שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Summary

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

Abstract

סמנים ביולוגיים הופכים להיות יותר ויותר חשובים בקבלת החלטות קלינית, כמו גם מדע בסיסי. אבחון אוטם שריר הלב (MI) הוא מונע במידה רבה על ידי גילוי לב חלבונים ספציפיים בסרום או הפלזמה של חולים כמדד לפגיעה בשריר לב. לאחר שהראה לאחרונה כי לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C) ניתן לזהות בסרום לאחר אוטם לבבי, יש לנו הצענו אותו כסמן ביולוגי פוטנציאל לאמ"ן. סמנים ביולוגיים מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני immunosorbent אנזים צמודי כריך מסורתי. עם זאת, טכניקה זו דורשת נפח דגימה גדול, יש לו טווח דינמי קטן, ויכולה למדוד רק חלבון בכל פעם.

כאן אנו מראים immunoassay זמנית שבניתנים למדידה בשלושה חלבוני לב בו זמנית עם רגישות גבוהה. מדידת cMyBP-C יחד בuniplex או עם MB קריאטין קינאז וטרופונין לבי הראה רגישות דומה. טכניקה זו משתמשת בקנה מידת Meso דיסקברי(MSD) שיטת ריבוב בצלחת 96 היטב בשילוב עם electrochemiluminescence לצורך זיהוי. אמנם רק בנפחי מדגם קטנים נדרשים, רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול מושגות. שימוש בטכניקה זו, מדדנו I רמות בדגימות סרום מ -16 נבדקים עם MI cMyBP-C, מגה קריאטין קינאז, ולב טרופונין והשווה את התוצאות עם 16 נבדקי ביקורת. היינו מסוגל לזהות את כל שלושת הסמנים בדגימות הללו ומצאנו את כל שלושת סמנים להיות מוגבר לאחר אוטם לבבי. טכניקה זו היא, אם כן, מתאימה לגילוי של סמנים ביולוגיים רגיש לב בדגימות סרום.

Introduction

המדידה של כמויות נמוכות של חלבון בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון סרום, היא בעלת חשיבות קלינית גוברת לניהול מטופל, כמו גם מדע בסיסי. לדוגמה, עלייה ברמות בסרום של סמנים ביולוגיים לב, כמו טרופונין I, בהגדרה קלינית היא בקנה אחד עם אוטם שריר הלב (MI) ^1. כדי לזהות חלבונים בדגימות סרום, assay immunosorbent אנזים צמוד הסטנדרטי (ELISA) הוא הטכניקה משמשת לרוב כיש לו רגישות גבוהה ומאפשר לכימות מוחלטת של אנליטי. עם זאת, ELISAs המסורתי דורש כמות גדולה יחסית של מדגם (בדרך כלל 100 μl), יש לי אות רקע גבוהה בחלק מהנוזלים ביולוגיים, והם מוגבלים למדידת אחת בלבד אנליטי לELISA ^2.

לאחרונה, טכניקת immunoassay חדשה הוצגה שעוקפת רבים מחסרונות אלה. assay שונה זו, שפותח על ידי MSD, משתמש electrochemiluminescence (ECL) לזיהוי אות, אשר מאפשר רקע נמוך מאוד ורגישות מוגברת, מה שמאפשר שימוש בכרכי מדגם קטן. Electrochemiluminescence מבוסס על כתב מולקולת רותניום (השני) trisbipyridal, אשר מצורף לנוגדנים לזיהוי. מולקולת הכתב הזה פולט אור ב620 ננומטר על הגירוי החשמלי של החלק התחתון של צלחת 96 היטב שיש אלקטרודות פחם המשולבות בהם ^3. כמו כן, על ידי שימוש בציפוי נקודה, יכולים להיות מצופים נוגדנים ללכוד מרובים לתוך אחד טוב (עד 10 על 96 גם צלחת), המאפשרים כימות בו זמני של חלבונים שונים במדגם יחיד ^4. טכניקה זו לאחרונה נעשתה שימוש כדי למדוד את פרופילי ציטוקינים מעודדי דלקת בסרום ^5,6. הצלחות זמנית מMSD להשוות בחיוב פלטפורמות זמנית assay אחרים ^7.

שימוש MSD כפלטפורמה העיקרית assay, אנחנו עוד פיתחה מנהג עשה צלחת 3-Plex שגבו זמנית לכמת את הרמה של לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C), MB קריאטין קינאז-(CK-MB), ולב טרופונין I (cTnI), והתוצאות הושוו עם זיהוי monoplex של cMyBP-C. CK-MB וcTnI הם סמנים ביולוגיים מבוססים היטב לאמ"ן. עם זאת, יכולים להיגרם עליות של סמנים ביולוגיים אלה על ידי פתולוגיות אחרות מאשר אוטם לבבי, כגון דלקת שריר הלב או אי ספיקת כליות ^8. זה טוען לתוספת של סמנים ביולוגיים נוספים כדי להגדיל את הספציפיות של אבחון אמ"ן. הראנו לאחרונה כי cMyBP-C היא גם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לMI ^9. cMyBP-C הוא חלבון קשור חוט עבה שבא לידי ביטוי בלב, ^10-12 אך לא בשלד או חלקה שרירים. לפיכך, הרמה המוגברת של cMyBP-C במערכת הדם היא אינדיקטור מסוים לנזק בלב ^13.

במחקר זה, השווינו איתור uniplex של cMyBP-C עם שימוש assay 3-Plex מותאם אישית כדי למדוד את רמות סרום שלcMyBP-C, CK-MB, וcTnI בסרום של חולים עם אוטם לבבי. בעתיד, טכניקת חתימה זו עשויה לשמש כדי לאבחן MI בחולים עם הצגת כאבים בחזה בחדר המיון.

מוסד ביקורת הלוח (IRB) של האוניברסיטה לויולה שיקגו אישרה את המחקר לשימוש בדגימות אדם deidentified ושימוש בimmunoassay (LU # 20392).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Assay cMyBP-C Uniplex

1. ביום שלפני הניסוי, מעיל הצלחת הסטנדרטית החשופה 96, גם MSD עם נוגדן ללכוד. לcMyBP-C, יש להשתמש בנפח של 30 μl עכבר נוגדן אנטי cMyBP-C חד שבטי (ג'לטין חינם) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל בופר פוספט (PBS).
2. מאז גם הוא הידרופובי, פיפטה הפתרון לפינה התחתונה של הבאר, ואז להקיש על הצדדים של הצלחת להתפשט על פני כל הפתרון טוב.
3. הצלחת מכוסה באוטם צלחת וטופחו O / N ב 4 ° C בלי לרעוד.
4. הסר את פתרון הנוגדן ללכוד על ידי הקשה על פני פתרון כיור ולאחר מכן על ערימה של מגבות נייר. הלא ספציפי מחייב את הצלחת חסומה על ידי הוספת 150 μl של 5% (w / v) חוסם פתרון (BSA בדרגה גבוהה) ב PBS היטב כל אחד.
5. חותם את הצלחת ודגירה עבור שעה 1 ב RT תוך רועד ב 700 סל"ד.
6. במהלך שלב החסימה, להכין את הסטנדרטים ויםamples. להפוך את הסדרה הסטנדרטית על ידי דילול רקומביננטי בר חלבון cMyBP-C (חומצות אמינו 1-271) לריכוז התחלתי של 2,000 ng / ml ב1% (w / v) חוסם / PBS. אז לדלל סדרתי בפקטור של 5% ב1 (w / v) חוסם / PBS. סה"כ 7 תקנים + ריקה 1 (1% (w / v) חוסם / PBS לבד) היו בשימוש.
7. הסר את פתרון החסימה ולשטוף את צלחת 3x עם 150 0.05% (V / V) Tween-20/PBS μl. בכל פעם, להסיר את הפתרון לשטוף על ידי היפוך לצלחת מעל כיור. לאחר השלב לשטוף השלישי, במרץ קפיצי הצלחת מעל כיור וללטף את הצלחת במרץ על שכבה של מגבות נייר עד שהוא יבש לחלוטין. זהו צעד חיוני, כמו כרכי דגירה הם קטנים, וכל שנותר פתרון לשטוף באופן משמעותי יהיה לדלל את הדגירה הבאה.
8. פיפטה μl 25 של סטנדרטים ודגימות לתוך הבארות. חותם את הצלחת ולדגור על RT, בעוד רועד בסל"ד 700 במשך שעה 1.
9. הכן את פתרון זיהוי הנוגדן ב1 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחוסם% 1 / PBS. מ"קstom עשה נוגדן cMyBP-C (epitope חומצות אמינו 2 - 14) עם תיוג MSD sulfo-TAG משמש כנוגדן לזיהוי. ערכות זמינות לתיוג sulfo-TAG, מה שהופך את הליך פשוט יחסית לתייג את כל נוגדנים.
10. חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4.
11. הוסף 25 μl של פתרון נוגדן איתור היטב כל אחד, לאטום את הצלחת, ולדגור על RT במשך שעה 1 בצלחת שייקר נקבעה על 700 סל"ד.
12. במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה (ראה סעיף מגיב). כמו כן, לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ קריאת 4x למים מזוקקים 15 מ"ל.
13. חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4.
14. הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד על ידי שימוש בפיפטה רבה. הקפד להימנע מבועות אוויר (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת במגזר באופן מיידיImager.

2. 3-Plex cMyBP-C, CK-MB, וcTnI Assay

1. 96 גם צלחת 3-Plex וdiluent פתרונות מותר לאזן לRT לפני השימוש. צלחת זה מראש מצופה בנוגדנים ללכידים cMyBP-C, CK-MB, וcTnI ידי MSD.
2. הוסף 25 μl של 1% (w / v) חוסם / PBS היטב כל אחד. הקש הצדדים של הצלחת על מנת לוודא כי כולו מכוסה היטב על ידי פתרון.
3. חותם את הצלחת עם אוטם צלחת, מניח את הצלחת על צלחת שייקר, ולנער בסל"ד 700 למשך 30 דקות.
4. בינתיים, סדרת דילול של כייל בודדים מוכנה. כי לכל אחד יש גם שלושה נוגדנים ללכוד שלוש כייל צריכים להיות מעורב ובדילול סדרתי לפני השימוש. לדלל רקומביננטי cMyBP-C, CK-MB (MSD), וcTnI (MSD) יחד ב1% (w / v) חוסם / PBS כדי ליצור מדגם אחד עם 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml-CK מגה בייט, ו25 ng / ml cTnI (מדגם).
5. נפח סופי של לפחות 100 μl מוכן לכל תקן. אללהשלים את הסדרה הסטנדרטית, סדרתי לדלל הדגימות הן בפקטור של 5. השתמש 25 μl של מדגם ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם ב 'ואז להשתמש μl 25 של המדגם B ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם C , וכן הלאה. דגימות סרום אדם מ -16 נבדקים עם MI ו -16 נבדקי ביקורת שמשו כדי למדוד את רמות cTnI cMyBP-C, CK-MB, ו. דגימות אלה היו מדוללים ב2x 1% (w / v) חוסם / PBS.
6. הוסף 25 μl של סטנדרטים ודגימות מדוללים ל25 μl הנוכחי כבר בבארות של צלחת 3-Plex. חשוב לכלול גם ריק (diluent בלבד). כדי לבסס את הטכניקה, דגימות נטענות בtriplicates הטכני. אחרת, כפילויות מספיקות.
7. חותם את הצלחת שוב (ניתן לעשות שימוש חוזר אוטם צלחת) ולדגור על שייקר צלחת (700 סל"ד) על RT במשך שעה 2.
8. רגע לפני שהוא סיים דגירה, פתרון נוגדן זיהוי מוכן. Diluent משמש הוא 1% (w / v) חוסם PBS. כל thrנוגדני איתור EE sulfo-מתויגים דילול יחד לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל אחד. נוגדני איתור מסופקים בדרך כלל בריכוז מניות 50x.
9. עבור 96 גם צלחת מלאה, יש צורך ב2,700 μl של תמיסה מדוללת כוללת (עם pipetting כללה שגיאה). הוסף 54 μl של כל נוגדן לזיהוי 2,538 1% (w / v) חוסם μl / PBS.
10. לאחר 2 שעות, להסיר פתרונות נמרצות על ידי מצליף את הצלחת מעל כיור. לשטוף 3x הבארות עם 150 μl של 0.05% Tween-20 ב-PBS. הוסף 25 μl של פתרון נוגדן זיהוי לכל אחד גם באמצעות פיפטה רבה, ואת הצדדים של הצלחת הם טפח על מנת להבטיח שכולו מכוסים היטב על ידי פתרון.
11. חותם את הצלחת ודגירה במשך שעה 1 בזמן רועד ב 700 סל"ד.
12. במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה. גם לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ"ל של 4x לקריאהחיץ למים מזוקקים 15 מ"ל.
13. חזור על השלב לשטוף מתוארים בשלב 2.8.
14. הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד באמצעות פיפטה רבה. הימנעות בועות אוויר היא קריטית (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת בImager המגזר באופן מיידי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

את עקרונות היסוד ואת זרימת העבודה של assay 3-Plex מוצגים באיור 1, ואת זרימת העבודה הכוללת מתוארת בטבלה 1. מבחני Uniplex לעבוד יחד באותו עיקרון אלא שכל התחתית היטב מצופה בנוגדן ללכוד אחד. זיהוי אות נעשה על ידי ECL שבו אות חשמלי מוחל על תחתית הבאר. זה, בתורו, יוזם י?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים את הישימות של immunoassay זמנית לגילוי של סמנים ביולוגיים בסרום לב מרובים מחולים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני ELISA המסורתי. ראשית, ECL בערכת assay משמש במקום זיהוי colorimetric. בECL, אות חשמלי מגרה את הייצור המקומי של הנכס נמדד (אור), ובכך שחרר את סוגר אירוע הגיר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001