.
7. (Facultatif) Les isolats bactériens étaient plus abondants que les isolats fongiques dans des échantillons décrits ici, donc si isoler simultanément les bactéries, puis effectuer des dilutions en série jusqu'à 5 x 10 ^-8 à l'étape 6.6 ci-dessus.
8. Uniformément répartie 100 ul de chacun des 5,0 x 10 ^-3 à travers le 5,0 x 10 ^-6des dilutions à travers la surface de la gélose de PDA chl ³⁰ plaques avec stérilisés flamme tiges de verre bombées. plaques Garder debout pendant 30 minutes pour laisser tremper dans de liquide, puis sceller les plaques avec du Parafilm pour éviter évasion de spores des isolats non identifiés. Incuber les plaques inversées à 20 ° C dans l'obscurité pendant 5 jours pour permettre aux deux champignons rapides et une croissance lente de former des colonies.

7. Sélection initiale des champignons en plastique qui dégradent

Important: Toutes les cultures de ce point vers l'avant doivent être ouverts uniquement dans une enceinte de biosécurité (pas une hotte à flux laminaire) pour éviter la contamination de l'environnement avec des spores d'identité inconnue. Certains champignons du sol et les bactéries sont pathogènes humains potentiels.

1. Examiner les boîtes de dilution contenant des colonies bien isolées. Sélectionnez une colonie qui ne touche pas une autre colonie.
2. En utilisant une seule cure-dent stérile, toucher doucement une colonie, puis touchez l'agar de FMM (faite à l'étape 2.3 ), FMM + plastique (faite à l'étape 4), et GMM (faite à l'étape 2.3) plaques, dans cet ordre. Pour inoculer billes d'agar au sommet de films plastiques, frottez doucement le cure-dent sur la surface du point d'agar-agar, puis glisser à travers le film plastique. Répétez l'inoculation de la même colonie source jusqu'à il ya quatre stries répétés sur chaque plaque.
3. Répétez les étapes 7.1 à 7.2 jusqu'à plusieurs répétitions de chaque type de colonie visuellement uniques sont choisis dans chaque échantillon BDM.
4. plaques de sceller avec du Parafilm, inverser, et incuber à 20 ° C dans l'obscurité pendant 5 jours.
5. Identifier les isolats qui poussent sur BDM mieux qu'ils poussent sur FMM. Si la croissance n'est pas évidente, voir l'échantillon sous un microscope à dissection pour vérifier la colonisation ou de l'absence de celui-ci (Figure 1). Gardez le couvercle, si le couvercle a condensation, remplacer avec un nouveau couvercle, mais le faire dans l'enceinte de biosécurité.
6. Une fois dégradeurs BDM potentiels sont sélectionnés, utilisent commeterile cure-dents pour gratter inoculum du champignon colonise le plastique lui-même, et sans stries pour l'isolement de colonies formant unités simples sur PDA chl ³⁰ plaques.
7. plaques de sceller avec du Parafilm et incuber PDA chl ³⁰ plaques inoculées avec des isolats plastique dégradant à 20 ° C pendant 5 jours dans l'obscurité.
8. Maintenant que les colonies isolées simples sont purifiés, assurez-vous qu'ils sont vraiment capables de coloniser les films plastiques testés. Recueillir inoculum (spores, des cellules de levure, ou hyphes) à partir d'une unité formant des colonies unique avec un cure-dent stérile. Répétez les étapes 7.2 à 7.5. Après 5 jours d'incubation à 20 ° C, d'examiner les plaques d'essais biologiques pour la croissance fongique. Si l'isoler pousse sur un film BDM mieux que cela pousse sur FMM dans les deux premier (7,5) et deuxième (7,8) essais, puis stocker l'isoler comme décrit ci-dessous à l'étape 8.

8. Stockage à long terme de dégradeurs plastique

Dans l'ensemble, les isolats plastique qui dégradent seront testés dans l'essai biologique de plaque (7,5), re-purifié de simples unités formant des colonies isolées (7,6), testés dans l'essai biologique de la plaque à nouveau (7.8), et enfin, testés dans l'essai biologique liquide ( 09.01 à 09.05). Lors des tests, les isolats doivent être transférés dans un milieu frais tous les mois et les plaques de stock de travail conservés à 4 ° C dès que la croissance est suffisante visible. Isolats devraient également être stockées sous forme de stocks de glycérol à -80 ° C, et / ou sous forme de spores séchées sur des disques de filtre stérile à 4 ° C. Les deux méthodes de stockage sont décrits ci-dessous.

1. Pour chaque isolat qui a grandi sur un film BDM mieux qu'il a grandi sur FMM dans les deux premier (7,5) et deuxième (7,8) essais biologiques de la plaque, préparer deux chl ³⁰ plaques PDA avec deux ou trois disques de papier filtre stérilisés, d'environ 1 cm de diamètre , sur la surface. Inoculer ces deux plaques dela même colonie unique choisi à l'étape 7.8 ci-dessus. Faire une pelouse en répandant inoculum uniformément sur l'agar-agar pour maximiser la croissance. Sceller les plaques avec du parafilm et incuber à 20 ° C pendant 5 jours. Cette étape peut être lancée simultanément à l'étape 7.8 de l'efficacité.
2. Le disque de filtre sur la surface de la gélose doit être recouverte de mycélium / spores. Retirez les disques de filtrage de la surface de la gélose avec des pinces stérilisées, et le placer dans un tube Eppendorf stérile. Air sécher les disques filtrants nuit à l'intérieur des tubes Eppendorf (avec le hors cap) dans une enceinte de biosécurité ou une autre, l'environnement sec et stérile avec la circulation d'air minimal pour éviter la contamination croisée. Puis sceller avec du Parafilm et conserver à 4 ° C.
3. Utilisez un coton-tige stérile ou cure-dent pour récolter les spores et mycélium des plaques de gazon. Suspendre spores et des hyphes dans 30% de glycérol dans cryovials, flash-gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

