Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

Resumen

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Resumen

En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere "criofijación" de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus "características" energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.

Introducción

Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas ^3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este objetivo se complica por el hecho de que el calcio se distribuye dinámicamente entre los dos estados físicos - libre en solución o unido a un sustrato - y que las concentraciones de calcio celular cambian a lo largo de varios órdenes de magnitud, como consecuencia de la estimulación.

Si bien existen varias metodologías avanzadas disponibles para el análisis de free de calcio intracelular, la determinación de las concentraciones de calcio total en compartimentos intracelulares definidos se limita de manera realista a un enfoque, a saber, microanálisis de sonda de electrones (EPMA). EPMA es una técnica que las parejas un espectrómetro de rayos X para un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El cañón de electrones TEM se centra una sonda electrónica submicras estacionaria en una región subcelular de interés y los rayos X de elementos específicos emitidos como resultado del bombardeo de electrones son recogidos y analizados (ver referencias ^{7, 4} para revisiones técnicas detalladas). Ventajas de EPMA incluyen sola resolución a nivel de orgánulo y sensibilidad submilimolar. En la práctica, sin embargo, requiere EPMA cryotechniques e instrumentos especializados para la preparación y análisis de muestras. Aquí se describen las herramientas, técnicas e instrumentos adecuados para la medición de calcio intracelular usando EPMA. Calcio intramitocondrial es de i especiall interés en cuenta el papel fundamental que desempeña la sobrecarga de calcio mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas.

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Protocolo

El método descrito aquí se ha desarrollado utilizando instrumentos específicos, herramientas y software. Debido a que los laboratorios no va a utilizar la misma configuración experimental del enfoque es generalizado en lo posible.

1. Congelación Rápida

El método analítico que se describe es absolutamente dependiente de enfoques criogénicos para: 1) el "criofijación" de las células o tejidos de una manera que preserva cuantitativamente la distribución de los componentes del tejido difusibles y elementos químicos como lo fueron en células vivas en el instante de la congelación , y 2) la preparación de ultrafina cryosections adecuado para formación de imágenes y análisis en un TEM. Estas técnicas se describen brevemente a continuación, pero los detalles necesarios para reproducir estos procedimientos en otros laboratorios están más allá del alcance de este artículo. Los lectores interesados ​​se denominan excelentes artículos recientes ^9,14.

Atención: En esta sección se describe el uso del jabón letano efied, que es altamente inflamable y potencialmente explosivo; se deben tomar las precauciones adecuadas. Operador también debe estar familiarizado con nitrógeno líquido (LN ₂₎ las precauciones de seguridad, incluyendo la capa protectora de laboratorio, gafas y guantes cryoresistant. Nota: Aquí y en todas partes, todas las herramientas (pinzas, etc) que se utilizan para manejar muestras congeladas deben refrigerarse en LN ₂ antes de su uso para evitar la descongelación accidental.

Las células cultivadas sobre cubreobjetos

1. Prepare un dispositivo de congelación de inmersión por condensación de etano gaseoso a -160 ° C en la LN ₂ refrigerado por pocillo central. Llenar hasta la marca y tapar el pozo con la tapa basculante de aluminio cuando no esté en uso.
2. El uso de cuñas de papel de filtro, seque cubreobjetos de plástico de células cultivadas bajo condiciones apropiadas experimentalmente a una fina película acuosa. Seque desde el borde a fin de evitar el contacto con el tejido, la película residual ideal, determinado por ensayo y error, es tan delgada como sea posible pero sin then cuanto a evaporarse y permitir el secado de la superficie del tejido.
3. Sosteniendo el cubreobjetos por el borde con una pinza de sujeción, sumerja rápidamente en etano líquido, ya sea manualmente o utilizando el émbolo gravedad-alimentado.
4. Coloque el cubreobjetos congelado en un recipiente de espuma de poliestireno en las inmediaciones de LN _2, lo suficientemente grande para manipular el número deseado de cubreobjetos en recipientes de almacenamiento a largo plazo. Se recomiendan las latas con tapón de rosca de aluminio que no se aprovechan bajo LN _2.

La congelación rápida de rodajas de cerebro cultivadas

5. Bajo un microscopio de disección, ver y orientar una rebanada del hipocampo organotípicos, sin molestias y todavía unido a la inserción de la membrana cultura. Coloque los puntos de referencia en la membrana cerca del borde de la rebanada con un tipo Sharpie negro pluma y fotografía.
6. Todavía bajo el microscopio, cortar aprox. 5 x 5 mm cuadrados de membrana con cortes individuales centradas en las plazas. Evite tocar la rebanada o doblar el membrane.
7. Montar un trozo de membrana soportada, amortiguado por un ¼ de la almohadilla de agar de diámetro, en un disco de aluminio diseñada por encargo para adaptarse a una cryoultramicrotome (descrito más adelante). Rápidamente congelar la rebanada por neumáticamente impulsándola contra un bloque de zafiro LN ₂ enfriado por medio de un dispositivo de "congelación Slam" personalizado.
8. Mover a almacenamiento como se describe para las células cultivadas.

2. Cryosectioning

Advertencia: producir con éxito cintas secas cortadas de secciones ultrafinas, mientras que sencillo y lógico, requiere de un entrenamiento, paciencia y mucha práctica.

1. Hornear un cryoultramicrotome equipado con un cryoattachment y enfriar a -135 ° C.
2. Cortar cubreobjetos congelados en aprox. 3 x 3 mm cuadrados utilizando un escalpelo afilado previamente enfriada. Incrustar piezas con culturas hacia arriba en un líquido "cryoglue" viscoso (una mezcla 01:06 de etanol y 2-propanol ^11), en la norma 3pins de aluminio de diámetro mm diseñado para adaptarse a la tirada de muestras microtomo. Evite fugas cryoglue sobre la superficie de cultivo. Solidificar cryoglue mediante la reducción de la temperatura Caja criogénica a ≤ -160 ° C.
   • Por cortes de cerebro congelado, fije firmemente discos directamente a un mandril espécimen medida por medio de un collar de tornillo.
3. Recorte las áreas seleccionadas de las muestras congeladas - por ejemplo, áreas de células ricas en piezas cubreobjetos o áreas identificadas de rebanadas - para un aprox. Cara del bloque 250 x 250 micras y aproximadamente 100 micras de profundidad utilizando una herramienta de diamante de corte.
4. Cintas Dry-corte de secciones delgadas de CA. -160 ° C usando un diamante cryoknife 35 °, esencialmente como se describe en referencs ^{4, 9.} Velocidad de corte y superficie libre del cuchillo se determinan empíricamente, un buen punto de partida es 0,4 a 0,6 mm / seg a 9 °. El espesor nominal, es decir, muestra de antemano, de secciones hidratados is típicamente 80 nm, aunque secciones son en realidad 1,5-2.0x más gruesa, debido principalmente a la compresión. Para seccionamiento satisfactoria, un dispositivo antiestático es esencial. Coloque la punta de ionización de los dispositivos de 0,5 a 1 cm del borde de la cuchilla y ajustar la potencia de salida hasta que se producen cintas satisfactorias de secciones.
5. Emplear indagaciones pestañas pegando (con epoxi) pestañas para aplicadores de madera. Usando una sonda de este tipo, recoger y secciones de transferencia de la parte de atrás del cuchillo sobre, películas de soporte Pioloform carbono recubierto de resplandor descargada emitidos más de 100 de malla de las redes de cobre doblado y que descansan sobre un indio sobre de aluminio-medio doblado en un estante detrás de trabajo el cuchillo. Veces más de la mitad superior de la parrilla y el sobre, presione con una herramienta de prensado en frío.
6. Transferencia de rejillas envueltos a una celda de la malla conveniente y tienda en una lata de aluminio como se describe en el paso 1.4.

3. Criotransferencia de muestras para el microscopio electrónico

El instrumento básico para EPMAen este laboratorio es un microscopio electrónico analítico operado a 120 kV y equipado para criomicroscopía, es decir, diseñado con un vacío limpio, espécimen-área anticontaminator, una cámara digital 2K x 2K de alta sensibilidad y soporte de la muestra criotransferencia. Compruebe de antemano la alineación microscopio y las condiciones de funcionamiento en ambos modos de bajos y de gran aumento y confirme una columna de vacío satisfactoria, idealmente ≤ 10 ^-7 Torr. Ponga a punto de ser necesario.

1. Compruebe que el aislamiento por vacío del componente de Dewar del cryoholder es satisfactoria. Bomba según sea necesario.
2. Enfriar la cryoholder a su temperatura mínima, por lo menos 160 º C, mientras que en alto vacío dentro de la platina del microscopio, suelte el cable de conexión al titular a su caja de control. Incline el goniómetro 45 ° hacia la derecha antes de retirar el soporte para minimizar LN ₂ derramar en el operador y microscopio superficies.
3. Prepare el cryoworkstation sobremesa enfriando el aislar integrald taza a ≤ 160 ° C.
4. Transferencia (quickly!) la cryoholder enfriado desde microscopio para crio estación de trabajo. Repliegue escudo heladas del titular.
5. Recuperar bajo LN ₂ un sándwich rejilla de almacenamiento y el lugar en la mesa de trabajo de la cryoworkstation. Un anillo de retención para el pocillo de muestra del titular también se coloca sobre la mesa.
6. Abra el sobre de indio y mover la rejilla plegable cerrado al pozo del espécimen cryoholder. Asegure la rejilla con el anillo de retención con la herramienta de llave suministrada y cerrar el escudo de escarcha.
7. Quite rápidamente la cryoholder del cryoworkstation y colocarlo en la bolsa de aire del microscopio y pasar por la secuencia de bombeo lo más rápido posible. En la inserción, debe haber una interrupción mínima de la columna de vacío.
8. Goniómetro Retorno a 0 ° de inclinación. Volver a conectar y reenergize la caja de control y confirme que la temperatura de la muestra es ≤ 150 ° C.
9. Vuelva a llenar el Dewar delContenedor de muestras y permitir que el vacío y la temperatura para recuperarse plenamente.

4. Inspección Visual de las secciones

1. Repliegue el escudo helada del soporte para exponer la muestra y encienda el haz de electrones.
2. Visualmente evaluar la muestra a bajo aumento, por lo general 250X, y la baja iluminación. Como se ilustra en la Figura 1, las secciones deben ser delgada y lisa, no plegado o superposición, plana y bien unido a la película de soporte, y generalmente no oscurecido por barras de la rejilla.
3. Opcionalmente fotografiar secciones seleccionadas. (NOTA: Reducir al mínimo la exposición del haz, ya que las secciones congeladas hidratado son muy susceptibles al daño inducido por haz.) Utilice la etapa automatizado goniómetro digital para almacenar coordenadas de las secciones seleccionadas.

5. La liofilización de las Secciones

1. De secado por congelación secciones mediante el aumento de la temperatura titular a ca. -100 ° C durante ~ 30 min.
2. Recool titular a -160 ° C o menos.
3. Antes de imágenes, apague la unidad de control cryoholder y cable controlador físicamente desconexión para evitar la imagen de deriva debido al ciclo térmico y / o captador de vibraciones.

6. Obtención de imágenes de células y orgánulos

Imágenes estructurales de las secciones liofilizados se obtienen a ca. -160 ° C como en dosis bajas, las imágenes para bajar de cero grabados digitalmente utilizando una cámara CCD de exploración lenta 2k x 2k controlado por software apropiado.

1. Active la EM en modo hi-mag.
2. Elija e imagen en ~ 2000 X (como TIFF, ver Figura 2) celdas seleccionadas y áreas subcelulares de interés en las secciones de alta calidad cuyas ubicaciones fueron registrados y almacenados previamente. (NOTA: Las secciones secas ahora son sustancialmente menos frágiles y menos susceptibles al daño por haz de electrones.
3. Evaluar las imágenes con el fin de seleccionar las regiones de interés (ROI) para el análisis de rayos X. Este paso se puede realizar opcionalmente fuera de línea, en cuyo caso la EM se puede girarfuera y el espécimen se dejó calentar hasta temperatura ambiente.

7. Adquisición de Rayos X Spectra

Espectros de rayos X se puede grabar utilizando cualquiera de los diversos comercial o de diseño personalizado de rayos X sistemas de análisis mínimamente consistentes en una placa de rayos X (EDX) detector de dispersión de energía, asociados electrónica del pulso en el procesador y el software de adquisición y visualización compatible. (El sistema utilizado en esta práctica se describe en la Tabla 1.)

