Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Resumen

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Resumen

Los biomarcadores son cada vez más importante en la toma de decisiones clínicas, así como la ciencia básica. Diagnóstico de infarto de miocardio (MI) es impulsado en gran medida mediante la detección de proteínas cardiacos específicos en el suero o plasma de los pacientes como un indicador de daño miocárdico. Después de haber demostrado recientemente que la miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C) es detectable en el suero después de MI, se ha propuesto como un biomarcador potencial de MI. Los biomarcadores se detectan generalmente mediante ensayos inmunoenzimáticos sándwich tradicionales. Sin embargo, esta técnica requiere un gran volumen de muestra, tiene un pequeño rango dinámico, y puede medir sólo una proteína a la vez.

A continuación os mostramos un inmunoensayo múltiplex en el que tres proteínas cardíacas se pueden medir simultáneamente con una alta sensibilidad. Medición cMyBP-C en uniplex o junto con creatina quinasa MB y troponina I cardiaca mostró una sensibilidad comparable. Esta técnica utiliza la Meso Escala Descubrimiento(MSD) método de multiplexación en una placa de 96 pocillos junto con electroquimioluminiscencia para la detección. Aunque sólo se necesitan pequeños volúmenes de muestra, se logran una alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Usando esta técnica, que mide cMyBP-C, MB de creatina quinasa y troponina I cardiaca en muestras de suero de 16 pacientes con MI y se compararon los resultados con 16 sujetos control. Hemos sido capaces de detectar los tres marcadores en estas muestras y encontramos los tres biomarcadores que aumentaron después de un IM. Esta técnica es, por lo tanto, adecuado para la detección sensible de los biomarcadores cardíacos en muestras de suero.

Introducción

La medición de bajas cantidades de proteína en muestras biológicas complejas, tales como el suero, es de creciente importancia clínica para el tratamiento del paciente, así como la ciencia básica. Por ejemplo, un aumento en los niveles séricos de biomarcadores cardíacos, tales como la troponina I, en un entorno clínico es compatible con infarto agudo de miocardio (MI) ^1. Para detectar las proteínas en muestras de suero, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima estándar (ELISA) es la técnica utilizada con mayor frecuencia, ya que tiene una alta sensibilidad y permite la cuantificación absoluta del analito. Sin embargo, las pruebas ELISA tradicionales requieren una cantidad relativamente grande de muestra (típicamente 100 l), tienen una alta señal de fondo en algunos fluidos biológicos, y están restringidos a la medición de un solo analito por ELISA ^2.

Recientemente, una nueva técnica de inmunoensayo se introdujo que evita muchos de estos inconvenientes. Este ensayo modificado, desarrollado por MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para la detección de la señal, lo que permite un fondo muy bajo y un aumento de la sensibilidad, que permite el uso de volúmenes de muestra pequeños. Electroquimioluminiscencia se basa en el reportero molécula de rutenio (II) trisbipyridal, que se une a los anticuerpos de detección. Esta molécula indicadora emite luz a 620 nm de la estimulación eléctrica de la parte inferior de la placa de 96 pocillos que tiene electrodos de carbono integrados en ellos ^3. Además, mediante el uso de recubrimiento lugar, múltiples anticuerpos de captura pueden ser recubiertas en un pocillo (hasta 10 en una placa de 96 pocillos), lo que permite la cuantificación simultánea de diferentes proteínas en una sola muestra ^4. Esta técnica se ha utilizado recientemente para medir los perfiles de citoquinas proinflamatorias en suero de ^5,6. Las placas multiplex de MSD se comparan favorablemente con otras plataformas de ensayo multiplex ^7.

Usando MSD como la plataforma de ensayo principal, desarrollamos además un encargo placa 3-plex que cuna vez cuantificar el nivel de miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C), MB de creatina-cinasa (CK-MB) y troponina I (cTnI), y los resultados se compararon con la detección monoplex de cMyBP-C. CK-MB y cTnI son marcadores biológicos bien establecidos para MI. Sin embargo, los aumentos de estos biomarcadores pueden ser causadas por patologías distintas de MI, por ejemplo, miocarditis o insuficiencia renal ^8. Esto aboga por la adición de biomarcadores adicionales para aumentar la especificidad del diagnóstico de MI. Recientemente hemos demostrado que cMyBP-C es también un biomarcador potencial para MI ^9. cMyBP-C es una proteína asociada a filamento grueso que se expresa en el corazón, ^10-12, pero no en los músculos esqueléticos o lisos. Por lo tanto, el aumento del nivel de cMyBP-C en el sistema circulatorio es un indicador específico de daño cardíaco ^13.

En este estudio, se comparó la detección de uniplex cMyBP-C con el uso de un ensayo de 3-complejo de encargo para medir los niveles séricos decMyBP-C, CK-MB y cTnI en el suero de los pacientes con infarto de miocardio. En el futuro, esta técnica de firma puede ser utilizada para diagnosticar infarto de miocardio en pacientes con dolor torácico en urgencias.

La junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Loyola de Chicago aprobó el estudio para el uso de muestras humanas deidentified y el uso del inmunoensayo (LU # 20392).

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Protocolo

1. Uniplex cMyBP-C Ensayo

1. El día antes del experimento, cubra la placa estándar de 96 pocillos desnuda MSD con el anticuerpo de captura. Para cMyBP-C, utilizar un volumen de 30 l de anticuerpo anti-ratón cMyBP-C monoclonal (gelatina libre) a una concentración de 5 g / ml diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Dado que el pozo es hidrófobo, pipetear la solución en la esquina inferior del pozo; luego toque los lados de la placa para extender la solución sobre todo el bien.
3. La placa se cubre con un sellador de placas y se incubaron O / N a 4 ° C sin agitación.
4. Eliminar la solución de anticuerpo de captura pulsando la solución a lo largo de un sumidero y luego en una pila de toallas de papel. La unión no específica a la placa se bloqueó mediante la adición de 150 l de un 5% (w / v) de una solución bloqueador (BSA de alto grado) en PBS a cada pocillo.
5. Tapar la placa e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm.
6. Durante la etapa de bloqueo, se preparan las normas y sejemplos. Hacer la serie estándar mediante la dilución de fragmento de proteína recombinante cMyBP-C (aminoácidos 1-271) a una concentración de partida de 2000 ng / ml en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS. A continuación, se diluye en serie en un factor de 5 en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS. Total de los estándares se utilizaron 7 + 1 blanco (1% (w / v) Un bloqueador de PBS solo /).
7. Eliminar la solución de bloqueo y se lava la placa 3x con 150 0,05% Tween-20/PBS l (v / v). Cada vez, eliminar la solución de lavado invirtiendo la placa sobre un fregadero. Después de la tercera etapa de lavado, película vigorosamente la placa sobre un lavabo y golpea suavemente la placa vigorosamente sobre una capa de papel de cocina hasta que esté completamente seco. Este es un paso crucial, ya que los volúmenes de incubación son pequeñas, y cualquier solución de lavado restante se diluye significativamente la siguiente incubación.
8. Pipetear 25 l de estándares y muestras en los pocillos. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente, con agitación a 700 rpm durante 1 hora.
9. Preparar la solución de anticuerpo de detección a 1 g / ml en 1% bloqueador de A / PBS. A custom hizo anticuerpo cMyBP-C (aminoácidos epítopo 2-14) con MSD SULFO-TAG etiquetado sirve como anticuerpo de detección. Los kits están disponibles para sulfo-TAG etiquetado, por lo que es un procedimiento relativamente simple para etiquetar cualquier anticuerpo.
10. Repetir la etapa de lavado como se ha descrito en el paso 1.4.
11. Añadir 25 l de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo, sellar la placa, y se incuba a TA durante 1 h en un agitador de placas ajustado a 700 rpm.
12. Durante el período de incubación, ejecute MSD de demostración-plate (placa con luces LED) para garantizar el correcto funcionamiento del Imager Sector y software (consulte la sección de reactivo). También, se diluye la lectura-tampón, que se proporciona por MSD, mediante la adición de 5 ml de tampón de lectura-4x a 15 ml de agua destilada.
13. Repetir la etapa de lavado como se ha descrito en el paso 1.4.
14. Añadir 150 l de buffer de lectura a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Asegúrese de evitar burbujas de aire (pipeteo reverso es un método adecuado). Después de la adición de la lectura-buffer, escanear inmediatamente la placa en el SectorImager.

2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB y cTnI Ensayo

1. Una placa de 96 pocillos 3-plex y diluyente soluciones se dejaron equilibrar a la temperatura ambiente antes de su uso. Esta placa es pre-recubiertas con anticuerpos de captura para cMyBP-C, CK-MB y cTnI por MSD.
2. Añadir 25 l de 1% (w / v) Un bloqueador / PBS a cada pocillo. Pulse en los lados de la placa para asegurarse de que todo el pozo está cubierto por la solución.
3. Sellar la placa con un sellador de placas, coloque la placa en un agitador de placas, y agitar a 700 rpm durante 30 min.
4. Mientras tanto, se preparó una serie de dilución de los calibradores individuales. Debido a que cada pocillo tiene tres anticuerpos de captura tres calibradores deben ser mezclados y diluidos en serie antes de su uso. Diluir cMyBP-C recombinante, CK-MB (MSD), y cTnI (MSD) juntos en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear una muestra con 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, y 25 ng / ml de cTnI (muestra A).
5. Un volumen final de al menos 100 l se prepara para cada estándar. Acompletar la serie estándar, diluir en serie las muestras están en un factor de 5. Usa 25 l de muestra A en 100 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear muestra B. A continuación, utilice 25 l de la muestra B en 100 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS para crear muestra C , y así sucesivamente. Muestras de suero humano de 16 pacientes con IM y 16 sujetos de control se utilizan para medir los niveles de cTnI cMyBP-C, CK-MB, y. Estas muestras se diluyeron 2 veces en 1% (w / v) Un bloqueador / PBS.
6. Añadir 25 l de los estándares y las muestras diluidas a la 25 l ya presente en los pocillos de la placa 3-plejo. Es importante también incluir un espacio en blanco (sólo diluyente). Para establecer la técnica, las muestras se cargan en triplicado técnicas. De lo contrario, los duplicados son suficientes.
7. Sellar la placa de nuevo (sellador de placas puede ser reutilizado) y se incuba en un agitador de placas (700 rpm) a temperatura ambiente durante 2 h.
8. Justo antes de que se terminó la incubación, se preparó la solución de anticuerpo de detección. El diluyente utilizado es 1% (w / v) en PBS Un bloqueador. Todos THRanticuerpos de detección ee sulfo-etiquetados se diluyen juntos en una concentración final de 1 mg / ml cada uno. Detección de anticuerpos se proporcionan normalmente a una concentración madre 50 veces.
9. Para una placa de 96 pocillos completa, se necesita 2.700 l de solución total diluido (con pipeteado de error incluido). Añadir 54 l de cada anticuerpo de detección a 2.538 l 1% (w / v) Un bloqueador / PBS.
10. Después de 2 horas, eliminar soluciones agitando vigorosamente por la placa por encima de un fregadero. Lavar los pocillos 3 veces con 150 l de 0,05% de Tween-20 en PBS. Añadir 25 l de solución de anticuerpo de detección a cada pocillo usando una pipeta multicanal, y los lados de la placa son parches para garantizar que todo el pozo está cubierto por la solución.
11. Tapar la placa e incubar durante 1 hora con agitación a 700 rpm.
12. Durante el período de incubación, ejecute MSD de demostración-plate (placa con luces LED) para garantizar el correcto funcionamiento del Imager Sector y software. También diluir la lectura-tampón, que se proporciona por MSD, mediante la adición de 5 ml de 4x lecturaamortiguar a 15 ml de agua destilada.
13. Repetir el paso de lavado descrito en el paso 2.8.
14. Añadir 150 l de tampón de lectura a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Evitar las burbujas de aire es crítico (pipeteo inverso es un método adecuado). Después de la adición de la lectura-buffer, escanear inmediatamente la placa en el Imager Sector.

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Resultados

Los principios básicos y de flujo de trabajo de ensayo de la 3-plex se muestran en la Figura 1, el flujo de trabajo y en general se describe en la Tabla 1. Ensayos de Uniplex trabajan a lo largo del mismo principio, excepto que toda la parte inferior así se recubre con un anticuerpo de captura. Detección de la señal se realiza mediante ECL en que se aplica una señal eléctrica a la parte inferior del pozo. Esto, a su vez, inicia una producción local de la luz a través de una reac...

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Discusión

En este estudio, mostramos la aplicabilidad de un inmunoensayo múltiplex para la detección de múltiples biomarcadores cardíacos en el suero de los pacientes. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre ELISA tradicional. En primer lugar, ECL en el kit de ensayo se utiliza en lugar de la detección colorimétrica. En ECL, una señal eléctrica estimula la producción local de la propiedad medida (la luz), desacoplando así el caso de la estimulación de la señal, lo que reduce el fondo ^14. Esto permite u...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001