Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Résumé

Biomarqueurs de mesure dans des échantillons biologiques complexes est de plus en plus guident prise de décision clinique. Nous décrivons une méthode très sensible pour mesurer simultanément la myosine cardiaque protéine de liaison-C, la créatine kinase MB et la troponine I cardiaque dans le sérum de sujets atteints d'infarctus du myocarde et de sujets témoins en bonne santé.

Résumé

Les biomarqueurs sont de plus en plus en plus important dans la prise de décision clinique, ainsi que la science fondamentale. Diagnostic de l'infarctus du myocarde (IM) est en grande partie entraînée par la détection de protéines spécifiquement cardiaque dans le sérum ou le plasma de patients comme indicateur de la lésion du myocarde. Ayant récemment montré que la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C) est détectable dans le sérum après un IM, nous avons proposé comme un biomarqueur potentiel de MI. Les biomarqueurs sont généralement détectés par alternance enzyme-linked tests immuno traditionnels. Toutefois, cette technique nécessite un grand volume de l'échantillon, a une faible plage dynamique, et permet de mesurer une seule protéine à la fois.

Ici, nous montrons un test immunologique multiplex dans lequel trois protéines cardiaques peuvent être mesurés simultanément avec une grande sensibilité. Mesure cMyBP-C dans Uniplex ou avec de créatine kinase MB et la troponine I cardiaque ont montré une sensibilité comparable. Cette technique utilise la méso échelle Discovery(MSD) méthode de multiplexage dans une plaque de 96 puits combiné avec électrochimiluminescence pour la détection. Bien que de petites quantités d'échantillons sont nécessaires, une grande sensibilité et une grande plage dynamique sont atteints. Grâce à cette technique, nous avons mesuré cMyBP-C, la créatine kinase MB et la troponine cardiaque niveaux I dans des échantillons de sérum de 16 sujets atteints d'IM et comparé les résultats avec 16 sujets témoins. Nous avons pu détecter tous les trois marqueurs dans ces échantillons et découvert les trois biomarqueurs être augmentée après MI. Cette technique est donc adapté à la détection sensible des biomarqueurs cardiaques dans des échantillons de sérum.

Introduction

La mesure de faibles quantités de protéines dans des échantillons biologiques complexes comme le sérum, est d'une importance croissante pour la gestion clinique des patients, ainsi que la science fondamentale. Par exemple, une augmentation des taux sériques de biomarqueurs cardiaques, tels que la troponine I, dans un contexte clinique est compatible avec infarctus aigu du myocarde (MI) ^1. Pour détecter les protéines dans des échantillons de sérum, le dosage immuno-enzymatique standard (ELISA) est la technique la plus souvent utilisée car elle a une sensibilité élevée et permet une quantification absolue de l'analyte. Toutefois, les tests ELISA traditionnelles exigent une quantité relativement importante de l'échantillon (typiquement 100 pi), avoir un signal de fond élevé dans certains liquides biologiques, et sont limités à la mesure d'un seul analyte par ELISA ^2.

Récemment, une nouvelle technique de dosage immunologique a été introduit qui contourne la plupart de ces inconvénients. Ce test modifié, développé par MSD, utilise electrochemiluminescrence (ECL) pour la détection des signaux, ce qui permet pour un fond très faible et d'une sensibilité accrue, ce qui permet l'utilisation de petits volumes d'échantillons. Électrochimioluminescence est basé sur la molécule rapporteur du ruthénium (II) trisbipyridal, qui est fixé à l'anticorps de détection. Cette molécule rapporteur émet de la lumière à 620 nm lors de la stimulation électrique du bas de la plaque à 96 puits, qui comporte des électrodes de carbone intégrées dans les ^trois. En outre, en utilisant un revêtement par points, plusieurs anticorps de capture peuvent être enrobés dans un puits (jusqu'à 10 sur une plaque 96 puits), ce qui permet, pour la quantification simultanée de plusieurs protéines dans un échantillon unique ^4. Cette technique a été utilisée récemment pour mesurer les profils de cytokines pro-inflammatoires dans le sérum ^5,6. Les plaques de multiplex de MSD se comparent favorablement à d'autres plates-formes de dosage multiplex ^7.

Utilisation de MSD en tant que plateforme d'analyse primaire, nous avons encore développé une coutume fait plaque 3-plex qui cune quantifier simultanément le niveau de la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C), la créatine kinase MB (CK-MB) et la troponine I cardiaque (cTnI), et les résultats ont été comparés avec détection monoplex de cMyBP-C. CK-MB et troponine Ic sont des biomarqueurs bien établies pour MI. Cependant, les augmentations de ces biomarqueurs peuvent être causés par des pathologies autres que MI, par exemple, une myocardite ou une insuffisance rénale ^8. Ceci plaide pour l'ajout de biomarqueurs supplémentaires pour augmenter la spécificité du diagnostic MI. Nous avons récemment montré que cMyBP-C est également un biomarqueur potentiel de MI ^9. cMyBP-C est une protéine associée à filament épais qui est exprimé dans le cœur, ^10-12, mais pas dans les muscles squelettiques ou lisse. Ainsi, l'augmentation du niveau de cMyBP-C dans le système circulatoire est un indicateur spécifique de lésions cardiaques ^13.

Dans cette étude, nous avons comparé la détection Uniplex de cMyBP-C avec l'utilisation d'un test 3-plex coutume de mesurer les taux sériques decMyBP-C, CK-MB et troponine Ic dans le sérum des patients atteints d'infarctus du myocarde. Dans l'avenir, cette technique de signature peut être utilisée pour diagnostiquer IM chez les patients présentant des douleurs à la poitrine dans la salle d'urgence.

La commission d'examen institution (IRB) de l'Université Loyola de Chicago a approuvé l'étude pour l'utilisation des échantillons humains rendues anonymes et l'utilisation de l'immuno-essai (LU # 20392).

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Protocole

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. La veille de l'expérience, manteau de la plaque standard nu 96 puits MSD avec l'anticorps de capture. Pour cMyBP-C, utiliser un volume 30 ul d'anticorps anti-cMyBP-C monoclonal de souris (sans gélatine) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans un tampon phosphate salin (PBS).
2. Comme le puits est hydrophobe, une pipette de la solution dans le coin inférieur du puits; puis sur les côtés de la plaque pour propager la solution sur l'ensemble de puits.
3. La plaque est recouverte d'un agent de scellement de la plaque et on incube O / N à 4 ° C sans agitation.
4. Retirer la solution d'anticorps de capture en appuyant sur la solution au-dessus d'un évier, puis sur une pile de serviettes en papier. La liaison non-spécifique de la plaque est bloquée par addition de 150 pi de 5% (p / v) bloquant une solution (BSA haute qualité) dans du PBS dans chaque puits.
5. Sceller la plaque et incuber pendant 1 heure à température ambiante tout en agitant à 700 rpm.
6. Au cours de l'étape de blocage, préparer les normes et sexemples. Faire la série standard en diluant fragment de protéine recombinante cMyBP-C (acides aminés 1 à 271) à une concentration initiale de 2,000 ng / ml dans 1% (p / v) Un bloqueur / PBS. Puis diluer en série par un facteur de 5 à 1% (p / v) Un bloqueur / PBS. Nombre de normes 7 + une ébauche (1% (p / v) Un bloqueur / PBS seul) ont été utilisées.
7. Retirer la solution de blocage et laver la plaque 3x avec 150 pi 0,05% Tween-20/PBS (v / v). Chaque fois, retirez la solution de lavage par inversion de la plaque au-dessus d'un évier. Après la troisième étape de lavage, faites glisser vigoureusement la plaque dessus d'un évier et tapotez la plaque vigoureusement sur une couche de serviettes en papier jusqu'à ce qu'il soit complètement sec. Il s'agit d'une étape cruciale, les volumes d'incubation sont de petite taille, et toute solution de lavage résiduelle va diluer considérablement la prochaine incubation.
8. Pipette 25 ul d'étalons et des échantillons dans les puits. Sceller la plaque et incuber à température ambiante, tout en agitant à 700 rpm pendant 1 heure.
9. Préparer la solution d'anticorps de détection à 1 pg / ml dans 1% bloqueur A / PBS. A custom fait anticorps cMyBP-C (épitopes des acides aminés 2-14) avec TMS sulfo TAG étiquetage sert de l'anticorps de détection. Les kits sont disponibles pour SULFO-TAG étiquetage, ce qui en fait une procédure relativement simple pour étiqueter tout anticorps.
10. Répéter l'étape de lavage comme décrit dans l'étape 1.4.
11. Ajouter 25 ul de solution d'anticorps de détection à chaque puits, sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 1 heure sur un agitateur de plaque fixée à 700 rpm.
12. Au cours de la période d'incubation, exécutez MSD démo-plaque (plaque avec des lumières LED) pour assurer le bon fonctionnement de l'imageur du secteur et le logiciel (voir section réactif). En outre, diluer la lecture du tampon, qui est fourni par TMS, par addition de 5 ml de tampon de lecture 4x à 15 ml d'eau distillée.
13. Répéter l'étape de lavage comme décrit dans l'étape 1.4.
14. Ajouter 150 pi de tampon en lecture dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux. Soyez sûr d'éviter les bulles d'air (pipetage inverse est une méthode appropriée). Après addition de la lecture tampon, numériser immédiatement la plaque dans le secteurImager.

2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic Assay

1. Une des solutions plaque de 96 puits 3-plex et le diluant sont s'équilibrer à la température ambiante avant de l'utiliser. Cette plaque est pré-revêtu avec des anticorps de capture pour cMyBP-C, la CK-MB, et la cTnI par MSD.
2. Ajouter 25 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS dans chaque puits. Appuyez sur les côtés de la plaque de s'assurer que l'ensemble du bien est couvert par la solution.
3. Sceller la plaque avec un scellant pour plaques, placer la plaque sur une plaque shaker, secouez et à 700 rpm pendant 30 min.
4. Dans le même temps, une série de dilutions d'étalons individuels est préparé. Parce que chacun a bien trois anticorps de capture trois étalons besoin d'être mélangé et dilué en série avant l'utilisation. Diluer cMyBP-C recombinante, CK-MB (MSD), et cTnI (MSD), ainsi que dans 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer un échantillon avec 2.000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- Mo, et 25 ng / ml cTnI (échantillon A).
5. Un volume final d'au moins 100 l est préparée pour chaque standard. Pourterminer la série standard, diluer en série les échantillons sont par un facteur de 5. Utilisez 25 pl de l'échantillon A dans 100 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer l'échantillon B. Ensuite, utilisez 25 pl de l'échantillon B dans 100 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer l'échantillon C et ainsi de suite. Échantillons de sérum humain provenant de 16 sujets atteints d'IM et 16 sujets témoins ont été utilisés pour mesurer cMyBP-C, CK-MB, et les niveaux de troponine Ic. Ces échantillons ont été dilués 2x à 1% (p / v) bloqueur A / PBS.
6. Ajouter 25 pl des étalons et des échantillons dilués dans les 25 ul déjà présents dans les puits de la plaque 3-plex. Il est important d'inclure également un blanc (diluant seulement). Pour établir la technique, les échantillons sont chargés en triple techniques. Sinon, les doublons sont suffisantes.
7. Sceller la plaque à nouveau (plaque scellant peut être réutilisé) et incuber sur un agitateur plaque (700 rpm) à température ambiante pendant 2 heures.
8. Juste avant l'incubation est terminée, la solution d'anticorps de détection est préparé. Le diluant utilisé est de 1% (p / v) dans du PBS Un bloqueur. Tous THRdes anticorps de détection ee sulfo marqués sont dilués ensemble dans une concentration finale de 1 ng / ml. anticorps de détection sont généralement fournis à une concentration des stocks 50x.
9. Pour une plaque de 96 puits complète, 2.700 pi de solution diluée totale est nécessaire (avec erreurs de pipetage inclus). Ajouter 54 ul de chaque anticorps de détection à 2,538 pi 1% (p / v) bloqueur A / PBS.
10. Après 2 heures, retirez solutions en tapotant énergiquement la plaque au-dessus d'un évier. Laver les puits 3 fois avec 150 pi de 0,05% de Tween 20 dans du PBS. Ajouter 25 pl de solution d'anticorps de détection à chaque puits à l'aide d'une pipette à canaux multiples, et les côtés de la plaque sont exploitées afin d'assurer que l'ensemble du puits est recouvert d'une solution.
11. Sceller la plaque et incuber pendant 1 heure en agitant à 700 rpm.
12. Au cours de la période d'incubation, exécutez MSD démo-plaque (plaque avec des lumières LED) pour assurer le bon fonctionnement de l'imageur du secteur et des logiciels. Diluer également la lecture tampon, qui est fourni par MSD, en ajoutant 5 ml de 4x lecturetampon à 15 ml d'eau distillée.
13. Répéter l'étape de lavage décrite à l'étape 2.8.
14. Ajouter 150 pi de tampon de lecture à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux. Éviter les bulles d'air est critique (pipetage inverse est une méthode appropriée). Après addition de la lecture tampon, numériser immédiatement la plaque dans l'imageur du secteur.

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Résultats

Les principes de base et le workflow de l'essai 3-plex sont présentés dans la figure 1, et le flux de travail global est décrite dans le tableau 1. Dosages Uniplex travaillent sur le même principe sauf que l'ensemble de fond de puits est recouvert d'un anticorps de capture. la détection du signal est effectuée par ECL dans lequel un signal électrique est appliqué à la partie inférieure du puits. Ceci, en retour, initie une production locale de la lumière à traver...

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Discussion

Dans cette étude, nous montrons l'applicabilité d'un test immunologique multiplex pour la détection de multiples biomarqueurs cardiaques dans le sérum de patients. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport ELISA classique. Tout d'abord, ECL dans le kit de dosage est utilisé à la place de la détection colorimétrique. En ECL, un signal électrique stimule la production locale de la propriété mesurée (lumière), ainsi découpler l'événement de stimulation du signal, ce qui ré...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001