9. Co strictesnfirmation d'utilisation Plastic via Liquid Bioassay

1. Générer des spores fraîches et / ou des cellules avec lesquelles pour inoculer des cultures liquides: inoculer PDA chl ³⁰ plaques avec des spores de potentiels isolats plastique dégradantes. Sceller les plaques avec du Parafilm et les incuber à 20 ° C jusqu'à ce que les spores fongiques sont visibles.
2. Dans une enceinte de biosécurité, les spores de récolte par lavage de la plaque avec 0,01% de Triton X-100 (5 ml par 15 x mm plaque 100 Petri fonctionne bien) et frotter les spores (ou cellules de levure) de la surface avec une tige courbée en verre stérile . Aspirer spores (ou cellules) de suspension et de transfert dans un récipient stérile.
3. Comptez spores ou de cellules avec un hématimètre et déterminer le volume approprié d'ajouter 5 ml de bouillon FMM pour un total de 1 x 10 ⁶ spores / tube. Le volume doit être inférieure à 10 pl. Dilution des suspensions de spores concentrées dans 0,01% de Triton X-100 peut être nécessaire.
4. Dans une hotte de transfert stérile, inoculer des tubes de culture préparés Étape 5 avec 1 x 10 ⁶ spores (ou cellules de levure). Sceller les bouchons avec Parafilm pour éviter toute fuite de spores, en particulier pour les isolats non identifiés. Incuber dans l'obscurité à 20 ° C et observer des échantillons hebdomadaires de croissance.
5. La croissance du mycélium de champignons sur les films plastiques peuvent être visibles dans la première semaine après l'inoculation, en particulier sur les bords des films plastiques. Pour levure planctoniques (comme en témoigne nuageux médias), la croissance peut être contrôlée par des lectures de densité optique à 600 nm. Parce que les champignons sont susceptibles de joindre directement à la pellicule plastique, la croissance peut être évaluée à l'oeil, et peut être confirmé par microscopie optique et / ou la microscopie électronique à balayage (MEB).
6. En FMM-seuls contrôles, chercher des taches blanches minuscules qui sont trop petits pour enregistrer un changement de densité optique en utilisant des méthodes spectrophotométriques. Ces taches peuvent être aspirés avec une pipette Pasteur et observés par interférence (DIC) microscopie différentiel. Taches sont souvent identifiables précisionpitate, mais dans certains cas, ils peuvent être massifs de l'inoculant initial qui avait germé mais pas considérablement augmenté.
7. Utilisez des observations visuelles et microscopique de comparer la colonisation des échantillons expérimentaux et les contrôles, et d'attribuer une note à la croissance de chaque échantillon de film de BDM. Parce que beaucoup de BDM sont de couleur foncée et permettre l'observation minimal par microscopie sauf sur les bords, et l'épaisseur de film interdit observation sous une lentille à immersion d'huile, SEM est utile pour estimer i) la présence de la croissance microbienne, par exemple via le système de notation décrit dans Tableau 1, et ii) l'ampleur de la dégradation BDM.

10. SEM Préparation des échantillons

1. Utilisez propres, ciseaux stériles pour couper des petits morceaux de BDM à partir d'échantillons répétés. Fixer BDM par immersion dans 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon de 0,1 M phosphate de sodium (pH 7,2) pendant 24 à 48 h.
2. Alors que la fixation se produit, déshydrater l'éthanol pur à 100% en ajoutant 5-10% volume 3 Å tamis moléculaire (activée dans une étuve à 175-260 ° C et refroidi dans un dessiccateur), et laisser reposer à température ambiante pendant la nuit pour assurer la déshydratation totale.
3. BDM plonger dans un tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,2) pendant quatre lavages de 15 min chacun.
4. BDM plonger dans l'eau ultra-pure pour trois lavages de 5 min chacune.
5. Déshydrater les échantillons BDM dans une série d'éthanol, immersion pendant 20 minutes à chaque concentration: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% et 100%. Rincer BDM deux fois plus dans l'éthanol à 100% pendant 20 minutes pour rincer.
6. Échantillons soumis à un séchage au point critique et revêtement par pulvérisation.

Résultats

Dans une étude récente ^24, quatre répétitions de chacun des trois BDM disponibles dans le commerce étiquetés «biodégradable», plus un film expérimental et un contrôle plastique conventionnel, ont été placés sur le sol comme paillis pour la production de tomates au printemps 2010 à Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, et Lubbock, TX. À l'automne de 2010, MBD places de cinéma ont été découpés dans chaque résisté paillis en quatre parcelles répétées et terre natale a été retiré direc...

Discussion

La procédure décrite ici représente une technique de premier passage pour isoler dégradeurs BDM potentiels du sol, et a été utilisé avec succès pour isoler les champignons de BDM enfouis dans le sol pendant sept mois. Les champignons ont augmenté lorsque inocule sur un matériel de BDM frais du même type, ce qui indique que les champignons isolés étaient en effet colonisateurs, et que les films n'étaient pas d'inhibition de la croissance fongique. Isolement des champignons dégradant le plastique et...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents