Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Zusammenfassung

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Zusammenfassung

Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine ​​in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen.

Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine ​​gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.

Einleitung

Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) ^1. Um Proteine ​​im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben einen hohen Hintergrundsignal in einigen biologischen Flüssigkeiten, und sind mit der Messung nur eines Analyten per ELISA ² beschränkt.

Kürzlich wurde ein neues Immunoassay-Technik vorgestellt, umgeht viele dieser Nachteile. Diese modifizierte Assay entwickelt von MSD verwendet electrochemiluminescausübt (ECL) zur Signalerfassung, die für einen sehr niedrigen Hintergrund und eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht, so dass die Verwendung von kleinen Probenvolumina. Elektrochemilumineszenz ist der Reporter-Molekül Ruthenium (II) trisbipyridal, die den Nachweis-Antikörper gebunden basiert. Das Reportermolekül emittiert Licht bei 620 nm auf die elektrische Stimulation der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen, die Kohlenstoff-Elektrode in ihnen ³ integriert ist. Auch durch die Verwendung Spotlackierung können mehrere Einfang-Antikörper in einer Vertiefung (bis 10 auf einer 96-Well-Platte) beschichtet, um für die gleichzeitige Quantifizierung von verschiedenen Proteinen in einer einzigen Probe ^4. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um proinflammatorische Zytokin Profile im Serum ^5,6 messen. Die Multiplex-Platten von MSD positiv auf andere Multiplex Assay-Plattformen ⁷ zu vergleichen.

Mit MSD als primäre Assay-Plattform, wir weiterentwickelt eine maßgeschneiderte 3 komplexe Platte, dass ceine gleichzeitig auch den Grad der kardialen Myosinbindungsprotein-C (cMyBP-C), Creatin-Kinase-MB (CK-MB) und Troponin I (cTnI), und die Ergebnisse wurden mit Monoplex Detektion cMyBP-C verglichen. CK-MB und cTnI sind gut etablierte Biomarker für MI. Allerdings kann erhöht dieser Biomarker von Krankheiten außer MI verursacht werden, z. B. Myokarditis oder Nierenversagen ^8. Dies spricht für die Zugabe von zusätzlichen Biomarker, um die Spezifität des MI Diagnose zu erhöhen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass cMyBP-C ist auch ein potentieller Biomarker für MI ^9. cMyBP-C ist ein dickes Filament assoziierten Protein, das in das Herz, ^10-12, aber nicht in Skelett-oder glatte Muskulatur exprimiert wird. Somit ist das erhöhte Niveau der cMyBP-C in das Kreislaufsystem ein spezifischer Indikator für Herzschäden ^13.

In dieser Studie verglichen wir Uniplex Erkennung cMyBP-C mit der Verwendung einer benutzerdefinierten 3-Plex Assay Serumspiegel messencMyBP-C, CK-MB und cTnI im Serum von Patienten mit MI. In Zukunft könnte diese Signatur Technik verwendet, um MI bei Patienten mit Brustschmerzen in der Notaufnahme diagnostizieren.

Die Institution Review Board (IRB) der Loyola University Chicago genehmigten die Studie für den Einsatz von deidentified humanen Proben und die Verwendung des Immunoassays (LU # 20392).

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Protokoll

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. Am Tag vor dem Experiment, Mantel der 96er MSD bloßen Standard-Platte mit Capture-Antikörper. Für cMyBP-C, mit einem Volumen von 30 ul monoklonalen Maus-anti-cMyBP-C-Antikörper (Gelatine frei) in einer Konzentration von 5 g / ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Da das gut ist hydrophob, Pipette die Lösung in der unteren Ecke des Brunnens, dann tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Lösung über den gesamten gut verteilt.
3. Die Platte wird mit Abklebefolie abgedeckt und O / N bei 4 ° C ohne Schütteln.
4. Entfernen Sie die Capture-Antikörper-Lösung, indem die Lösung über einen Waschbecken und dann auf einem Stapel Papierhandtücher. Nicht-spezifische Bindung zu der Platte wird durch Zugabe von 150 ul einer 5% (w / v) Blocker-A (high-grade BSA) in PBS in jede Vertiefung blockiert.
5. Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute.
6. Während der Sperrung Schritt, bereiten die Standards und sBeispiele. Machen Sie das Standard-Serie durch Verdünnen rekombinantes cMyBP-C-Protein-Fragment (Aminosäuren 1-271) zu einer Ausgangskonzentration von 2.000 ng / ml in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Dann seriell um den Faktor 5 verdünnt in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Insgesamt 7 Standards + 1 Rohling (1% (w / v) Blocker A / PBS allein) wurden verwendet.
7. Blocking-Lösung und waschen die Platte 3x mit 150 ul 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Jedes Mal, entfernen Sie die Waschlösung durch Umdrehen der Platte über einem Waschbecken. Nach dem dritten Waschschritt Flick energisch die Platte über ein Waschbecken und klopfen Sie die Platte mit Nachdruck auf einer Schicht von Papiertüchern, bis es vollständig trocken ist. Dies ist ein entscheidender Schritt, da Inkubationsvolumina klein sind und der verbleibende Waschlösung deutlich verdünnen die nächste Inkubation.
8. Je 25 ul Standards und Proben in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und Inkubation bei RT unter Schütteln bei 700 rpm für 1 Stunde.
9. Bereiten Sie die Detektions-Antikörper-Lösung bei 1 ug / ml in 1%-Blocker A / PBS. A custom gemacht cMyBP-C-Antikörper (Epitop Aminosäuren 2-14) mit MSD SULFO-TAG Kennzeichnung dient als Nachweis-Antikörper. Kits sind für SULFO-TAG Kennzeichnung vorhanden, so dass es ein relativ einfaches Verfahren, um jede Antikörper beschriften.
10. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben.
11. In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung, versiegeln Sie die Platte, und Inkubation bei RT für 1 h auf einem Schüttler bei 700 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
12. Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software (siehe Reagenz Abschnitt) zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x Lese-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser.
13. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben.
14. In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Achten Sie darauf, um Luftblasen (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode) zu vermeiden. Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der BrancheImager.

2. 3-Komplex cMyBP-C, CK-MB und cTnI Assay

1. Ein 96-Loch-3-Komplex Platte und Verdünnungsmittel Lösungen auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. Diese Platte ist vorher mit Fänger-Antikörper für cMyBP-C, CK-MB und cTnI von MSD.
2. In 25 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS in jede Vertiefung. Tippen Sie auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist.
3. Verschließen Sie die Platte mit Abklebefolie, legen Sie die Platte auf einem Schüttler, und schütteln bei 700 rpm für 30 min.
4. In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe Einzelkalibrators hergestellt. Da jeder gut drei Fänger-Antikörper drei Kalibratoren müssen gemischt und seriell vor Gebrauch verdünnt. Verdünnen rekombinanten cMyBP-C, CK-MB (MSD) und cTnI (MSD) zusammen in 1% (w / v) Blocker A / PBS auf eine Probe mit 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml zu erstellen CK- MB und 25 ng / ml cTnI (Probe A).
5. Eine endgültige Volumen von mindestens 100 ul wird für jeden Standard vorbereitet. Umrunden das Standard-Serie, seriell verdünnt die Proben um den Faktor 5. Verwenden Sie 25 ul der Probe A in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe B. Dann erstellen Sie verwenden 25 ul Probe B in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe C erstellen und so weiter. Humanes Serum-Proben von 16 Patienten mit MI und 16 Kontrollpersonen wurden verwendet, um cMyBP-C, CK-MB und cTnI zu messen. Diese Proben wurden verdünnt, 2x in 1% (w / v) Blocker A / PBS.
6. In 25 ul der Standards und verdünnten Proben auf die 25 ul bereits in den Vertiefungen der Platte 3-Komplex. Es ist wichtig, auch eine leere (nur Verdünnungsmittel). Um die Technik zu etablieren, werden die Proben in technischen dreifach geladen. Ansonsten sind Duplikate ausreichend.
7. Verschließen Sie die Platte wieder (Abklebefolie kann wiederverwendet werden) und Inkubation auf einem Schüttler (700 rpm) bei RT für 2 Stunden.
8. Kurz bevor die Inkubation abgeschlossen ist, wird der Nachweis-Antikörper-Lösung hergestellt. Das verwendete Verdünnungsmittel ist 1% (w / v) Blocker-A in PBS. Alle three Sulfo-markierten Nachweisantikörper gemeinsam in einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder verdünnten. Detektions-Antikörper sind in der Regel bei einer 50x stock Konzentration zur Verfügung gestellt.
9. Für eine vollständige 96-Well-Platte, ist 2.700 ul gesamten verdünnten Lösung benötigt (mit Pipettieren Fehler enthalten). In 54 ul jeder Detektionsantikörper zu 2.538 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS.
10. Nach 2 Stunden, entfernen Lösungen durch kräftiges Ausklopfen der Platte über einem Waschbecken. Waschen Sie die Wells 3x mit 150 ul von 0,05% Tween-20 in PBS. In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette, und die Seiten der Platte abgegriffen werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist.
11. Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute.
12. Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x lesen-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser.
13. Wiederholen Sie den Waschschritt in Schritt 2.8 beschrieben.
14. In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Luftblasen vermeiden ist entscheidend (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode). Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der Branche Imager.

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Ergebnisse

Die Grundprinzipien und Workflow des 3-Komplex Assays sind in Abbildung 1 dargestellt, und die gesamte Workflow wird in Tabelle 1 beschrieben. Uniplex Assays arbeiten nach dem gleichen Prinzip der Ausnahme, dass der gesamte Boden ist gut mit einem Capture-Antikörper beschichtet. Signalerfassung durch ECL in dem ein elektrisches Signal an den Boden des Bohrlochs angelegt wird, durchgeführt. Dies wiederum löst eine lokale Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion der Lese-Puffe...

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Diskussion

In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund ¹⁴ reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Em...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001