Isolamento dei nativi microrganismi del suolo con un potenziale di Breaking Down biodegradabili di pacciamatura film plastici utilizzati in agricoltura

Riepilogo

Pellicole in plastica etichettati "biodegradabili" sono disponibili in commercio per uso agricolo come pacciamatura. Lavorazione del terreno rappresenta un metodo di smaltimento attraente, ma la degradazione in condizioni di campo è poco conosciuta. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare metodi per isolare funghi del suolo nativo e batteri che colonizzano i film di pacciamatura plastica dopo il campo di inumazione.

Abstract

I funghi nativi per i suoli agricoli che colonizzarono pacciamatura (BDM) film biodegradabili in commercio sono stati isolati e valutati per la capacità di degradare plastica. Tipicamente, quando le formulazioni di materie plastiche sono noti e una fonte di materia prima è disponibile, plastica in polvere può essere sospesa in mezzi a base di agar e il degrado determinati dalla visualizzazione di zone di compensazione. Tuttavia, questo approccio imita scarsamente degradazione in situ di BDM. Prima, BDM non vengono disperse come piccole particelle in tutta la matrice suolo. In secondo luogo, BDM non vengono commercializzate come polimeri puri, ma piuttosto come i film che contengono additivi (ad esempio riempitivi, plastificanti e coloranti) che possono influenzare la crescita microbica. Le procedure descritte nel presente documento sono stati utilizzati per gli isolati acquisiti da film pacciamatura condizioni di interramento. Isolati fungini acquisiti da BDM scavati sono stati testati individualmente per la crescita su pezzi di nuove, BDM disinfestati cui cima di un terreno specifico che contiene nessuna fonte di carbonio eXCEPT agar. Gli isolati che crescevano sulla BDM sono stati ulteriormente testati in mezzo liquido in cui BDM erano l'unica fonte di carbonio aggiunto. Dopo circa dieci settimane, la colonizzazione fungina e degrado BDM sono stati valutati mediante microscopia elettronica a scansione. Isolati sono stati identificati mediante analisi delle sequenze geniche di RNA ribosomiale. Questo rapporto descrive i metodi per l'isolamento da funghi, ma i batteri sono stati isolati anche con questi metodi da parte dei media sostitutivi adeguati per i batteri. La nostra metodologia dovrebbe rivelarsi utile per gli studi indagano ripartizione dei film plastici intatti o prodotti per i quali materie prime plastiche sono o sconosciuti o non disponibile. Tuttavia il nostro approccio non fornisce un metodo quantitativo per confrontare i tassi di degrado BDM.

Introduzione

La degradazione è stata storicamente considerata un attributo desiderabile di polimeri plastici, perché ripartizione accorcia durata del prodotto e la durata. Recentemente, la consapevolezza delle problematiche ambientali connesse ai rifiuti plastici nell'ambiente naturale ^1,2,3 ha fatto plastica biodegradabile una valida alternativa ai materiali tradizionali. Degradazione (definita come cambiamenti strutturali, la frammentazione e la riduzione del peso molecolare, l'integrità e la forza ^4,5) avviene attraverso una serie di eventi, tra cui i due processi abiotici (stress termico, foto-ossidazione, idrolisi, l'erosione e lo stress meccanico), e degradazione biologica ^6. Mentre processi abiotici possono cambiare la dimensione del frammento e caratteristiche di materie plastiche, microrganismi sono necessari per la loro mineralizzazione finale di acqua e anidride carbonica (in condizioni aerobiche) e / o metano (in condizioni anaerobiche).

Una nicchia considerevole perplastiche biodegradabili esiste in agricoltura, dove pacciamatura plastica sono utilizzati per prevenire la crescita di erbacce, di trattenere l'umidità del suolo e ad aumentare le temperature del terreno ^7,8. Centinaia di migliaia di ettari nei soli Stati Uniti sono coperte di pacciamatura plastica ^9, tra pacciamatura composti di plastica biodegradabile. A seguito di una stagione di crescita delle colture, le opzioni per lo smaltimento di pacciamatura biodegradabili (BDM) includono lo smaltimento in discarica, incenerimento per recupero di energia ^10, la degradazione attraverso il compostaggio, o la degradazione nel suolo dopo la lavorazione del terreno ^11. Di questi, il meno il destino di manodopera sta arando BDM nel terreno, ma senza degradazione efficiente e mineralizzazione nei mesi non colturali (generalmente in inverno), frammenti di plastica potrebbero rimanere e interferire con attrezzature agricole durante la lavorazione del terreno e semina primaverile, e persistono nell'ambiente in cui essi influiscono in modo significativo la fauna selvatica, la vita vegetale, e microbiota ^1,2,3,10.

