생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

요약

라벨 플라스틱 필름은 "생분해 성"뿌리 덮개로 농업 사용을 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다. 경작 매력적인 처리 방법을 나타냅니다 있지만, 현장 조건에서 분해가 제대로 이해된다. 본 연구의 목적은 현장 매장 한 후 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 식민지 기본 토양 곰팡이와 박테리아를 분리하는 방법을 개발하는 것이 었습니다.

초록

상업적으로 이용 가능한 생분해 뿌리 덮개 (BDM) 필름을 식민지 농업 토양에 기본 곰팡이를 격리 및 플라스틱을 저하 가능성에 대한 평가 하였다. 일반적으로 플라스틱의 공식이 알려진 원료의 소스를 사용할 때, 분말 플라스틱은 삭제 영역의 시각화에 의해 결정 한천 기반 미디어 및 저하가 중단 될 수 있습니다. 그러나,이 방법은 제대로 BDMS의 현장 저하 모방합니다. 첫째, BDMS은 토양 매트릭스에 걸쳐 작은 입자로 분산되지 않습니다. 둘째, BDMS 순수 고분자 상업적으로 판매되는 것이 아니라 미생물의 성장에 영향을 미칠 수있는 첨가제 (예를 들어, 필러, 가소제 및 염료)를 포함하는 필름으로하지 않습니다. 여기에 설명 된 절차는 토양 묻혀 뿌리 덮개 필름에서 얻은 분리에 사용 하였다. 발굴 BDMS에서 얻은 곰팡이 균주가 더 탄소원 전자를 포함하지 정의 배지 위에 누워 새로운 disinfested BDMS의 조각에 성장을 개별적으로 테스트 하였다한천 XCEPT. BDMS에서 자란 균주 더 BDMS이 유일한 추가 탄소원 있었다 액체 배지에서 테스트되었습니다. 약 10 주 후, 곰팡이 식민지와 BDM 저하는 주사 전자 현미경에 의해 평가되었다. 균주 리보솜 RNA 유전자 염기 서열 분석을 통해 확인 하였다. 이 보고서는 곰팡이 분리하는 방법을 설명하지만 박테리아는 대체 미디어 박테리아에 적합한 이러한 방법을 사용하여 분리 하였다. 우리의 방법론은 플라스틱 원료를 사용할 수 알 수 없거나하지하는 그대로 플라스틱 필름이나 제품의 고장을 조사 연구에 유용합니다. 그러나 우리의 접근 방식은 BDM 저하의 속도를 비교하기위한 정량적 방법을 제공하지 않습니다.

서문

고장 제품의 수명과 내구성을 단축하기 때문에 성능 저하가 역사적으로, 플라스틱 폴리머의 바람직하지 않은 특성을 고려하고있다. 최근 자연 환경 ^1,2,3에서 플라스틱 폐기물 제시 한 환경 문제의 인식은 생분해 성 플라스틱에게 기존의 플라스틱 재료에 대한 매력적인 대안을 만들었습니다. 저하 (구조 변경, 조각, 분자량의 감소, 무결성 및 강도 ^4,5로 정의)를 모두 비 생물 적 과정 (열 응력, 사진 산화, 가수 분해, 부식 및 기계적 응력) 등 일련의 사건,를 통해 발생 생물학적 분해 ^6. 비 생물 적 프로세스가 조각의 크기와 플라스틱의 특성을 변경할 수 있지만, 미생물이 물과 이산화탄소 (호기성 조건에서) 및 / 또는 메탄 (혐기성 조건 하에서)에 그들의 궁극적 인 광물이 필요합니다.

에 대한 상당한 틈새 시장플라스틱 뿌리 덮개는 토양 수분을 유지하고 토양 온도에게 ^7,8를 높이기 위해, 잡초 성장을 방지하기 위해 사용되는 생분해 성 플라스틱은 농업에 존재합니다. 혼자 미국에서 에이커의 수천 수백 생분해 성 플라스틱으로 구성된 뿌리 덮개 등의 플라스틱 뿌리 덮개 ⁹ 덮여있다. 작물 성장시기에 따라 생분해 뿌리 덮개 (BDMS)의 폐기에 대한 옵션은 매립지에서 폐기 에너지 회수 ¹⁰ 소각, 퇴비화를 통해 저하 또는 경작 ¹¹ 후 토양의 저하를 이용하실 수 있습니다. 이들 중 가장 노동 집약적 인 운명이 토양에 BDMS 없어야하지만, 이외의 작물 개월 (일반적으로 겨울) 기간 동안 효율적인 분해 및 광물없이, 플라스틱 조각이 남아 농업 장비에 방해가 봄의 경작과 재배하는 동안, 그리고 수 그들은 크게 야생 동물, 식물의 생명 및 미생물 ^{1,2,3,10에 영향을} 미칠 환경에서 유지됩니다.