1. Configurar la EM para la adquisición de rayos X mediante la inserción del detector EDX en la columna (si es necesario), la retirada de la apertura del objetivo, y la inserción y el centrado de las aberturas radiación parásita. Ajuste el cryoholder a la temperatura más baja a la que se evita la contaminación de escarcha de la muestra, pero por lo menos por debajo de -100 ° C.
2. Incline el soporte de 20 ° hacia el detector.
3. En condiciones de formación de imágenes de campo amplio, y asumiendo uno tiene la intención de analizar la matriz de un individual mitocondrias, elija una mitocondria para el análisis, se mueve hacia el centro del campo y el enfoque.
4. Vaya al modo de contado (en algunos microscopios sólo convergen el haz usando segundo enfoque del condensador) y aumentar la intensidad del haz de aprox. 3 nA (medido con una taza de Faraday o similar) en un lugar de 100 nm.
5. Inicie el software de adquisición de espectro y empezar 100 seg adquisiciones, que se puede ver el tiempo en directo en la pantalla del monitor. Ahorra espectro registrado (Figura 2). Se prefiere el formato de la EMSA estándar de la industria.
6. Apague el EM y transferir el archivo (s) de múltiples espectros a una (sin conexión) estación de trabajo de análisis.

8. Análisis de X-ray Spectra

Análisis cualitativo

Un espectro EDX (Figura 2, recuadro) es esencialmente un gráfico XY de la intensidad de rayos X de energía vs. Spectra contiene información cualitativa y cuantitativa sobre la composición elemental de tanalizó el volumen, en la que la energía "característica" de un pico identifica el elemento que da lugar a que el pico mientras que la intensidad refleja la cantidad de ese elemento. Los picos característicos montan en la parte superior de un fondo que varía lentamente, el "continuum". (La leyenda de la Figura 2 se analiza más detalles sobresalientes de espectros EDX.) La energía de los colectores de pico para toda la tabla periódica están definidos por la estructura electrónica conocida de elementos, por lo tanto, todos los enlaces de software EDX a una base de datos que identifica automáticamente los componentes de un analito. En un contexto fisiológico, los elementos de interés general que se adaptan bien al análisis EDX incluyen Na (K _α en 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) y Ca (3,69 keV).

1. Tome ventaja de la base de datos de software disponible y las rutinas de asignación de picos para identificar los principales elementos en los espectros. En una muestra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca. (ATENCIÓN:Los dos últimos elementos se superponen!)

Análisis cuantitativo

El análisis cuantitativo de los espectros EDX consiste en extraer el área integrada de los picos identificados y convertir este valor a una concentración. Para el análisis biológico, el enfoque establecido es el método pico / continuo Pasillo ^4,7,10, que se aprovecha del hecho de que la intensidad del continuo (definido anteriormente y en la Figura 2) es proporcional a la masa seca del volumen analizado . Por lo tanto, la relación de pico de área de zona / continuo, cuando se compara con la misma relación en los espectros de las normas de composición conocida, especifica la concentración en el compartimento celular específico. Tenga en cuenta que este enfoque proporciona concentraciones en unidades de moles por peso, por lo general expresa en mmol / kg de peso seco. Esta unidad es inusual y para la interpretación puede requerir la conversión adicional a, por ejemplo, mmol / L de peso húmedo o / mg de proteína mmol, como se describe ELsewhere ^4,10.

2. Extracto de las áreas de pico (y estimaciones de error) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), es decir, Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca, utilizando una de las rutinas de ajuste integrado en el software de análisis (véase la Tabla 1, especialmente la nota 4). Este laboratorio utiliza Simplex o múltiple de mínimos cuadrados apropiado. Tenga en cuenta que este ajuste requiere una cuidadosa atención a la resolución de la superposición entre K y Ca picos (ver Figura 2).
3. Integrar el continuo entre 1,45 a 1,61 keV. Regiones libres de interferencia alternativos pueden ser utilizados.
4. Calcular proporciones pico / continuo y luego concentraciones en comparación con las normas. Propagar errores a través del análisis.
5. Utilice el software estadístico estándar y las fórmulas para calcular los promedios que reflejan la variabilidad biológica.

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Resultados

Las células del cerebro típicamente sufrir una lesión excitotóxica como resultado de la liberación de neurotransmisores patológico que se produce en condiciones isquémicas. EPMA fue fundamental para descubrir cómo la capacidad de las mitocondrias neuronales para secuestrar grandes cantidades de calcio subyace al mecanismo de la lesión. La micrografía de electrones en la Figura 3 ilustra la apariencia de las mitocondrias en criosecciones liofilizados de las neuronas del hipocampo en cultivo con...

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Discusión

El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuen...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)