Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

요약

복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.

초록

바이오 마커뿐만 아니라 기초 과학, 의사 결정 임상에서 점점 더 중요 해지고 있습니다. 진단 심근 경색 (MI)는 주로 심근 손상의 지표로 환자의 혈청 또는 혈장 내 심장 특정 단백질을 감지하여 구동된다. 최근 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C)은 MI 후 혈청에서 감지 할 수 있다는 것을 보여 한, 우리는 MI에 대한 잠재적 인 바이오 마커로 제안했다. 바이오 마커는 일반적으로 전통적인 샌드위치 효소 결합 면역 분석에 의해 감지됩니다. 그러나,이 기술은 큰 샘플 볼륨을 필요로하는 작은 동적 범위를 가지고 있으며, 한 번에 하나의 단백질을 측정 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 3 개의 심장 단백질은 높은 감도를 동시에 측정 할 수있는 멀티 플렉스 면역을 보여줍니다. 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌과 uniplex 또는 함께 cMyBP-C를 측정하는 나는 비교 감도를 보여 주었다. 이 기술은 메조 스케일 검색을 사용하여검출 electrochemiluminescence과 함께 96 - 웰 플레이트에 멀티플렉싱 (MSD) 메소드. 단지 작은 샘플 볼륨이 필요하지만, 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 cMyBP-C, 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌 MI 16 과목에서 혈청 샘플에서 나는 수준을 측정하고 16 대조군과 결과를 비교 하​​였다. 우리는이 샘플에서 세 마커를 감지 할 수 있었고, MI 후 증가 할 세 가지 바이오 마커를 발견했다. 이 기술은 따라서 혈청 샘플에서 심장 생체의 과민 한 탐지에 적합합니다.

서문

같은 혈청과 같은 복잡한 생물 학적 샘플, 단백질의 낮은 양의 측정은 환자의 관리뿐만 아니라 기초 과학에 대한 성장 임상 중요하다. 예를 들어, 임상 환경에서 이러한 트로포 닌 I와 같은 심장 바이오 마커의 혈청 수준에있는 증가는 급성 심근 경색 (MI) ^1과 일치한다. 그것은 높은 감도를 가지고 있으며, 분석의 절대 정량을 허용으로 혈청에있는 단백질을 검출하는 표준 효소 결합 면역 분석 (ELISA)는 가장 자주 사용되는 기술이다. 그러나 전통적인 ELISAs는 샘플 상대적으로 많은 양의 (일반적으로 100 μL) 필요로하는 일부 생물학적 체액에서 높은 배경 신호를 가지고 있고, ELISA ² 당 하나의 분석의 측정으로 제한됩니다.

최근 새로운 면역 기술은 이러한 단점을 많이 우회하는 도입되었습니다. 이 수정 된 분석은, MSD에 의해 개발, electrochemiluminesc를 사용작은 샘플 볼륨의 사용을 가능하게 매우 낮은 배경과 감도를 증가 수 있습니다 신호 검출을위한 레퍼런스 (ECL). Electrochemiluminescence이 검출 항체에 부착 기자 분자 루테늄 (II) trisbipyridal을 기반으로하고 있습니다. 이 기자 분자들을 ^3에 통합 된 탄소 전극을 가지고 96 - 웰 플레이트의 바닥의 전기 자극에 620 nm의 빛을 방출한다. 또한, 현장 코팅을 사용하여 여러 개의 캡처 항체는 하나의 ^견본에 다른 단백질의 동시 정량 있도록 잘 하나 (최대 10 96 - 웰 플레이트에)으로 코팅 할 수 있습니다. 이 기술은 최근 혈청 ^5,6에서 염증성 사이토 카인 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다. MSD에서 멀티 플레이트는 호의적 ​​다른 멀티 플렉스 분석 플랫폼 ⁷ 비교합니다.

기본 분석 플랫폼으로 MSD 사용하여, 우리는 또한 3 플렉스 플레이트를 만든 사용자 지정을 개발하는 C동시에 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C), 크레아틴 키니 아제 MB (CK-MB), 및 심장 트로포 닌 I (cTnI는)의 수준을 정량화하고, 결과는 cMyBP-C의 monoplex 감지 하였다. CK-MB 및 cTnI는 미시간 잘 확립 된 생체 있습니다. 그러나 이러한 생체의 증가는 예를 들어, 심근염이나 신장 장애 ^8, MI 이외의 병리에 의해 발생할 수 있습니다. 이 MI 진단의 특이도를 높이기 위해 추가로 생체의 추가를 위해 주장하고있다. 우리는 최근 cMyBP-C는 MI ^9에 대한 잠재적 인 바이오 마커 것으로 나타났습니다. cMyBP-C은 심장 아니라 골격이나 부드러운 근육에 ^10-12로 표현 두꺼운 필라멘트 연관된 단백질이다. 따라서, 순환 시스템의 cMyBP-C의 증가 수준은 심장 손상 ^13의 특정 지표입니다.

본 연구에서는 혈청 수준을 측정하기 위해 사용자 지정 3 복잡한 분석의 사용과 cMyBP-C의 uniplex 검출 비교cMyBP-C, CK-MB, 및 MI 환자의 혈청 cTnI는. 미래에이 서명 기법은 응급실에서 흉통 함께 제시 환자에서 MI를 진단하는 데 사용할 수 있습니다.

Loyola 대학 시카고의 기관 심의위원회 (IRB)는 deidentified 인간의 샘플의 사용과 면역의 사용 (LU # 20392)에 대한 연구를 승인했다.

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프로토콜

1. Uniplex cMyBP-C의 분석

1. 캡처 항체 실험, 코트는 96 - 웰 MSD 베어 표준 플레이트 전날. cMyBP-C의 경우, 5 ㎍ / 인산에 희석 ML의 농도로 마우스 단일 클론 항 cMyBP-C 항체 (젤라틴 무료)의 30 μL 볼륨을 사용 (PBS) 염분 버퍼.
2. 잘 소수성이기 때문에, 잘 하단 모서리에 솔루션을 피펫, 다음 전체도에 걸쳐 솔루션을 확산 판의 측면을 누릅니다.
3. 플레이트는 플레이트 봉인으로 덮여 떨고없이 ° C 4에서 O / N을 배양한다.
4. 싱크대 후 종이 수건의 스택에 해결책을 눌러 캡처 항체 솔루션을 제거합니다. 판에 비 특정 바인딩은 5 % (W / V) 차단 각각의 well에 PBS에서 A (고급 BSA) 용액 150 μl를 추가하여 차단됩니다.
5. 700 rpm으로 흔들어 RT에서 1 시간 동안 접시와 부화를 밀봉하십시오.
6. 차단 단계에서 표준을 준비하고의불가능한 명령어. 1 % 2,000 NG / ML (W / V) 차단 PBS /의 시작 농도 - 재조합 cMyBP-C 단백질 조각 (271 아미노산 1)을 희석하여 표준 시리즈를 확인합니다. 다음 직렬 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 5 배 희석. 7 기준 총 + 1 빈 (1 % (W / V) 차단기 A / PBS 만)을 사용 하였다.
7. 차단 솔루션을 제거하고 150 μL 0.05 % (v / v)의 Tween-20/PBS와 배 접시를 씻으십시오. 때마다, 싱크대 위의 반전 플레이트 세척 용액을 제거. 세 번째 세척 단계 후, 적극적으로는 싱크대 접시를 가볍게하고 완전히 건조 될 때까지 종이 타월 레이어에 적극적으로 판을 두드려. 배양 볼륨이 작아서 이것은 중요한 단계이며, 나머지 세척 솔루션은 크게 다음의 배양을 희석합니다.
8. 우물에 표준 시료의 피펫 25 μL. 1 시간 동안 700 rpm으로 흔들어 동안 RT에서 접시와 부화를 밀봉하십시오.
9. 1 % 차단 / PBS에 1 ㎍ / ㎖에서 검출 항체 솔루션을 준비합니다. CUMSD 설포-TAG 라벨 검출 항체의 역할에 - STOM은 cMyBP-C 항체 (14 항원 아미노산 2)를 만들었다. 키트는 어떤 항체를 레이블링하는 비교적 간단한 절차를 만들고, 설포-TAG 라벨에 사용할 수 있습니다.
10. 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
11. 각각의 well에 탐지 항체 용액 25 μl를 추가, 쉐이커 700 rpm으로 설정 한 접시에 1 시간 동안 RT에서 플레이트와 부화를 밀봉하십시오.
12. 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어 (시약 섹션 참조)의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한, 15 ML 증류수에 배속 읽기 버퍼의 5 ML을 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석.
13. 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
14. 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 well에 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 기포 (역 피펫은 적절한 방법이다)을 방지해야합니다. 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야에서 접시를 스캔영상.

2. 3 복잡한 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 분석

1. 96 - 웰 3 - 플렉스 플레이트와 희석제 솔루션은 사용하기 전에 RT 평형을 할 수 있습니다. 이 판은 MSD에 의해 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 대한 캡처 항체 사전 코팅.
2. 1 % (w / v)의 차단 각각의 well에 A / PBS의 25 μl를 추가합니다. 전체도이 솔루션이 포함되어 있는지 확인하기 위해 접시의 측면을 누릅니다.
3. 플레이트 봉인 플레이트를 밀봉 판 뿌리에 접시를 놓고 30 분간 700 rpm으로 흔들어.
4. 한편, 개별 교정기의 희석 시리즈는 준비가되어 있습니다. 각 잘 개의 캡처 항체를 가지고 있기 때문에 세 교정기는 혼합 수와 직렬로 사용하기 전에 희석해야합니다. 2000 NG / ML cMyBP-C, 100 NG / ML로 하나의 샘플을 만드는 1 %에 함께 재조합 cMyBP-C, CK-MB (MSD) 및 cTnI는 (MSD) (W / V) 차단기 A / PBS에 희석 CK- MB, 25 NG / ML cTnI는 (샘플).
5. 최소 100 μL의 최종 볼륨은 각 표준에 대한 준비가되어 있습니다. 에표준 시리즈를 완료 순차적으로 샘플 5 배 희석 있습니다. 시료 25 μl를 사용하여 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단제 샘플 C를 만들려면 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에서 샘플 B의 25 μl를 사용하는 다음 예제 B.를 만들 수있는 A / PBS에 , 등등. MI 16 과목과 16 명의 대조군에서 혈청 샘플은 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 수준을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 샘플은 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 2 배 희석 하였다.
6. 3 플렉스 플레이트의 우물에 이미 25 μL를 기준 희석 한 시료 25 μl를 추가합니다. 또한 빈 (전용 희석제)를 포함하는 것이 중요합니다. 방법을 설정하려면, 샘플 기술 triplicates로드됩니다. 그렇지 않으면, 중복 충분하다.
7. 다시 플레이트를 밀봉 (플레이트 봉인을 재사용 할 수 있습니다) 2 시간 동안 RT에서 접시 흔드는 (700 RPM)에 품어.
8. 부화가 완료되기 전에, 탐지 항체 솔루션이 준비되어 있습니다. 사용 희석제는 PBS에 1 % (w / v)의 차단이다. 모든 THR전자 설포 태그가 검출 항체 1 ㎍ / ㎖ 각각의 최종 농도에 함께 희석된다. 탐지 항체는 일반적으로 50X 주식 농도에 제공됩니다.
9. 전체 96 - 웰 플레이트에 대해 총 희석 용액 2,700 μL를 (에러 포함 피펫과)가 필요합니다. 2,538 ㎕의 1 % (w / v)의 차단 PBS / 각 검출 항체의 54 μl를 추가합니다.
10. 2 시간 후, 적극적으로 싱크대 위에 접시를 가볍게 치면 솔루션을 제거합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20의 150 μL와 우물 배를 씻으십시오. 에 탐지 항체 솔루션의 25 μl를 추가하는 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하고 접시의 측면은 전체도이 솔루션이 적용되도록 탭합니다.
11. 플레이트를 밀봉하고 700 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 배양한다.
12. 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한의 배속 읽기 5 mL를 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석15 ML 증류수로 버퍼입니다.
13. 단계 2.8에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
14. 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 공기 방울을 피하는 것이 중요하다 (역 피펫은 적절한 방법입니다.) 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야 영상의 플레이트를 검사합니다.

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결과

3 복잡한 분석의 기본 원칙과 워크 플로우는 그림 1에 표시되며 전체 워크 플로우는 표 1에 설명되어 있습니다. Uniplex의 분석은 전체 바닥이 잘 한 캡처 항체로 코팅 된 것을 제외하고는 동일한 원리에 따라 작동합니다. 신호 검출 전기 신호가 잘 하단에 적용되는 ECL에 의해 이루어집니다. 이것은, 차례로, 검출 항체에 설포-TAG 레이블 읽기 버퍼의 화학 반응을 통해 빛의 현...

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토론

본 연구에서는 환자의 혈청에서 여러 심장 바이오 마커의 검출을위한 다중 면역의 적용을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 ELISA를 통해 많은 장점이 있습니다. 첫째, 분석 키트 ECL은 비색 검출 대신 사용됩니다. ECL에서 전기 신호, 따라서 배경 ¹⁴ 감소 신호의 자극 이벤트를 연결을 풀기, 측정 속성 (빛)의 현지 생산을 자극한다. 이 표 2에서 볼 수 있듯이, 높은 감도 수 있습니다. <...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001