Anche se molti prodotti di plastica, tra cui film di pacciamatura agricola, si fregiano del marchio "biodegradabile" e "compostabile", in pratica, la degradazione e la mineralizzazione possono essere troppo inefficienti e / o troppo incompleto per la decomposizione in-terreno sia un valida alternativa per lo smaltimento di questi prodotti. Ad esempio, polietileni oxo-biodegradabili ottenuti solo 12,4% di mineralizzazione dopo un anno di intemperie e tre mesi successivi in un 58 ° C compost, e meno della metà di quella quantità di mineralizzazione si è verificato quando la temperatura del compost era di 25 ° C ^12. In inverno, le temperature del suolo in molte località sarebbero inferiori a nessuno di queste temperature, presumibilmente conseguente attività microbica ancora più basso e, di conseguenza, meno mineralizzazione. Oltre a rallentare la velocità di degradazione, l'uso improprio del termine "biodegradabile", ha portato a diffidare di questi prodotti da parte dei consumatori ^13,14, compresi quelli del settore agricolo. La biodegradazione è la conversionedi polimeri a biossido di carbonio (e / o metano) e acqua ¹⁴ da microrganismi presenti in natura ^4. Pertanto, la biodegradazione deve essere misurata chimicamente; l'associazione fisica di microrganismi con un substrato non implica la degradazione microbica di tale materiale.

Come parte di uno sforzo per esaminare l'uso sostenibile della BDM in agricoltura, questo studio si è concentrato sulla scoperta di microrganismi autoctoni di suoli agricoli che colonizzano e degradano BDM disponibili in commercio. Metodi di prova standard sono stati pubblicati per la misurazione chimicamente la ripartizione di plastiche biodegradabili mediante abiotiche e biologiche ^15,16,17. Tuttavia, questi metodi non affrontano degradazione di materie plastiche a singole specie microbiche, o forniscono metodi per il loro isolamento. La metodologia qui assomiglia più da vicino i metodi standard per la valutazione di plastica per la resistenza alla rottura microbica dopo inoculando i campioni con le spore fungine18,19.

Quando formulazioni di materie plastiche sono noti e una fonte di materia prima è disponibile, plastica in polvere può essere sospesa in mezzi a base di agar e il degrado determinati dalla visualizzazione di zone di compensazione ^13. Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per identificare microrganismi che degradano i polimeri quali poliuretano ^20, poli-(butilene succinato-co-adipato) ^21, e di poli (acido lattico) ^22. Un metodo simile comporta sospende plastica in polvere pura in terreno liquido in cui la plastica è l'unica fonte di carbonio ^20,23. Mentre questi metodi hanno il vantaggio di un sistema definito, essi mal mimare degradazione in situ di BDM. Prima, l'area superficiale è distribuita in modo diverso perché BDM non sono dispersi in piccole particelle in tutta la matrice suolo, ma piuttosto, venduti e usati come film. In secondo luogo, la composizione chimica dei BDM è diverso da polimeri puri. BDM generalmente contengono additivi comeriempitivi, plastificanti, e coloranti, e questi additivi possono influenzare la crescita microbica e di conseguenza, il tasso di mineralizzazione. Per questa ragione, e perché la composizione di alcuni film commerciali in questo studio erano proprietarie, film plastico nella sua forma pronto per il campo è stato utilizzato per isolare funghi e batteri. Per semplicità, i metodi indicati sono descritte solo per i funghi, con le modifiche indicate dove appropriato per isolamenti batterici.

In un recente studio ^24, tre BDM disponibili in commercio e un film sperimentale sono stati utilizzati in siti agricoli in tre diverse regioni degli Stati Uniti per una stagione in crescita, e successivamente immesse in mesh (250 micron), borse e sepolti per un inverno nel suolo nello stesso sito. I 250 micron aperture di maglia consentono ife fungine di penetrare escludendo le radici e la maggior parte della fauna del suolo, e riducendo al minimo l'invasione del terreno ^25,26. Materiali di nylon prevenire il degrado sacchetto nel suolo. Seguendo scavo, fisolati ungal sono stati recuperati da pezzi BDM e valutati per la crescita in terreno minimo, senza una fonte di carbonio tranne l'agar e di 5 cm x 5 cm quadrati di superficie disinfestare di nuovo, film di BDM non utilizzato che è stato pre-disinfestare. La maggior parte dei materiali plastici utilizzati come film non possono essere sterilizzati in autoclave senza perdita di integrità, la luce UV in modo da è stato utilizzato per uccidere tutte le cellule microbiche che risiedono sulle plastiche. ISO ^846-19 raccomanda superficie disinfestante in etanolo 70% e successiva essiccazione, ma se si usa questo metodo, si deve garantire che nessun componente o additivo del film è influenzata negativamente dalla etanolo. Poiché BDM presumibilmente sono realizzati per resistere luce solare, UV è stata scelta come metodo di decontaminazione.