농업 뿌리 덮개 필름 등 많은 플라스틱 제품은, 실제로, 라벨은 "생분해 성"또는 "퇴비"부담되지만, 분해 및 광물 인 - 토양 분해 너무 비효율적 및 / 또는 너무 불완전 할 수는 수 이 제품의 폐기에 대한 대안. 예를 들어, 옥소 생물 분해성 폴리에틸렌은 퇴비의 온도가 25 ° C ^{12 살} 때 ° C 퇴비 및 광물의 절반 이하 그 금액이 발생한 58에 풍화의 1 년 세 이후 개월 만 12.4 %의 광물을 달성했다. 겨울에는 대부분의 지역에서 토양 온도는 아마 더 낮은 미생물의 활동과 그 결과 적은 광물의 결과로, 이러한 온도의 하나보다 낮은 것이다. 분해 속도를 느리게하는 이외에, 용어 "생분해 성"의 오용은 농업 산업을 포함한 소비자 ^13,14, 이러한 제품의 불신하게되었다. 생분해 변환하는 것입니다이산화탄소 (및 / 또는 메탄) 및 미생물 ⁴ 자연적으로 발생하여 물을 ¹⁴ 고분자. 따라서 생분해 화학적으로 측정해야하며 기판과 미생물의 물리적 연결은 물질의 미생물 분해를 의미하지는 않습니다.

농업 BDMS의 지속 가능한 이용을 검토하기위한 노력의 일환으로,이 연구는 식민지와 시중 BDMS을 저하 농업 토양에 기본 미생물을 발견에 초점을 맞추었다. 표준 시험 방법은 화학적 무생물 및 생물 학적 의미 ^{15,16,17하여} 생분해 성 플라스틱의 분해를 측정 발표되었다. 그러나, 이러한 방법은 각각의 미생물 종에 의해 플라스틱의 저하를 주소 또는 분리하는 방법을 제공하지 않습니다. 방법은 여기에 더 밀접하게 곰팡이 포자 표본을 접종 한 후 미생물 분해에 저항 플라스틱을 평가하기위한 표준 방법과 유사18,19.

플라스틱의 공식이 알려진 원료의 소스를 사용할 때, 분말 플라스틱은 삭제 영역 ^13의 시각화에 의해 결정 한천 기반 미디어 및 저하가 중단 될 수 있습니다. 이 메서드는 폴리 우레탄 ^20와 같은 중합체를 분해 미생물, 폴리 (부틸 렌 숙시 네이트는-CO-아디 페이트) ²¹ 폴리 (젖산) ^22를 식별하기 위해 이전에 사용되었습니다. 유사한 방법 플라스틱 유일한 탄소원 ^{6:20,23입니다} 액체 배지에서 순수 분말 플라스틱을 중단 포함한다. 이러한 방법은 정의 된 시스템의 장점을 가지고 있지만, 그들은 가난 BDMS의 현장 저하 모방. BDMS가 토양 매트릭스에 걸쳐 작은 입자의 분산이 아니라, 판매 및 필름으로 사용되지 않기 때문에 먼저 표면적은 다르게 배포됩니다. 둘째, BDMS의 화학 메이크업은 순수 고분자 다릅니다. BDMS은 일반적으로 같은 첨가제를 포함충전제, 가소제 및 착색제, 이러한 첨가제함으로써 미생물의 성장과, 광물의 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서 특정 상업 영화의 구성은 그 현장 준비 형태로 독점, 플라스틱 필름 있었기 때문에 이러한 이유로, 그리고 곰팡이와 박테리아를 분리하기 위하여 이용되었다. 여기서 세균 고립감에 대한 적절한 수정주의와 단순화를 위해, 아래의 방법은, 곰팡이에 대해서만 설명합니다.

토양의 한 겨울의 최근 연구 ²⁴ 세 시판 BDMS 한 실험 영화는 하나의 성장시기에 대한 미국의 세 가지 다른 지역에서 농업 현장에서 사용되었으며, 이후 메쉬 (250 미크론) 가방에 넣고 매장 같은 사이트에서. 250 미크론 메시 오프닝 뿌리와 대부분의 토양 군을 제외하고, 토양 잠식 ^25,26을 최소화하면서 곰팡이 균사가 침투 할 수 있습니다. 나일론 물자는 토양에서 백 저하를 방지합니다. 다음의 발굴, Fungal 분리는 BDM 조각에서 회수 한천을 제외한 탄소 소스와 5cm 사전 disinfested했다 새롭고, 사용되지 않고는 BDM 필름의 X 5cm 표면 disinfested 사각형을하지 않고 최소 배지에서 성장을 평가 하였다. 필름으로 사용되는 대부분의 플라스틱은 무결성의 손실없이 압력 가마로 소독 할 수없는, 그래서 UV 빛이 플라스틱에 존재하는 모든 미생물 세포를 죽이는 데 사용되었다. ISO 846 ¹⁹ 70 %의 에탄올과 이후 건조 표면 disinfesting 권장하지만이 방법을 사용하는 경우, 하나는 영화의 어떤 구성 요소 또는 첨가제에 악영향을 에탄올에 의해 영향을받지 않습니다 있는지 확인해야합니다. BDMS은 아마도 햇빛을 견딜 수 있도록 제조되어 있기 때문에, UV는 오염 제거 방법으로 선택되었다.

혼자 최소 배지에서보다 더 BDM 조각에서 자란 균주 추가 연구를 위해 선정되었다. 그것은 일반적으로 농업 적 및 의학적하지 않음으로써 대사 활용되지 않기 때문에 한천, 해조류에 의해 생성 된 다당류, 미생물 미디어를 공고히하는 데 사용됩니다수있는 미생물하지만, 한천 가수 분해 효소는 토양 ^28에서 분리 한 해양 세균 ^(27)와 한천 가수 분해 박테리아에서 분리되었다. BDM 고분자 한천 잠재적 인 영양 소스로 이러한 고분자를 포함하는 환경에서 진화하지 않은 토양 곰팡이에 의해 분비 효소 드문 기판 것으로 예상하지만, 두 기판 (7 단계) 여기에 설명 된 플레이트 생물 검정에 존재하는 둘. 탄소 소스로 BDMS 아니라 한천을 사용하는 곰팡이는 BDM 필름 (실험)) 한천 (대조군), II 제외 i)없이 추가 탄소원을 포함하는 한천 응고 매체에 성장을 비교하여, 전용 한천을 사용하여 곰팡이 구별 할 수 있습니다 및 ⅲ) 포도당 (양성 대조군). 모든 균주의 성장은 최소 배지 플러스 포도당에 예상되고, 곰팡이가 발생하지 포도당 함유 판은 실험에 사용 된 특정 최소 배지에서 성장을 할 수 없습니다. 적합한 한쌍알 BDM degraders 한천 - 응고 최소 배지 + 그들이 혼자 한천 응고 최소 배지에 성장보다 더 BDM 영화에 성장합니다. 최소 배지 접시에 성장하는 곰팡이 한천 degraders 또는 oligotrophs이고, 또한 생물 검정 플레이트에 BDM 영화와 관련된 배지에서 성장할 것으로 예상된다,하지만 영화 자체 (그들은 serendipitously 또한 BDM 고분자를 분해하지 않은 경우)에.

한천 활용되지 BDMS의에 의한 미생물의 성장을 보는 가능성을 제거하기 위해, 우리는 정의 국물 매체 (9 단계)에서 생물 검정과 한천 플레이트에 BDM 식민지에 대한 우리의 초기 분석을 따랐다. BDM 조각은 생물 검정 튜브에 알려진 유일한 탄소 소스를 나타낸다.

초기 심사 후, 그리고 분리의 글리세롤 주식을 되살리는에, 일부는 알려진 탄소 소스를 포함하지 않는 액체 정의 된 배지에서 부족한 만 볼 균사를 형성했다. 이러한 결과는 인수 균주 중 일부는 oligot 있다고 제안rophs - 탄소, 질소, 및 수성 환경이나 공기 ^{29,30,31에있는} 휘발성 물질로 기존에 하나 용해 다른 영양소의 매우 작은 양의 청소 성장할 생물. 18S 리보솜 DNA 분석을 통해 종 식별이 뷰를 지원으로 일치하는 균주의 대부분은 곰팡이 장군은 이전 oligotrophy ³² 전시 보도했다. 일반적으로 saprophytes 있습니다 Oligotrophs은 환경 ^30의 범위에서 기판 활용 신진 대사 기능의 넓은 범위를 필요로합니다. 따라서, BDMS (아마도 특이한 효소 기능을 필요로하는)​​에서 우리가 격리 같은 곰팡이가 빈 영양 용량을 보여, 그리고 공기 지문, 먼지 또는 추적 휘발성 물질로부터 피부 오일 등의 미량 오염 물질에 성장할 수 있었던 것은 놀라운 일이 아니다. oligotrophs의 분리로 인해, 우리는 BDM 표면에 그 성장 혼자 BDM 고장을 추론하는 데 사용할 수 없습니다 결론을 내렸다. 방법은 여기에 SC에 우리의 노력을 반영하는 기술선의의 BDM 고장을위한 농업 토양에서 REEN 기본 BDM의 식민지 개척자.

프로토콜

이 절차는 토양 BDM 영화의 배양을 위해 적어도 몇 개월을 필요로하고, 한천 플레이트에와 식민과 저하를 평가하는 한천 무료, 화학적으로 국물에 모두 순차적 생물 검정을위한 몇 개월 이상. 각각의 방법들은이 수행 될 순서대로 나열되어 있습니다.

1. 토양의 BDM 영화의 배양

그들은 저하 것으로 예상되는 상황에서 사람들을 흉내내는 조건에서 토양으로 BDM 영화를 통합합니다. 주민 토양 및 샌드위치 13 × 13cm 나일론 메쉬 (250 미크론) 부대 안쪽에 흙 10cm × 10 센티미터 BDM 400 g의 (건조 중량에 해당) 획득. 나일론 실을 닫습니다. 배양 시간은 실험자의 판단이다. 모니터 및 / 또는 적절한 배양 기간 동안 정기적으로 미생물의 활동 (예를 들면 토양의 온도, 영양분과 수분)와 관련된 매개 변수를 수정합니다.

2. 미디어 준비및 시약

미디어 및 문화 튜브에 실수 영양소 소스를 도입 피하기 위해, 시약 급 화학 물질, 새로 구입 한 문화 관, I 초순수 (예 : NanoPure) 물을 입력하고 혼합 미디어 엄격하게 씻어 유리를 사용합니다. 시약의 교차 오염을 방지 - 그것은이 목적을 위해 시약의 전용 세트를 사용하여 유리 제품하는 것이 가장 좋습니다. 이 곰팡이는 그 성장에 아래 시약의 성분에 의해 억제되어 분리 할 수​​있는 가능성이있는 것에주의 해주세요. 이 문제가 발생하면 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.

1. 이전 미디어를 만들기 위해, 다음 실험실 세제 및 산 세척 (예를 들어 10 %의 염산에 하룻밤 담가)에 필요한 모든 유리를 세척한다. 증류수 열두 시간의 최소를 씻어 두 번 초순수합니다. 먼지를 제외 깨끗한 알루미늄 호일을 가진 모든 유리 제품을 포함한다. 장갑을 착용하고 지문에서 피부 오일을 제외 혈관의 안쪽 가장자리를 만지지 마십시오. 어떤 비누 RESI을 방지하려면회비 및 (미사용) 새로 구입 한 세척 및 멸균 유리 문화 튜브 및 모자의 식민지, 문화 곰팡이를 촉진 유리에 흠집.
2. 감자 덱스 트로 오스 한천은 (PDA) 토양 곰팡이의 초기 격리를 위해 사용하고, 하나의 고립 된 식민지 및 장기 저장을 위해 접종의 생성의 설립.입니다 제조업체의 지침에 따라 미디어를 준비하고 (50 ° C로 냉각시) 고압 증기 멸균 한 후, 30 μg / ML의 최종 농도에 추가 클로람페니콜은 (에탄올에서 10 ㎎ / ㎖ 원액부터), 박테리아를 제외 할 수 있습니다. 이 매체는 이제 PDA CHL ^{30이라고합니다.}
3. 곰팡이 최소 배지 (FMM)는 잠재적 인 곰팡이 플라스틱 degraders 접종 BDMS위한 견고한 기초로 사용됩니다. 옆 한천 (매체를 공고히하는 데 사용되는 경우)에서, 그것은 탄소 무료입니다. 탈 H ₂ O 약 800 mL로, 6.0 g에 NaNO _3, 0.52 g KCl을, 0.52 g _{황산 마그네슘을} 추가 · 7H2 O, 1.52 g KH ₂ PO _4, 1 ML Hutner의 미량 요소 stock 용액 (2.2 g ZnSO ₄ · 7H ₂ O 1.1 g H ₃ BO _3, 0.5 G MnCl ₂ · 4H ₂ O 0.5 g FeSO ₄ · 7H ₂ O 0.16 g CoCl ₂ · 5H ₂ O 0.16 g CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0.11 G (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O, 및 100 mL에 5.0 g 나 ₄ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 소주 H ₂ O ^{33 34.} NaOH를 사용하여 6.5로 산도를 조정하고 액체 생물 검정을위한 양 1 L.로 가져다 염의 침전을 방지하기 위해 FMM 필터 소독. 고체 배지가 필요한 경우, 16g의 한천 압력솥을 추가합니다. 연질 한천 인 경우 50 냉각 때 필요한, 8g / L에 한천을 감소 ° C, 30 μg / ML의 최종 농도에 클로람페니콜 추가 할 수 있습니다.이 매체는 현재 FMM CHL ^{30이라고합니다.} 컨트롤과 곰팡이 균주가 성장하도록 이 매체 FMM은 엄마이어야한다드 위에서 만 리터 당 10g의 포도당을 함유. 이 포도당 최소 배지 ³⁵ (GMM)이라고합니다.
4. 인산염 완충 식염수 ³⁶ (PBS) 토양 노출 BDMS의 초기 시리얼 희석 토양 입자와 미생물 세포를 중지하는 데 사용됩니다. PBS를 만들려면 8g 염화나트륨 0.2 g KCl을, 1.44 g 나 ₂ HPO _4, 증류수 0.24 g KH ₂ PO _4-800 ML를 추가합니다. 소금을 녹이고 염산으로 pH를 7.4로 조정합니다. 초순수 물 1 L에 전체 볼륨을 가져와. 9.5 ML 및 튜브 당 4.5 ML PBS 깨끗 문화 튜브를 채 웁니다. 압력솥.
5. 30 % (v / v)의 글리세롤은 -80 ℃에서 보관시 냉동 보관 박테리아와 효모 세포, 포자 및 곰팡이 균사체를 중지하는 데 사용됩니다 초순수에서이 솔루션을 확인합니다. 압력솥.
6. 0.01 % (V / V)는 트리톤 X-100은 곰팡이 포자를 중지하는 데 사용됩니다 세제 소수성 포자를위한 비 독성 습윤제 역할을합니다. 100 μL 트리톤 X를 해산초순수 물 1 L에 -100. 압력솥.
7. 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 (산도 7.2) SEM 고정시 글루 타르 알데히드 (glutaraldehyde)의 용매로 사용된다. 1 M 나 ₂ HPO ₄ 68.4 ML 1 M의 NaH ₂ PO ₄ 31.6 mL를 혼합하고 초순수 ^36에 1 L로 전체 볼륨을 가지고.

3. 생물 검정 자료의 준비 : BDM 필름의 표면 오염 제거

1. 절단기구에 종이 테이프와 같은 오염 물질의 잔해 잠재적 인 탄소 소스이기 때문에, 새로 구입 한 가위 나 신선한 면도날 및 절단 무기 표면을 사용합니다. 피부 오일과 BDM 영화의 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용 할 것. 작은 사각형 (4.25 X 4.25 cm)로 BDM 영화를 잘라. 이 크기 사각형은 표준 100 X 15mm 페트리 접시에 맞습니다.
2. BDM 영화 오염을 제거하는 살균 UV 램프 (발광 파장 = 253.7 nm의)를 사용합니다. 이러한 램프는 종종 표준 생물 안전 캐비닛에서 찾을 수 있습니다. 확인하는 경우UV 빛이 운영되고, BDM 영화를 오염시킬 수있는 생물 안전 캐비닛에 외부 공기의 어떤 흐름이 없습니다.
3. 70 % 에탄올과 공기를 세척하는 15 분 동안 송풍기를 구동 시키과 후드 안쪽에 젖은 표면. 그런 다음 창틀을 닫고 2 시간 동안 UV와 후드 표면의 오염을 제거.
4. 행 소독 후드 BDM 영화를 놓습니다. UV 빛은 2 시간 동안 영화에 빛나는 할 수 있습니다.
5. BDM 필름을 뒤집어 깨끗한 소독 집게를 사용합니다. 손과 팔이 직접 새로 소독 BDM 표면 위에되는 시간을 최소화하기 위해 다시 행 앞에 행과 일에 시작합니다. BDMS 뒤집기 때, 영화의 비 disinfested면이 있지만 이전에 접촉 UV 빛에 노출 청결한 장소에 아래쪽으로 새로 disinfested면을 배치합니다.
6. 각 측에 UV 처리 2 시간 후, 멸균 집게와 바이오 안전성 캐비닛에서 BDM 필름을 제거 다시 이미 decontami에 손과 팔을 배치하지 않도록 전면에서 후면으로 작업신도 영화. 이러한 포일으로 덮인 비커로 멸균 덮인 용기에 BDM 영화를 놓습니다. 어둠 속에서 RT에 저장합니다.

4. 플레이트 생물 검정 설정

무균 기술을 사용하여 멸균 전송 후드의 모든 단계를 수행합니다.

1. 한천 플레이트의 표면에 UV-disinfested BDM 조각을 놓으십시오. 첫 번째 코너를 설정하고, 부드럽게 한천과 접촉 광장 롤의 나머지 부분을 보자. 주름을 피하십시오. 일부 필름 보관시로 주름을 형성, 이것은 피할 수있다. 특히 박막 부분이 평평하다하기 위해 두 집게의 사용이 필요할 수 있습니다.
2. 물과 소수성 플라스틱의 초기 정착을위한 영양 공급을 제공하는 플라스틱 필름 꼭대기 반고체 FMM CHL ³⁰ 한천의 장소 구슬. 구슬은 물 투과 필름 필요하지 않습니다. 전자 레인지 한천을 다시 녹아 (각 고전 한 뿌리 덮개에 녹은 한천 네 10 μL 방울을 전송하는 micropipettor를를 사용NER). 바로이 구멍이 있으므로 뿌리 덮개로 피펫의 끝을 만지지 마십시오. 플레이트가 반전 될 때 뿌리 덮개에 초과 중량은 한천 표면에 묻은 플라스틱을 당길 수 있기 때문에 드롭 당 10 μl를 초과하지 마십시오.
3. 플레이트가 완전히 응고 하룻밤에 뚜껑의 오른쪽을 앉아서하고 ° C 어둠 속에서 4시에 밀봉 된 소매 한천 쪽을 저장할 수 있습니다. 때 생물 검정 (7 단계)를 수행 할 준비가) 하나의 FMM CHL ³⁰ (대조군)의 접시, II)의 반고체 FMM 플라스틱 필름에 CHL ⁽³⁰⁾ 및 III의 네 가지 10 μL 방울을 포함하는 하나의 생물 검정 판) 한 판을 나는 사용 GMM (양성 대조군). 이러한 방법으로, 네 개의 각각 분리의 복제는 중간 접시 당 테스트 할 수 있습니다.

5. 액체 생물 검정 설정

1. 단계 3.1 BDM 절단에 대한 지시 사항을 따르십시오. 이전 액체 생물 검정을위한 플라스틱 필름을 절단하기 위해, 문화 튜브에 맞는 크기를 선택합니다.여러 플라스틱 유형 중 균일 한 질량을 달성하기 위해 필요한 영역은 필름 두께에 따라 달라집니다. 우리는 0.0175 g에 해당하는 조각 15 X 150mm 배양 튜브에 잘 맞는 것으로 나타났습니다.
2. 위의 3 단계에서 설명한대로 UV 빛으로 필름을 표면 오염을 제거.
3. 미생물 분리의 각 복제에 대한 접종 세 튜브를 준비 : I) BDM 일정 크기의 조각 (실험), ⅱ)없이 탄소 소스 (대조군)의 5 ML의 FMM, 및 III를 포함하는 5 ML의 FMM)을 5 mL를 GMM (양성 대조군). 또한, 테스트 할 각 BDM을 포함 FMM의 튜브를 복제 할 준비 만하고 접종하지 않습니다. 이러한 제어 튜브 오염으로 인한 미생물의 성장을 보여줄 것입니다.

6. 균류의 분리

다음과 같은 토양 배양 및 샘플 제거는, 곰팡이는 BDM 필름을 준수 토양에서 격리됩니다. 원하는 경우, 박테리아는 simultaneou 수 있습니다교활한이 같은 곰팡이의 성장에게 ³⁷ 억제하는 50 ㎍ / ㎖의 cycloheximide로 보충 1/10X 희석 트립신 간장 효모 한천로 토양 세균의 분리에 적합한 미디어를 사용하여 동일한 방법으로 분리 할 수. 정의 매체가 5 단계와 7 세균 고립감을 위해 필요한 경우 M9 ³⁸ (플러스 cycloheximide) 좋은 선택입니다.

1. 샘플 처리 이전에, PBS 및 PDA CHL ^30을 준비합니다. PDA CHL ³⁰ 플레이트 뚜껑과 한천 표면에 결로를 제거하기 위해 약 24 시간 동안 상온에서 (unbagged) 건조하도록 허용합니다. 이전 레이블 PDA CHL ³⁰ 접시.
2. 1 단계에서 선택한 매장 사이트에서 BDM 조각을 포함 메쉬 가방을 발굴. 4로 발송 및 저장 ° C 토양에서 추출 후 48 시간보다 더 이상.
3. 멸균 주걱과 집게를 사용하여 부드럽게 플라스틱이 노출 될 때까지 흙을 제거하고 BDM 필름 표면에 집착입니다 흙을 털어되지 않습니다. 1cm로 BDM 필름을 잘라재료 0.5 g까지 2 개 조각은 총 4 개 복제 각각에 대해 복구됩니다. PBS의 9.5 ML을 포함하는 25 ML 문화 튜브에 0.5 g BDM 필름과 첨부 된 토양을 전송합니다. 뿌리 덮개가 완전히 저하 또는 토양 전용 컨트롤을 처리하는 경우, PBS로 토양 0.5 g을 넣고, 가능하면 여전히 남아있는 뿌리 덮개에서 변색하는 조각을 선택합니다.
4. 9.5 ML PBS와 높은 속도로 30 초 동안 0.5 G 뿌리 덮개를 포함 소용돌이 문화 튜브, 30 초 동안 다시 10 분, 그리고 소용돌이에 대한 sonicating 수조에 초음파 처리. 교반은 생물막을 분열 물리적 또는 뿌리 덮개 조각을 준수하는 임베디드 세포를 제거하고 균일 한 현탁액을 생성하기위한 것입니다.
5. 직렬 도금에서 개별 집락을 얻기 위해 PBS / 토양 용액을 희석하기 위해 준비합니다. 각 샘플의 경우, 4.5 ML 멸균 PBS로 가득 층류 후드 한 문화 관에서 개최. 각 샘플의 경우, 450 μL PBS로 가득 깊은 잘 96 - 웰 플레이트의 세 우물을 입력합니다.
6. 원래 플라스틱 / 토양 현탁액 (0.5 g 뿌리 덮개 플러스 PBS 용액의 9.5 ML)는 플라스틱을 준수 미생물 자료 5.0 × 10 ^-2 희석을 나타냅니다. 5.0 × 10 ^-3 희석을 얻기 위해 문화 튜브에 멸균 PBS의 4.5 ML이 원래 튜브에서 현탁액의 0.5 ML를 추가합니다. 높은 속도로 30 초 동안 소용돌이. 96 - 웰 플레이트에 PBS 450 μL에 50 μL를 추가합니다. /는 복제 모든 샘플에 대해이 단계를 반복합니다. 한꺼번에 샘플을 희석하기 위해 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 열 번 위아래로 pipetting에 의해 각각의 새로운 희석 혼합한다. 희석과 팁을 변경합니다. 5.0 × 10 ^-6 희석을 구성합니다.
7. (선택 사항) 균주 여기에 설명 된 샘플 곰팡이 균주보다 풍부했다; 동시에 세균을 분리함으로써 있다면, 위의 단계 6.6에서 5 × 10 ^-8로 연속 희석을 수행합니다.
8. 5.0 X를 통해 5.0 × 10 ^-3에서 각각 균등하게 100 μL ^10-6화염 멸균 구부러진 유리 막대와 PDA CHL ³⁰ 판의 한천 표면에 희석. 매장 판은 수직 30 분 후 알 수없는 균주의 포자의 탈출을 방지하기 위해 파라 필름과 플레이트를 밀봉 액체에 스며들게한다. ° C 어둠 속에서 모두 빠르고 느린 성장하는 곰팡이 식민지를 형성 할 수 있도록 5 일에서 20에서 거꾸로 번호판을 품어.

7. 플라스틱 분해 곰팡이의 초기 선택

중요 :이 시점에서 모든 문화는 단지 알 수없는 정체성의 포자와 환경 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 (안 층류 후드)에 오픈한다. 일부 토양 곰팡이와 박테리아는 잠재적으로 병원균이다.

1. 잘 절연 식민지를 포함 희석 플레이트를 검사합니다. 다른 식민지를 만지는되지 않은 식민지를 선택합니다.
2. 하나의 멸균 이쑤시개를 사용하면, 부드럽게 FMM의 한천 (단계 2.3에서 만들어진 식민지를 터치 한 후 터치 ), FMM이 순서 + 플라스틱 (4 단계에서 만든)와 GMM (단계 2.3에서 만든) 판. 플라스틱 필름 위에 한천 구슬을 접종하기 위해 플라스틱 필름을 통해 다음 한천 점과 와이프의 표면에 부드럽게 이쑤시개를 문지 르세요. 각각의 접시에 4 복제 줄무늬가 될 때까지 동일한 소스 식민지에서 접종를 반복합니다.
3. 몇몇은 모든 시각적 고유의 식민지 유형의 복제 모든 BDM 샘플에서 선택 될 때까지 반복 7.2을 통해 7.1 단계를 반복합니다.
4. 파라 필름과 인감 플레이트, 반전, 20 품어 ° 어둠 속에서 C 5 일.
5. 그들은 FMM에 성장보다 더 BDMS에 성장 균주를 식별합니다. 성장이 명확하지 않은 경우, 식민지 또는 그것의 부족 (그림 1)을 확인하기 위해 해부 현미경 표본을 볼 수 있습니다. 에 뚜껑을 유지, 뚜껑 결로가있는 경우, 새 뚜껑을 대체하는 것이 아니라 생물 안전 캐비닛에 이렇게.
6. 일단 잠재적 인 BDM의 degraders이 선택으로 사용terile 이쑤시개 플라스틱 자체를 정착 균의 접종을 긁어 및 PDA CHL ³⁰ 접시에 단일 콜로니 형성 - 장치의 절연을위한 행진합니다.
7. 파라 필름과 부화 PDA CHL ³⁰ 플레이트 씰 플레이트는 어두운 5 일 동안 20 ° C에서 플라스틱을 분해하는 균주를 접종.
8. 하나의 고립 된 식민지가 정화되어 이제는 그들이 테스트중인 플라스틱 필름을 식민지 진정으로 할 수 있는지 확인합니다. 멸균 이쑤시개 하나의 집락 형성 단위에서 접종을 (포자 효모 세포 또는 균사)를 수집. 반복 7.5을 통해 7.2 단계를 반복합니다. 20 ° C에서 배양 5 일 후, 곰팡이 성장을위한 생물 검정 플레이트를 검사합니다. 분리가 두 번째 (7.5)와 두 번째 (7.8) 시험에서 FMM에 성장보다 더 BDM 영화에 성장 경우, 8 단계 아래에 설명 분리를 저장합니다.

8. 플라스틱 Degraders의 장기 보관

(전체, 플라스틱 분해 균주가 다시 플레이트 생물 검정 (7.8)에서 테스트 한 고립 된 집락 형성 단위 (7.6)에 다시 정제, 플레이트 생물 검정 (7.5)에서 테스트 될 것입니다, 그리고 마지막으로, 액체 생물 검정에서 테스트 9.1-9.5). 테스트하는 동안 분리는 매달 새로운 미디어로 전송되어야하고, 작동 주식 플레이트 ° C 즉시 충분한 성장이 눈에 보이는 그대로 4시에 저장됩니다. 분리 된 균주는 ° C, 및 / 또는 살균 필터 디스크에 말린 포자로 4 ℃에서 -80 글리세롤 주식으로 저장해야합니다 두 저장 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

1. 각이 모두 첫 번째 (7.5)와 (7.8) 제 2 플레이트 생물 검정에서 FMM에 성장보다 더 BDM 필름 성장하는 격리를 들어, 두 개 또는 세 개의 살균 필터 종이 디스크로 직경 약 1cm 두 개의 PDA CHL ³⁰ 판을 준비 , 표면에. 에서이 두 접시에 접종동일한 단일 식민지 위의 단계 7.8에서 선택. 성장을 극대화하기 위해 한천에 균일하게 접종을 뿌려 잔디를합니다. 오일에 대해 20 ° C에서 파​​라 필름과 부화에 번호판을 봉인. 이 단계는 효율성을 위해 단계 7.8과 동시에 시작할 수 있습니다.
2. 한천 표면에 필터 디스크 균사체 / 포자로 덮여해야합니다. 멸균 에펜 도르프 튜브에 한천 소독 집게로 표면과 장소에서 필터 디스크를 제거합니다. 공기는 생물 안전 캐비닛 또는 교차 오염을 방지하기 위해 최소한의 공기 이동과 다른 건조, 멸균 환경에서 (캡 끈 상태) 에펜 도르프 튜브 내부의 하룻밤 필터 디스크를 말린다. 다음 4 ° C.에서 파라 필름 및 저장에 밀봉
3. 잔디 판에서 포자와 균사를 수확하는 멸균 면봉이나 이쑤시개를 사용합니다. cryovials 30 % 글리세롤의 포자와 균사를 일시 중지 -80에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결 ° C.

9. 엄격한 공동액체 생물 검정을 통해 플라스틱 활용 nfirmation

1. 잠재적 플라스틱 분해 균주의 포자 접종 PDA CHL ³⁰ 판 : 액체 문화를 접종 할 신선한 포자 및 / 또는 세포를 생성합니다. 파라 필름에 격판 덮개를 밀봉하고, 곰팡이 포자 볼 수 있습니다 ° C까지 20 알을 품다.
2. 생물 안전 캐비닛과 함께 접시를 세척하여 수확 포자 0.01 % 트리톤 X-100 (15 X 100mm 페트리 접시에 잘 작동 당 5 ㎖) 살균 구부러진 유리 막대를 가진 표면에서 포자 (또는 효모 세포)를 닦고 . 기음 포자 (또는 셀) 멸균 용기에 현탁액을 전송.
3. hemacytometer로 포자 또는 세포를 계산 1 × 10 ⁶ 포자 / 튜브의 총 FMM 국물의 5 ML에 추가 할 적절한 볼륨을 결정합니다. 볼륨 10 μL 이하이어야한다. 0.01 %에 집중 포자 현탁액의 희석 트리톤 X-100이 필요할 수 있습니다.
4. 멸균 전송 후드에서 준비한 문화 튜브를 접종 6 포자 (또는 효모 세포)와 함께> 5 단계. 특히 정체 불명의 분리를 위해, 포자의 탈출을 방지하기 위해 파라 필름과 캡을 밀봉하십시오. 20 ° C에서 어둠 속에서 부화와 성장을위한 매주 샘플을 관찰합니다.
5. 플라스틱 필름에 곰팡이의 균사 성장은 특히 플라스틱 필름의 가장자리에서 접종 후 첫 주 내에 표시 할 수 있습니다. 플랑크톤 효모 (같은 흐린 매체에 의해 입증)의 성장은 600 nm에서 흡광도 수치로 모니터링 할 수 있습니다. 곰팡이는 플라스틱 필름에 직접 부착 할 가능성이 있기 때문에, 성장이 눈으로 평가 될 수 있으며, 광학 현미경 및 / 또는 주사 전자 현미경 (SEM)으로 확인 할 수 있습니다.
6. FMM 전용 컨트롤에서 분광 방법을 사용하여 광학 밀도의 변화를 등록 할 너무 작아서 조금만 흰색 반점을 찾습니다. 이 반점은 파스퇴르 피펫으로 흡입 및 미분 간섭 (DIC) 현미경을 사용하여 관찰 할 수있다. 반점은 종종 식별 할 수없는 Preci에 있습니다pitate하지만, 일부 경우에 그들은 발아 실질적으로 증가하지 않았 원래 접종의 수풀 수 있습니다.
7. 실험 샘플 및 컨트롤의 식민지를 비교하는 시각과 현미경 관찰을 사용하고, BDM 필름의 각 샘플의 성장에 등급을 할당합니다. 많은 BDMS 컬러로 어두운와 가장자리를 제외하고 현미경을 통해 최소한의 관찰을 허용하고, 필름의 두께는 기름 침지 렌즈에서 관찰을 금지하고 있기 때문에, SEM은)에 설명 된 평가 시스템 등을 통해 미생물의 성장을 존재 I를 추정하는 데 유용합니다 표 1 및 II) BDM 저하의 정도.

10. SEM 샘플 준비

1. 복제 샘플에서 BDM의 작은 조각을 잘라 청소, 멸균 가위를 사용합니다. 24-48 시간 동안 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 (산도 7.2)에 2.5 % 글루 타르 알데히드에 담가 BDMS를 수정합니다.
2. 고정이 발생하는 동안, 10 % VO를 추가하여 100 % 순수 에탄올 탈수LUME 3 분자 체 (175-260 ° C에서 건조 오븐에서 활성화하고 데시 케이 터에서 냉각), 총 탈수을 보장하기 위해 하룻밤 실온에 앉아 할 수 있습니다.
3. 15 분 각각 네 개의 세척 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 (산도 7.2)에 담가 BDMS.
4. 5 분마다 세 가지 세척 용 초순수 물에 담가 BDMS.
5. 75 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % 각각의 농도에서 20 분간 침지, 에탄올 시리즈 BDM 샘플을 탈수. 씻어 20 분 동안 100 % 에탄올에 두 번 더 BDMS을 씻어.
6. 임계점 건조로 및 제목 샘플 코팅 스퍼터.

결과

최근 연구 ^24, 4, "생분해 성"이라는 세 가지 상용 BDMS 각각 플러스 실험 영화와 기존의 플라스틱 제어, 마운트 버논, 워싱턴에서 2010 년 봄에 토마토 생산을위한 뿌리 덮개로 토양에 배치 된을 복제 녹스빌, 테네시, 그리고 러벅, 텍사스. 2010 년 가을, BDM 영화 사각형은 네 복제 플롯에 뿌리 덮개를 풍화 각에서 절단되고, 기본 토양은 뿌리 덮개 샘플을 절제했던 영역 바로 아래에서 제?...

토론

이 절차는이 문서의 토양에서 잠재적 인 BDM의 degraders을 분리하기위한 첫 단계 기술을 대표하는 기술, 성공적 7 개월 토양에 묻혀 BDMS에서 곰팡이를 분리하기 위해 사용되었다. 곰팡이 필름은 곰팡이 성장 억제되지 않은 것과 같은 종류의 신선한 BDM 자료에 reinoculated 때 분리 된 곰팡이가 실제로 식민지 개척자 이었다는 것을 나타내는 성장합니다. 플라스틱 분해 곰팡이와 박테리아의 분리는 잠재?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents