Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Resumo

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Resumo

Biomarcadores são cada vez mais importante na tomada de decisão clínica, bem como a ciência básica. Diagnóstico de enfarte do miocárdio (MI) é amplamente determinado por detecção de proteínas cardíacas específicas no soro ou plasma do paciente, como um indicador de lesão do miocárdio. Tendo recentemente demonstrado que a proteína de miosina cardíaca-C (cMyBP-C) é detectável no soro após o IM, propusemos como um biomarcador potencial de MI. Os biomarcadores são tipicamente detectados por sandwich enzyme-linked immunosorbent tradicionais. No entanto, esta técnica requer um grande volume de amostra, tem uma pequena gama dinâmica e pode medir apenas uma proteína de cada vez.

Aqui, mostramos um imunoensaio multiplex no qual três proteínas cardíacas pode ser medida simultaneamente com elevada sensibilidade. Medindo cMyBP-C em Uniplex ou em conjunto com creatina quinase MB e troponina I apresentaram sensibilidade comparáveis. Esta técnica utiliza a Meso Scale Descoberta(MSD) método de multiplexação de uma placa de 96 poços juntamente com electroquimioluminescência para a detecção. Enquanto apenas pequenos volumes de amostra são necessários, elevada sensibilidade e uma grande gama dinâmica são alcançados. Usando esta técnica, medimos cMyBP-C, MB da creatina quinase e os níveis de troponina I em amostras de soro de 16 pacientes com IAM e compararam os resultados com 16 indivíduos de controle. Fomos capazes de detectar todos os três marcadores nestas amostras e encontrou os três biomarcadores para ser aumentado após o IM. Esta técnica é, portanto, adequado para a detecção sensível de marcadores cardíacos em amostras de soro.

Introdução

A medição de baixas quantidades de proteína em amostras biológicas complexas, tal como o soro, é de crescente importância para a gestão clínica do paciente, assim como a ciência básica. Por exemplo, um aumento dos níveis séricos de marcadores cardíacos, tais como a troponina I, num ambiente clínico é consistente com enfarte agudo do miocárdio (MI) ^1. Para detectar proteínas em amostras de soro, padrão de ensaio imunoenzimático (ELISA), é a técnica utilizada na maioria das vezes, uma vez que tem uma elevada sensibilidade e permite a quantificação absoluta de analito. No entanto, os testes ELISA tradicionais exigem uma quantidade relativamente grande de amostra (normalmente 100 l), tem alto sinal de fundo em alguns fluidos biológicos, e são restritas para a medição de um único analito por ELISA ^2.

Recentemente, uma nova técnica de imunoensaio foi introduzido que contorna muitos destes inconvenientes. Este ensaio modificado, desenvolvido pela MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para a detecção de sinal, o que permite por um fundo muito baixo e uma sensibilidade aumentada, permitindo a utilização de pequenos volumes de amostra. Electroquimioluminescência é baseado na molécula repórter ruténio (II) trisbipyridal, que está ligado aos anticorpos de detecção. Esta molécula repórter emite luz a 620 nm após a estimulação eléctrica do fundo da placa de 96 poços, que tem eléctrodos de carbono integrados neles ^3. Além disso, por meio de revestimento local, os anticorpos de captura múltiplas podem ser revestidos para um poço (até 10 numa placa de 96 poços), permitindo a quantificação simultânea de proteínas diferentes numa única amostra ^4. Esta técnica tem sido recentemente usado para medir perfis de citoquinas pró-inflamatórias em soro ^5,6. As placas de multiplex MSD comparam favoravelmente com outras plataformas de ensaio multiplex ^7.

Usando MSD como a plataforma de ensaio primário, desenvolvemos mais uma custom made placa 3-plex que cuma quantificar simultaneamente o nível de ligação às proteínas miosina cardíaca-C (cMyBP-C), creatina-quinase MB (CK-MB) e troponina I (cTnI), e os resultados foram comparados com detecção Monoplex de cMyBP-C. CK-MB e cTnI são biomarcadores bem estabelecidos para MI. No entanto, os aumentos destes biomarcadores pode ser causada por outras patologias que MI, por exemplo miocardite ou insuficiência renal ^8. Isto argumenta a favor da adição de biomarcadores adicionais para aumentar a especificidade do diagnóstico de EM. Mostrámos recentemente que cMyBP-C é também um biomarcador potencial de MI ^9. cMyBP-C é uma proteína associada filamento grosso que é expresso no coração, ^10-12, mas não nos músculos esqueléticos ou lisa. Assim, o aumento do nível de cMyBP-C no sistema circulatório é um indicador específico de danos cardíacos ^13.

Neste estudo, comparou-se a detecção de Uniplex cMyBP-C com a utilização de um ensaio de 3-Plex personalizado para medir os níveis séricos decMyBP-C, CK-MB e cTnI no soro de pacientes com MI. No futuro, esta técnica de assinatura pode ser usado para diagnosticar MI em pacientes com dor torácica na sala de emergência.

O conselho de revisão institucional (IRB), da Loyola University Chicago aprovou o estudo para o uso de amostras humanas deidentified eo uso do imunoensaio (LU # 20392).

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Protocolo

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. Um dia antes do experimento, casaco da placa padrão nu 96 poços MSD com anticorpo de captura. Para cMyBP-C, usar um volume il de 30 de rato anticorpo anti-cMyBP-C monoclonal (gelatina livre), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em tampão fosfato salino (PBS).
2. Uma vez que o poço é hidrofóbico, pipetar a solução para o canto inferior do poço; toque os lados da placa para espalhar a solução ao longo de todo o poço.
3. A placa é coberta com um selante de placa e incubadas O / N a 4 ° C sem agitação.
4. Remover a solução de anticorpo de captura tocando a solução ao longo de um lavatório e, em seguida, sobre uma pilha de toalhas de papel. A ligação não específica para a placa é bloqueada por adição de 150 ul de uma de 5% (w / v) de bloqueador Uma solução (BSA alto grau) em PBS a cada poço.
5. Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm.
6. Durante o passo de bloqueio, preparar as normas e splos. Adicione a série padrão diluindo fragmento da proteína recombinante cMyBP-C (aminoácidos 1-271), para uma concentração de partida de 2,000 ng / ml em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Depois dilui-se sequencialmente por um factor de 5 em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Total de sete padrões + 1 em branco (1% (w / v) de bloqueador Um apenas PBS /) foram usadas.
7. Remover a solução de bloqueio e lavar a placa 3 vezes com 150 ul de 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Cada vez, remover a solução de lavagem através da inversão da placa de cima de uma pia. Após a terceira etapa de lavagem, vigorosamente apertar o prato sobre uma pia e seque a placa vigorosamente sobre uma camada de papel toalha até que esteja completamente seco. Este é um passo crucial, como volumes de incubação são pequenos, e qualquer solução de lavagem restante irá diluir significativamente a próxima incubação.
8. Pipetar 25 ul de padrões e das amostras nas cavidades. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm durante 1 hora.
9. Preparar a solução de anticorpo de detecção de 1 ug / ml em 1% bloqueador A / PBS. A cuestômagos feito anticorpo cMyBP-C (aminoácidos epitopo 2-14) com MSD sulfo-TAG rotulagem serve como anticorpo de detecção. Kits estão disponíveis para SULFO-TAG rotulagem, tornando-se um procedimento relativamente simples para rotular qualquer anticorpo.
10. Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4.
11. Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço, selar a placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora num agitador de placas definida a 700 rpm.
12. Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software (consulte a seção de reagentes). Além disso, diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x ler-tampão de 15 ml de água destilada.
13. Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4.
14. Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de evitar bolhas de ar (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa no sectorImager.

2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay

1. A placa de 96 poços 3-Plex e diluente soluções são deixadas a equilibrar à temperatura ambiente antes do uso. Esta placa é pré-revestido com anticorpos de captura para cMyBP-C, CK-MB e cTnI pela MSD.
2. Adicionar 25 ul de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS a cada poço. Os lados da placa para assegurar que todo o poço é coberto pela solução.
3. Selar a placa com o selador de placa, coloque a placa em um shaker prato, e agitar a 700 rpm por 30 min.
4. No entanto, uma série de diluições de calibradores individuais é preparado. Porque cada poço tem três anticorpos de captura três calibradores necessidade de ser misturado e diluído em série antes da utilização. Diluir recombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e TIc (MSD) em conjunto em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS, para criar uma amostra de 2,000 ng / ml cMyBP-C, com 100 ng / mL de CK- MB, e 25 ng / mL TIc (amostra A).
5. Um volume final de pelo menos 100 ul é preparado para cada padrão. Acompletar a série padrão, diluir em série das amostras são, por um factor de 5. Usar 25 ul da amostra A em 100 uL de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS para criar amostra B. Em seguida, utilizar 25 ul de amostra B, em 100 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS para criar Amostra C , e assim por diante. Amostras de soro humano de 16 pacientes com IAM e 16 indivíduos controle foram usados ​​para medir cMyBP-C, CK-MB, e os níveis de cTnI. Estas amostras foram diluídas 2x em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS.
6. Adicionam-se 25 ul dos padrões e das amostras diluídas aos 25 ul já presente nos poços da placa 3-Plex. É importante também incluir um espaço em branco (apenas solvente). Para estabelecer a técnica, as amostras são carregadas em triplicado técnicos. Caso contrário, as duplicatas são suficientes.
7. Selar a placa novamente (vedante de placa pode ser reutilizada) e incubar num agitador de placas (700 rpm) a temperatura ambiente durante 2 horas.
8. Imediatamente antes da incubação é terminada, a solução de anticorpo de detecção é preparado. O diluente utilizado é de 1% (w / v) de bloqueador A em PBS. Todos thrOs anticorpos de detecção de ee SULFO-marcadas são diluídos em conjunto a uma concentração final de 1 ug / ml cada. Anticorpos de detecção são normalmente fornecidos com uma concentração estoque de 50x.
9. Para uma placa de 96 poços completo, é necessário 2,700 ml de solução total diluído (com erro de pipetagem incluídas). Adicionar 54 ul de cada um dos anticorpos de detecção de 2538 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS.
10. Após 2 horas, retire soluções sacudindo vigorosamente a placa acima de uma pia. Lavar os poços 3x com 150 mL de 0,05% de Tween-20 em PBS. Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço utilizando uma pipeta multicanal, e os lados da placa são virados para garantir que todo o poço é coberto pela solução.
11. Selar a placa e incubar durante 1 hora, agitando a 700 rpm.
12. Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software. Também diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x leituraamortecer a 15 ml de água destilada.
13. Repetir o passo de lavagem descrito no passo 2.8.
14. Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Evitando bolhas de ar é crítica (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa na Imager sector.

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Resultados

Os princípios básicos e fluxo de trabalho do ensaio 3-Plex são mostrados na Figura 1, e o fluxo de trabalho geral está descrito na Tabela 1. Ensaios UNIPLEX trabalhar ao longo do mesmo princípio, excepto que toda a parte inferior também é revestida com um anticorpo de captura. A detecção do sinal é feito por ECL em que um sinal eléctrico é aplicado à parte inferior do poço. Isto, por sua vez, inicia uma produção local de luz através de uma reacção química da leitura ...

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Discussão

Neste estudo, mostra a aplicabilidade de um imunoensaio multiplex para a detecção de múltiplos marcadores cardíacos no soro de pacientes. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre ELISA tradicional. Primeiro, ECL no kit de ensaio é utilizado em vez de detecção colorimétrica. Em ECL, um sinal eléctrico estimula a produção local de propriedade medida (de luz), desacoplando assim o evento estimulação do sinal, o que reduz o fundo ^14. Isto permite uma elevada sensibilidade, como pode ser visto na <...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free	Santa Cruz	SC-137180L	For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate	Meso Scale Discovery	L15XA-3
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4 digital microtiter shaker	IKA	3208001