Gli isolati che crescevano sulla BDM pezzi migliori rispetto a solo terreno minimo sono stati selezionati per ulteriori studi. Agar, un polisaccaride prodotto da alghe marine, è utilizzato per solidificare supporti microbiche perché non è utilizzato tipicamente da metabolicamente agricolo e non medicalmentemicrorganismi in grado, tuttavia, agar-enzimi idrolizzano sono stati isolati da batteri marini ²⁷ e agar-idrolizzano anche batteri sono stati isolati dal suolo ^28. Polimeri BDM e agar sono entrambi dovrebbero essere substrati rare per gli enzimi secreti da funghi del suolo, che non si sono evoluti in ambienti che contengono questi polimeri come potenziali fonti di nutrienti, ma entrambi i substrati sono presenti nel saggio biologico piastra qui descritto (punto 7). Funghi che utilizzano BDM ma non agar come fonte di carbonio può essere differenziata da funghi che utilizzano solo agar, confrontando crescita su agar-solidificato mezzo contenente i) senza aggiunta di fonte di carbonio tranne agar (controllo negativo), ii) BDM film (sperimentale) e iii) glucosio (controllo positivo). La crescita di tutti gli isolati è previsto in terreno minimo, più glucosio; funghi non derivanti da glucosio contenente piastre può non essere capace di una crescita del particolare mezzo minimo utilizzato nell'esperimento. Potential BDM degraders dovrebbe crescere su agar-solidificato terreno minimo + film BDM meglio che crescono su agar-solidificato terreno minimo da solo. I funghi che crescono su piastre di terreno minimo sono agar-degraders o oligotrophs, e sono inoltre tenuti a crescere in agar associato con i film BDM in lastre saggi biologici, ma non sugli stessi film (a meno che non casualmente anche degradare polimeri BDM).

Per eliminare la possibilità di vedere la crescita microbica a causa di utilizzo di agar e non di BDM, abbiamo seguito il nostro test iniziale per la colonizzazione BDM su piastre di agar con un saggio biologico in brodo definito (punto 9). Pezzi BDM rappresentato la fonte di carbonio noto solo nei tubi saggi biologici.

Dopo lo screening iniziale, e su di rivivere le scorte glicerolo degli isolati, alcuni formati scarsa ma visibile miceli in terreno specifico liquido che contiene nessuna fonte di carbonio noto. Questi risultati suggeriscono che alcuni degli isolati acquisiti erano oligotrophs - organismi che crescono da scavenging molto piccole quantità di carbonio, azoto e altri nutrienti disciolti sia in ambiente acquoso o esistere come sostanze volatili nell'aria ^29,30,31. Identificazione delle specie tramite l'analisi del DNA ribosomiale 18S sostenuto questo punto di vista, come molti degli isolati trovati generi fungini riferito precedentemente esporre oligotrofia ^32. Oligotrophs, che sono comunemente saprofiti, richiedono una vasta gamma di capacità metaboliche di utilizzazione del substrato in una serie di ambienti ^30. Quindi, non è sorprendente che gli stessi funghi abbiamo isolato dal BDM (presumibilmente richiedono particolari capacità enzimatiche) hanno dimostrato capacità oligotrofiche, e sono stati in grado di crescere su di contaminanti in tracce come oli per la pelle da impronte, polvere o tracce di sostanze volatili nell'aria. A causa dell'isolamento di oligotrophs, abbiamo concluso che la crescita su una superficie BDM soli, non potevano essere utilizzati per inferire ripartizione BDM. I metodi descritti nel presente documento riflettono i nostri sforzi per screen colonizzatori BDM nativi da suoli agricoli per bona fide ripartizione BDM.

Protocollo

Questa procedura richiede almeno diversi mesi per l'incubazione di film BDM nel suolo, e diversi mesi di test biologici sequenziali sia su piastre di agar e agar-libero, brodo di chimica definita per valutare la colonizzazione e la degradazione. Singoli metodi sono elencati nell'ordine in cui verranno eseguiti.

1. Incubazione di Films BDM nel suolo

Incorporare film BDM nel suolo in condizioni che mimano quelle alle quali essi dovranno degradare. Acquisire 400 g (peso secco equivalente) di suolo residente ed un panino cm x 10 cm BDM 10 con il terreno all'interno di un 13 x 13 cm nylon mesh (250 micron) bag. Chiudere con filo di nylon. I tempi di incubazione sono a discrezione dello sperimentatore. Controllo e / o modificare i parametri rilevanti per l'attività microbica (ad esempio il suolo di temperatura, sostanze nutritive e umidità) a intervalli regolari durante il periodo di incubazione del caso.

2. Preparazione dei supportie reagenti

Per evitare l'introduzione di fonti di nutrienti inavvertitamente in supporti e tubi di coltura, utilizzare sostanze chimiche di grado reagente, tubi cultura appena acquistati, di tipo I ultrapura (es. Nanopure) acqua, e bicchieri rigorosamente lavato per i media di miscelazione. Evitare la contaminazione incrociata dei reagenti - è meglio utilizzare un set dedicato di reagenti e vetreria per questo scopo. Si noti che è possibile che i funghi possono essere isolati la cui crescita è inibita da un ingrediente nei reagenti elencati di seguito. In tal caso, può essere richiesto qualche ottimizzazione.

1. Prima di effettuare i media, lavare tutti i necessari lavori di vetro con un detergente di laboratorio e poi l'acido-lavaggio (ad esempio bagno la notte in 10% HCl). Risciacquare un minimo di dodici volte in acqua distillata e due volte in acqua ultrapura. Coprire tutta la vetreria con un foglio di alluminio pulito per eliminare la polvere. Indossare guanti ed evitare di toccare l'interno e bordi dei vasi di escludere oli per la pelle dalle impronte digitali. Per evitare qualsiasi sapone residuiquote e graffi in vetro che facilitano la colonizzazione, i funghi di coltura in provette di coltura di vetro appena acquistati (non utilizzato), sciacquati e autoclavato e berretti.
2. Patata destrosio agar (PDA) viene usato per l'isolamento iniziale dei funghi da suolo, e di determinazione delle singole colonie isolate e generazione di inoculo per stoccaggio a lungo termine. Preparare il dispositivo secondo le istruzioni del fabbricante e dopo sterilizzazione in autoclave (quando raffreddato a 50 ° C), aggiungere cloramfenicolo (da 10 mg / ml di soluzione stock in EtOH) ad una concentrazione finale di 30 mg / ml, per escludere batteri. Questo mezzo è ora indicato come PDA CHL ^30.
3. Terreno minimo fungina (FMM) è utilizzato come base solida per BDM inoculate con potenziali degraders plastica fungine. A parte l'agar (quando usato per solidificare il medium), è priva di carbonio. A circa 800 ml di H ₂ O deionizzata, aggiungere 6,0 g Nano _3, 0,52 g di KCl, 0,52 g _MgSO4 · 7H2 O, 1,52 g di KH ₂ PO _4, e 1 elementi di soluzione madre di ml Hutner trace (2,2 g ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1,1 g di H ₃ BO _3, 0,5 g MnCl ₂ · 4H ₂ O, 0,5 g _FeSO4 · 7H ₂ O, 0,16 g CoCl ₂ · 5H ₂ O, 0,16 g di CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0,11 g di (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O, e 5,0 g di Na EDTA ₄ in 100 ml di H ₂ O distillata ^{33 , 34.} Regolare il pH a 6,5 con NaOH, e portare al volume di 1 L. Per il saggio biologico liquido, filtro-sterilizzare FMM per evitare la precipitazione di sali. Se si desidera il terreno solido, aggiungere 16 g di agar e autoclave. Quando agar semisolido è richiesto, ridurre agar a 8 g / L. Quando raffreddato a 50 ° C, aggiungendo cloramfenicolo ad una concentrazione finale di 30 mg / ml. Questo terreno viene ora indicato come FMM chl ^30. Come controllo per garantire che crescono in ceppi fungini questo mezzo, FMM dovrebbe essere made come sopra ma contenente 10 g di glucosio per litro. Questo si chiama glucosio minima quantità di terreno ³⁵ (GMM).
4. PBS ³⁶ (PBS) è utilizzato per sospendere particelle di terreno e cellule microbiche nella diluizione seriale iniziale di BDM suolo-esposte. Per rendere PBS, aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na ₂ HPO _4, e 0,24 g di KH ₂ PO _4-800 ml di acqua distillata. Sciogliere sali e regolare il pH a 7,4 con HCl. Portare il volume totale a 1 L con acqua ultrapura. Riempire i tubi di coltura pulite con 9,5 ml e 4,5 ml di PBS per provetta. Autoclave.
5. 30% (v / v) glicerolo viene utilizzato per sospendere le cellule batteriche e di lievito crioconservati, spore, e il micelio fungina durante la conservazione a -80 ° C. Rendere questa soluzione in acqua ultrapura. Autoclave.
6. 0,01% (v / v) Triton X-100 è utilizzato per sospendere spore fungine, il detersivo agisce come agente bagnante non tossico per spore idrofobici. Sciogliere 100 microlitri Triton X-100 In 1 L di acqua ultrapura. Autoclave.
7. 0,1 M tampone fosfato di sodio (pH 7,2) viene usato come solvente per glutaraldeide durante la fissazione SEM. Mescolare 68,4 ml di 1 M Na ₂ HPO ₄ e 31,6 ml di 1 M NaH ₂ PO ₄ e portare il volume totale a 1 L con acqua ultrapura ^36.

3. Preparazione dei materiali biologico possono considerarsi: decontaminazione superficiale delle BDM Films

1. Perché resti di contaminanti come carta e nastro adesivo su utensili da taglio sono potenziali fonti di carbonio, usare le forbici appena acquistati o rasoi freschi, e una superficie inorganica per il taglio. Indossare guanti per evitare la contaminazione dei film BDM con oli per la pelle. Tagliare i film BDM in piccoli quadrati (4,25 x 4,25 centimetri). Questa piazza si inserisce in una dimensione 100 x 15 mm piastra di Petri standard.
2. Utilizzare una lampada UV germicida (lunghezza d'onda di emissione = 253,7 nm) per decontaminare i film BDM. Tale lampada si trova spesso in un armadio biosicurezza standard. Garantire che, quandola luce UV è in funzione, non c'è flusso di aria esterna nel cabinet biosicurezza che potrebbe contaminare i film BDM.
3. Superfici bagnate all'interno della cappa con il 70% EtOH e lasciare conduzione soffiatore per 15 minuti per svuotare l'aria. Quindi, chiudere il battente e decontaminare la superficie del cofano con UV per 2 ore.
4. Mettere i film BDM nel cofano decontaminato, in righe. Lasciare che la luce UV a brillare su film per 2 ore.
5. Utilizzare un panno pulito, pinze sterilizzate per capovolgere i film BDM. Inizia la prima fila e il lavoro per la fila posteriore per ridurre al minimo il tempo che le mani e le braccia sono direttamente sopra le superfici BDM di nuova decontaminati. Azionando BDM, posizionare il lato appena disinfestare ribasso su un'area pulita esposta a luce UV ma precedentemente non in contatto con il lato non disinfestare del film.
6. Dopo 2 ore di trattamento UV su entrambi i lati, rimuovere le pellicole BDM dal cabinet biosicurezza con una pinza sterile, sempre lavorando da davanti a dietro per evitare di mettere le mani e le braccia sopra già-decontaminazionefilm minati. Collocare le pellicole BDM in sterili asciutti, contenitori, ricoperti come bicchieri lamina coperti. Conservare a temperatura ambiente al buio.

4. Setup Bioassay Piastra

Eseguire tutte le operazioni in una cappa di trasferimento sterile con tecnica asettica.

1. Posare i pezzi BDM UV-disinfestati sulla superficie delle piastre di agar. Deporre un angolo prima, e lasciare delicatamente il resto del rotolo quadrato in contatto con l'agar. Evitare le rughe. Alcuni film si formano le rughe come durante la conservazione, questo è inevitabile. In particolare i film sottili possono richiedere l'uso di due pinze per gettare il pezzo piatto.
2. Luogo perle di semisolido FMM CHL ³⁰ agar in cima alla pellicola di plastica per fornire una fonte di acqua e nutrienti per la colonizzazione iniziale di materie plastiche idrofobe. Perline non sono necessari per pellicole permeabili. Rifondere l'agar nel forno a microonde, e utilizzare una micropipetta per trasferire quattro 10 gocce microlitri di agar fuso sulla pacciamatura (uno in ogni corNER). Non toccare la punta della pipetta direttamente alla pacciamatura come sia puntura. Non superare i 10 ml per goccia, perché l'eccesso di peso sul pacciame può tirare plastica dalla superficie agar quando le piastre sono invertiti.
3. Lasciate che i piatti si siedono lato destro in alto con coperchi su durante la notte a solidificare completamente, e quindi memorizzare maniche sigillati agar-side fino a 4 ° C al buio. Quando si è pronti per eseguire il test biologico (Passo 7), usare i) un piatto di FMM CHL ³⁰ (controllo negativo), ii) un piatto biologico contenente quattro 10 gocce microlitri di semisolido FMM CHL ³⁰ su film plastico, e iii) una piastra di GMM (controllo positivo). In questo modo, quattro repliche di ogni isolato può essere testato per piastra di supporto.

5. Setup Bioassay Liquid

1. Seguire le istruzioni per il taglio BDM nel passo 3.1. Prima di taglio di film plastici per l'biologico liquido, scegliere un formato che si inserisce nel tubo di cultura.L'area necessaria per ottenere una massa uniforme tra diversi tipi di plastica dipenderà lo spessore del film. Abbiamo trovato che i pezzi equivalenti a 0,0175 g adattano bene in 15 x 150 provette di coltura mm.
2. Surface-decontaminare i film con la luce UV, come descritto al punto 3 sopra.
3. Per ogni replica di un microbica isolare, preparare tre provette per inoculo: i) 5 ml FMM contenente un frammento BDM della dimensione predeterminata (sperimentale), ii) 5 ml FMM con nessuna fonte di carbonio (controllo negativo), e iii) 5 ml GMM (controllo positivo). Inoltre, preparare replicare tubi di FMM contenenti ciascuna BDM da testare, ma non li inoculare. Questi tubi di controllo saranno rivelare alcuna crescita microbica derivante da contaminazione.

6. Isolamento dei funghi

Dopo l'incubazione del suolo e la rimozione del campione, i funghi sono isolati dal terreno che aderisce ai film BDM. Se lo si desidera, i batteri possono simultaneously essere isolato con lo stesso metodo di utilizzo dei supporti adeguati per l'isolamento di batteri del suolo, come ad esempio 1/10X diluita di soia trittico lievito agar addizionato con 50 mg / ml cicloeximide per scoraggiare la crescita di funghi ^37. Quando è necessario un terreno specifico per isolamenti batterici nei passaggi 5 e 7, M9 ³⁸ (più cicloesimide) è una buona scelta.

1. Prima di essere processati, preparare PBS e PDA chl ^30. Lasciare PDA ³⁰ piastre chl ad asciugare (unbagged) a temperatura ambiente per circa 24 ore per eliminare la condensazione sulle palpebre e la superficie agar. Pre-label PDA chl ³⁰ piastre.
2. Scavare borse di maglia contenenti pezzi BDM da luoghi di sepoltura scelti nella Fase 1. Nave e conservare a 4 ° C non oltre 48 ore dopo l'estrazione dal terreno.
3. Utilizzando una spatola ed una pinza sterile, rimuovere delicatamente terreno fino plastica è esposta, ma non spazzolare suolo che è aggrappato alla superficie del film BDM. Tagliare pellicola BDM di 1 cm2 parti fino 0,5 g di materiale è recuperato per ciascuno dei quattro replicazioni totali. Trasferire 0,5 g pellicola BDM e terreno annesso di provette di coltura da 25 ml contenente 9,5 ml di PBS. Se la pacciamatura è completamente degradato o un terreno di solo controllo è in fase di elaborazione, aggiungere 0,5 g di terreno per la PBS, se possibile, scegliere i pezzi che sono ancora scolorite dal pacciame residuo.
4. Agitare coltura contenenti 9,5 ml di PBS e 0,5 g di pacciamatura per 30 sec a velocità elevata, sonicare a bagnomaria sonicating per 10 minuti, e il vortice nuovamente per 30 sec. L'agitazione è destinato a spezzarsi biofilm, rimuovere fisicamente le cellule incorporate o aderendo a pezzi pacciamatura, e creare una sospensione omogenea.
5. Preparare per diluire serialmente la soluzione PBS / suolo per ottenere le singole unità formanti colonia da placcature. Per ogni campione, posto in una cappa a flusso laminare un tubo cultura riempito di 4,5 ml di PBS sterile. Per ogni campione, riempire tre pozzi di un profondo bene piastra a 96 pozzetti riempiti con 450 l di PBS.
6. La plastica / terreno sospensione originale (0,5 g pacciamatura più 9,5 ml di soluzione PBS) rappresenta un 5,0 x 10 ^-2 diluizione di materiale microbico aderente alla plastica. Aggiungere 0,5 ml di sospensione di questo tubo originale a 4,5 ml di PBS sterile in una provetta di coltura per ottenere un 5,0 x 10 ^-3 diluizione. Vortex per 30 sec a velocità elevata. Aggiungere 50 microlitri di 450 microlitri di PBS nella piastra a 96 pozzetti. Ripetere l'operazione per tutti i campioni / replicati. Utilizzare una pipetta multicanale per diluire i campioni in massa. Mescolare ogni nuova diluizione pipettando su e giù dieci volte. Cambia punte tra diluizioni. Diluire fino a 5,0 x 10 ^-6.
7. (Opzionale) isolati batterici sono stati più abbondanti di isolati fungini in campioni qui descritti; quindi se contemporaneamente isolare i batteri, quindi eseguire diluizioni in serie fino a 5 x 10 ^-8 al Punto 6.6 sopra.
8. Uniformemente distribuito 100 pl di ciascuno dei 5,0 x 10 ^-3 attraverso l'5,0 x 10 ^-6diluizioni in tutta la superficie agar di PDA chl ³⁰ piastre con bacchette di vetro piegati fiamma sterilizzato. Conservare le piastre in posizione verticale per 30 minuti per lasciare in ammollo in liquido, quindi sigillare piastre con una pellicola per evitare la fuga di spore da isolati non identificati. Incubare le piastre capovolte a 20 ° C al buio per 5 giorni per consentire sia i funghi veloce e lenta crescita per formare colonie.

7. Selezione iniziale dei funghi Plastica-degradanti

Importante: Tutte le culture da questo punto in avanti devono essere aperti solo in un armadio biosicurezza (non una cappa a flusso laminare) per evitare la contaminazione dell'ambiente con spore di identità sconosciuta. Alcuni funghi del suolo e batteri sono potenziali agenti patogeni umani.

1. Esaminare le piastre di diluizione contenenti colonie ben isolate. Selezionare una colonia che non tocca un'altra colonia.
2. Utilizzando un unico stuzzicadenti sterile, toccare delicatamente una colonia e poi toccare l'agar di FMM (made in Fase 2.3 ), FMM + plastica (fatta al punto 4), e GMM (made in Fase 2.3) piastre, in questo ordine. Per inoculare perle cima agar film plastici, strofinare la stuzzicadenti delicatamente sulla superficie del puntino agar e poi strisciare attraverso il film plastico. Ripetere l'inoculazione della stessa colonia di origine finché ci sono quattro striature replicati su ogni piatto.
3. Ripetere i punti da 7.1 a 7.2 fino a diverse repliche di ogni tipo di colonia visivamente unico sono selezionati da ogni campione BDM.
4. Chiudere le piastre con parafilm, invertono, e incubare a 20 ° C al buio per 5 giorni.
5. Identificare gli isolati che crescono su BDM meglio di crescono in FMM. Se la crescita non è evidente, visualizzare il campione sotto un microscopio da dissezione per verificare colonizzazione o assenza (Figura 1). Tenere il coperchio, se il coperchio ha condensazione, sostituirlo con un nuovo coperchio, ma farlo in biosicurezza.
6. Una volta che i potenziali degraders BDM sono selezionati, utilizzare cometerile stuzzicadenti per raschiare inoculo del fungo colonizzare la plastica stessa, e strisciare per l'isolamento dei singoli formanti colonie-unità su PDA ³⁰ piastre chl.
7. Chiudere le piastre con parafilm e incubare PDA chl ³⁰ piastre inoculate con ceppi di plastica che degradano a 20 ° C per 5 giorni al buio.
8. Ora che singole colonie isolate sono purificati, garantire che essi siano veramente in grado di colonizzare i film plastici in fase di test. Raccogliere inoculo (spore, cellule di lievito, o ife) da una singola unità formanti colonie con uno stuzzicadenti sterile. Ripetere i punti da 7.2 a 7.5. Dopo 5 giorni di incubazione a 20 ° C, esaminare le piastre saggi biologici per la crescita fungina. Se la isolare cresce su un film BDM migliore di cresce su FMM sia nel primo (7.5) e secondo (7,8) sperimentazione, quindi memorizzare il isolare come descritto di seguito nel passaggio 8.

8. Stoccaggio a lungo termine di Degraders plastica

In generale, gli isolati di plastica-degradanti saranno testati nel saggio biologico piastra (7.5), ri-purificato per singole unità isolate formanti colonie (7.6), testati nel saggio biologico di nuovo piastra (7.8), e, infine, testati nel liquido biologico ( 9,1-9,5). Durante il test, gli isolati devono essere trasferiti a mezzi freschi ogni mese e piastre stock di lavoro conservati a 4 ° C, non appena la crescita sufficiente è visibile. Gli isolati inoltre devono essere conservati come gli stock di glicerolo a -80 ° C, e / o come spore secche su dischi filtranti sterili a 4 ° C. Entrambi i metodi di stoccaggio sono descritti di seguito.

1. Per ogni isolato che cresceva su un film BDM migliore di quello che è cresciuto su FMM sia nel primo (7.5) e la seconda (7,8) test biologici piatto, preparare due PDA ³⁰ piastre chl con due o tre dischi di carta da filtro sterilizzato, di circa 1 cm di diametro , sulla superficie. Seminare questi due piatti dala stessa singola colonia selezionata al passo 7.8 sopra. Fare un prato, diffondendo inoculo uniforme su agar per massimizzare la crescita. Sigillare le piastre con parafilm e incubare a 20 ° C per 5 giorni. Questo passaggio può essere iniziata simultaneamente alla Fase 7.8 per l'efficienza.
2. Il filtro a disco sulla superficie agar deve essere coperto con micelio / spore. Rimuovere i dischi filtranti dalla superficie agar con pinze sterilizzate, e posto in una provetta Eppendorf sterile. Far asciugare i dischi filtranti durante la notte all'interno del provette Eppendorf (con il cappuccio di protezione) in un armadio biosicurezza o di altro ambiente asciutto, sterile con il minimo movimento d'aria per evitare la contaminazione incrociata. Quindi sigillare con parafilm, e conservare a 4 ° C.
3. Utilizzare un tampone di cotone sterile o uno stuzzicadenti per raccogliere le spore e miceli dalle piastre prato. Sospendere le spore ed ife nel 30% glicerolo in cryovials, flash-congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.

9. Co severenfirmation di utilizzo di plastica tramite Bioassay Liquido

1. Generare spore fresche e / o cellule con cui inoculare colture liquide: inoculo PDA ³⁰ piastre chl con spore di potenziali isolati degradanti plastica. Sigillare le piastre con parafilm e incubare a 20 ° C fino spore fungine sono visibili.
2. In un armadio biosicurezza, raccolto spore di lavaggio della piastra con 0,01% Triton X-100 (5 ml per 15 x 100 mm piastra Petri funziona bene) ed abbattimento dei spore (o cellule di lievito) dalla superficie con una bacchetta di vetro sterile bent- . Aspirato spore (o cella) sospensione e trasferimento in un contenitore sterile.
3. Conte spore o cellule con un emocitometro e determinare il volume appropriato di aggiungere 5 ml di brodo FMM per un totale di 1 x 10 ⁶ spore / tubo. Il volume dovrebbe essere inferiore a 10 microlitri. Diluizione di sospensioni di spore concentrate in 0,01% Triton X-100 può essere necessario.
4. In una cappa di trasferimento sterile, inoculare provette di coltura preparati in Fase 5 con 1 x 10 ⁶ spore (o cellule di lievito). Sigillare i tappi con parafilm per evitare qualsiasi fuga di spore, in particolare per gli isolati non identificati. Incubare al buio a 20 ° C e osservare campioni settimanali per la crescita.
5. Crescita del micelio di funghi su film plastici può essere visibile entro la prima settimana dopo l'inoculazione, soprattutto ai bordi dei film plastici. Per planctonici lievito (come dimostra nuvoloso media), la crescita può essere monitorato da letture di densità ottica a 600 nm. Perché i funghi sono suscettibili di collegare direttamente al film plastico, crescita può essere valutato da occhio, e può essere confermata mediante microscopia ottica e / o microscopia elettronica a scansione (SEM).
6. In FMM-solo controlli, cercare macchie bianche minuscole che sono troppo piccoli per registrare una variazione di densità ottica con metodi spettrofotometrici. Queste macchie possono essere aspirate con una pipetta Pasteur e osservate con interferenza differenziale (DIC) microscopia. Macchie sono spesso identificabili precisionepitate, ma in alcuni casi possono essere ciuffi di inoculante originale che aveva germogliato, ma non è cresciuta notevolmente.
7. Utilizzare osservazioni visive e microscopica di confrontare colonizzazione dei campioni sperimentali e dei controlli, e assegnare rating alla crescita su ciascun campione di film BDM. Poiché molti BDM sono di colore scuro e permettere l'osservazione minimale tramite microscopia tranne ai bordi, e spessore del film vieta osservazione sotto un obiettivo ad immersione in olio, SEM è utile per stimare i) la presenza di crescita microbica, ad esempio tramite il sistema di valutazione descritto nella Tabella 1, e ii) la misura del degrado BDM.

10. SEM Preparazione del campione

1. Utilizzare pulite, forbici sterili per tagliare piccoli pezzi di BDM da campioni replicati. Fissare BDM immergendo in glutaraldeide al 2,5% in 0.1 M tampone fosfato di sodio (pH 7,2) per 24-48.
2. Mentre fissaggio avviene, disidratare puro al 100% di etanolo aggiungendo 5-10% VOLume 3 Å setaccio molecolare (attivato in forno a 175-260 ° C e raffreddato in un essiccatore), e lasciar riposare a temperatura ambiente per una notte per garantire la disidratazione totale.
3. BDM Immergere in 0.1 M tampone fosfato di sodio (pH 7,2) per quattro lavaggi di 15 minuti ciascuno.
4. BDM Immergere in acqua ultrapura per tre lavaggi di 5 minuti ciascuno.
5. Disidratare campioni BDM in una serie di etanolo, immergendo per 20 min a ciascuna concentrazione: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%. Sciacquare BDM due volte più in etanolo 100% per 20 minuti per risciacquare.
6. Campioni soggetti ad essiccazione punto critico e polverizzazione catodica rivestimento.

Risultati

In un recente studio ^24, quattro repliche ciascuno dei tre BDM disponibili in commercio etichettati "biodegradabili", più un film sperimentale e un controllo di plastica convenzionale, sono stati collocati sopra suolo come concime per la produzione di pomodoro nella primavera del 2010 a Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, e Lubbock, TX. Nell'autunno del 2010, le piazze cinematografiche BDM sono stati tagliati da ogni intemperie pacciamatura in quattro appezzamenti replicare e suolo natio è stato ...

Discussione

La procedura descritta nel presente documento rappresenta una tecnica di primo passaggio per isolare potenziali degraders BDM dal suolo, ed è stato utilizzato con successo per isolare i funghi da BDM sepolte nel terreno per sette mesi. Funghi cresciuti quando reinoculated su materiale BDM fresca dello stesso tipo, indicando che i funghi isolate erano effettivamente colonizzatori, e che i film non erano inibire la crescita fungina. Isolamento di funghi e batteri che degradano plastica potenzialmente potrebbe portare al ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents