Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

Résumé

Ce document décrit l'application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.

Résumé

Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l'analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l'interaction d'un faisceau d'électrons avec l'échantillon. Afin de maintenir la distribution d'éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite "cryofixation" du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l'éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d'épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l'emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d'électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d'une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d'intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d'énergie (EDX) spectromètre, traitée par l'électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l'intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l'identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l'analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l'analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l'ischémie.

Introduction

Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l'expression des gènes. D'autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l'AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et autres maladies neurodégénératives ^3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant stimuli physiologiques ou physiopathologiques. Ce but est compliquée par le fait que le calcium est distribué de façon dynamique entre les deux états physiques - libres en solution ou lié à un substrat - et que les concentrations en calcium cellulaire changé au cours de plusieurs ordres de grandeur à la suite d'une stimulation.

Bien qu'il existe plusieurs méthodes avancées disponibles pour l'analyse de free calcium intracellulaire, la détermination des concentrations totales de calcium dans les compartiments intracellulaires définies est réaliste limitée à une approche, à savoir, microsonde électronique (EPMA). EPMA est une technique qui couple un spectromètre à rayons X à un microscope électronique à transmission (MET). Le canon à électrons de TEM se concentre une sonde électronique fixe, submicronique sur une région subcellulaire d'intérêt et les rayons X spécifiques à un élément émis à la suite d'un bombardement d'électrons sont recueillies et analysées (voir les références ^{7, 4} pour les examens techniques détaillées). Avantages de l'EPMA comprennent résolution unique au niveau de l'organite et sensibilité submillimolar. En pratique, cependant, EPMA nécessite cryotechniques spécialisées et de l'instrumentation pour la préparation et l'analyse spécimen. Ici, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour les mesures de calcium intracellulaire utilisant EPMA sont décrits. Calcium intramitochondrial est de i spécialentérêt en raison du rôle crucial que joue la surcharge de calcium mitochondrial dans les maladies neurodégénératives.

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Protocole

L'approche décrite ici a été développé en utilisant des instruments, des outils et des logiciels. Parce que les laboratoires ne seront pas utiliser le même dispositif expérimental de la démarche est généralisée, si possible.

Une. La congélation rapide

La méthode d'analyse d'être décrite est tout à fait dépendante de méthodes cryogéniques pour: 1) la "cryofixation" des cellules ou des tissus d'une manière qui préserve quantitativement la distribution des composants des tissus diffusibles et éléments chimiques comme ils l'étaient dans des cellules vivantes à l'instant de congélation et 2) la préparation d'ultramince cryosections approprié pour l'imagerie et l'analyse dans un TEM. Ces techniques sont brièvement décrites ici, mais les détails nécessaires pour reproduire ces procédures dans d'autres laboratoires sont au-delà de la portée de cet article. Les lecteurs intéressés sont appelés à d'excellents articles récents ^9,14.

Attention: Cette section décrit l'utilisation de savon mouéthane efied, qui est hautement inflammable et potentiellement explosif; précautions appropriées devraient être prises. L'opérateur doit également se familiariser avec de l'azote liquide _(LN2) les mesures de sécurité, y compris couche protectrice de laboratoire, des lunettes et des gants cryoresistant. Remarque: Ici comme partout, tous les outils (pinces, etc) utilisés pour manipuler les échantillons congelés doivent être pré-refroidies dans LN ₂ avant utilisation pour éviter la décongélation accidentelle.

Les cellules cultivées sur des lamelles couvre

1. Préparer un dispositif de gel profond par condensation de l'éthane gazeux à -160 ° C dans la LN puits central ₂ refroidi. Remplir à la marque et couvrir le puits avec le couvercle pivotant en aluminium lorsqu'il n'est pas utilisé.
2. En utilisant des cales de papier-filtre, tache lamelles en plastique de cellules cultivées dans des conditions appropriées expérimentalement à un film aqueux mince. Éponger à partir du bord de façon à éviter de toucher le tissu, le film résiduel idéal, déterminé par essai-erreur, est aussi mince que possible, mais pas si edans d'évaporer et de permettre le séchage de la surface du tissu.
3. En tenant la lamelle couvre-objet par le bord avec une pince de serrage, rapidement plonger dans de l'éthane liquide, soit manuellement, soit à l'aide du piston de la gravité alimenté.
4. Placer la lamelle congelé dans un bol en polystyrène expansé à proximité de LN _2, assez grand pour manipuler le nombre souhaité de lamelles couvre-objet dans des récipients de stockage à long terme. boîtes à bouchon à vis en aluminium qui ne saisissent pas sous _LN2 sont recommandés.

Congélation rapide des tranches de cerveau de culture

5. Sous un microscope de dissection, vue et orienter une tranche de l'hippocampe organotypique, intact et toujours attaché à l'insert de membrane de culture. Placez points repères sur la membrane près du bord de la tranche avec un stylo Sharpie black-type et la photographie.
6. Encore sous le microscope, couper env. 5 x 5 mm carrés de membranes avec des tranches individuelles centrées sur les places. Évitez de toucher la tranche ou la flexion du membrane.
7. Monter une tranche de membrane soutenu, amortie par un ¼ dans la garniture de gélose de diamètre, sur un disque en aluminium conçu sur mesure pour s'adapter à un cryoultramicrotome (décrit ci-dessous). Rapidement geler la tranche par pneumatique projetant contre un bloc de saphir LN _2-refroidi au moyen d'un dispositif sur mesure "claquement de congélation".
8. Déplacer vers stockage comme décrit pour les cellules en culture.

2. Cryosectioning

MISE EN GARDE: produire avec succès des rubans de coupes ultrafines sec coupées, tandis que simple et logique, une formation, de la patience et beaucoup de pratique.

1. Cuire un cryoultramicrotome équipé d'un cryoattachment et laisser refroidir à -135 ° C.
2. Couper des lamelles congelés dans env. 3 x 3 cases mm en utilisant un pointu, scalpel préalablement refroidi. Incluez morceaux avec des cultures vers le haut dans un liquide "cryoglue" visqueux (un mélange 01:06 d'éthanol et de 2-propanol ^11), type sur 3mm broches d'aluminium de diamètre conçu pour s'adapter à l'échantillon mandrin microtome. Éviter les fuites cryoglue sur la surface de culture. Solidifier cryoglue en abaissant la température de cryobox à ≤ 160 ° C.
   • Pour des tranches de cerveau congelés, fixer les disques directement à un échantillon mandrin sur-mesure au moyen d'un collier à vis.
3. Coupez des régions choisies des échantillons congelés - par exemple les zones riches cellules de pièces de lamelle ou domaines identifiés de tranches - une env. Face de bloc de 250 x 250 um et environ 100 um de profondeur à l'aide d'un outil de coupe au diamant.
4. Rubans sec coupe de lames minces à ca. -160 ° C en utilisant un diamant cryoknife 35 °, essentiellement comme décrit dans Références ^{d'4, 9.} Vitesse de coupe et angle de dégagement du couteau sont déterminées de manière empirique, un bon point de départ est de 0,4-0,6 mm / sec à 9 °. L'épaisseur nominale, c'est à dire spécimen avance, des articles hydratés is typiquement 80 nm, bien que les articles sont en fait de 1,5 2.0x plus épais, principalement due à la compression. Pour sectionnement satisfaisante, un dispositif antistatique est essentiel. Placez la pointe ionisante des périphériques de 0,5-1 cm du bord de couteau et régler la puissance de sortie jusqu'à rubans satisfaisantes des articles sont produits.
5. Préparer des sondes de cils par collage (époxy) cils de bois bâtons applicateurs. En utilisant une telle sonde, ramasser et sections de transfert de l'arrière de la lame sur des films de soutien pioloform revêtues de carbone lueur déchargée exprimés plus de 100 mailles des grilles de cuivre de pliage et reposant sur une indium enveloppe d'aluminium plié en deux sur une étagère de travail derrière le couteau. Replier la moitié supérieure de la grille et l'enveloppe, la presse avec un outil pression à froid.
6. Transfert grilles enveloppés dans une boîte de grille pratique et la ranger dans un aluminium peuvent, comme décrit dans l'étape 1.4.

3. Cryotransfert des échantillons à la microscope électronique

L'instrument de base pour EPMAdans ce laboratoire est un microscope électronique analytique fonctionnant à 120 kV et équipé pour cryo-microscopie, qui est, conçu avec un vide propre, spécimen anticontaminator-zone, une haute sensibilité appareil photo numérique 2k x 2k et cryotransfert support de spécimen. Vérifier au préalable l'alignement du microscope et des conditions de fonctionnement dans les deux modes à faible et à fort grossissement et confirmer un vide de la colonne satisfaisante, idéalement ≤ 10 ^-7 Torr. Tune up si nécessaire.

1. Confirmer que l'isolation sous vide de la composante de la cryoholder Dewar est satisfaisante. Pompe selon les besoins.
2. Refroidir le cryoholder à sa température minimum, au moins 160 ° C, tandis que sous vide poussé dans la platine du microscope, détachez le câble reliant le titulaire à son boîtier de commande. Inclinez le goniomètre 45 ° vers la droite avant de retirer le support de minimiser LN ₂ répandre sur les surfaces de l'opérateur et du microscope.
3. Préparer la cryoworkstation de paillasse par le refroidissement de la isoler intégranted tasse à ≤ 160 ° C.
4. Transfert (quickly!) le cryoholder refroidi de microscope à Cryo poste de travail. Rétracter gel bouclier de la porte.
5. Récupérer sous LN _2, un sandwich au réseau de stockage et de place sur la table de travail de la cryoworkstation. Un anneau de retenue pour l'échantillon le puits de la titulaire est également mis sur la table.
6. Ouvrez l'enveloppe d'indium et déplacer la grille de pliage ci-joint pour le bien de l'échantillon de la cryoholder. Fixez la grille avec la bague de retenue en utilisant l'outil de clé fournie et fermer l'écran de gel.
7. Enlever rapidement la cryoholder du cryoworkstation et l'insérer dans le sas du microscope et de passer par la séquence de pompage le plus rapidement possible. Lors de l'insertion, il devrait y avoir une interruption minimale du vide de la colonne.
8. Goniomètre revenir à 0 ° d'inclinaison. Rebranchez et redynamiser le boîtier de commande et de confirmer que la température de l'échantillon est ≤ 150 ° C.
9. Remplir le Dewar de laporte-échantillon et permettent vide et la température se remettre complètement.

4. Enquête visuelle des sections

1. Rentrer le bouclier de gel de la porte pour exposer spécimen et tourner sur le faisceau d'électrons.
2. Évaluer visuellement l'échantillon à faible grossissement, généralement 250X, et un éclairage faible. Comme illustré sur la figure 1, les sections doivent être minces et lisses, non pliée ou en chevauchement, plane et bien attaché à la feuille de support, et généralement pas obscurcie par les barres de la grille.
3. Éventuellement photographier sections choisies. (REMARQUE: Réduire l'exposition au faisceau, depuis les coupes congelées hydraté sont très sensibles aux dommages induits par faisceau.) Utilisez la platine de goniomètre numérique automatisé pour stocker les coordonnées des articles sélectionnés.

5. La lyophilisation des articles

1. Lyophiliser sections en augmentant la température de titulaire à ca. 100 ° C pendant environ 30 min.
2. Recool support à -160 ° C ou moins.
3. Avant imagerie, éteignez l'unité de contrôle de cryoholder et câble de contrôleur physique déconnexion pour éviter la dérive de l'image due à un cycle thermique et / ou des vibrations ramassage.

6. Imagerie des cellules et des organites

Images structurels des articles lyophilisés sont obtenus à ca. -160 ° C, à faible dose, les images sans perte enregistrés numériquement à l'aide d'une caméra CCD à balayage lent 2k x 2k contrôlé par un logiciel approprié.

1. Activez l'EM en mode salut-mag.
2. Choisissez et de l'image à ~ 2000 X (comme TIFF, voir la figure 2) cellules sélectionnées et les zones sub-cellulaires d'intérêt dans les sections de haute qualité dont les emplacements ont déjà été enregistrées et stockées. (NOTE: Les sections sèches sont maintenant beaucoup moins fragile et moins sensible aux électrons du faisceau dommages.
3. Évaluer images afin de sélectionner des régions d'intérêt (ROI) pour analyse aux rayons X. Cette étape peut éventuellement être effectuée hors ligne, auquel cas l'EM peut être tournéet hors de l'échantillon laisse se réchauffer à la température ambiante.

7. Acquisition de rayons X Spectra

Spectres de rayons X peut être enregistré en utilisant n'importe quel de plusieurs commerciale conçue sur mesure ou X-ray systèmes d'analyse minimum consistant en un X (EDX) détecteur à dispersion d'énergie, l'électronique impulsion processeurs et logiciels associés d'acquisition et d'affichage compatible. (Le système utilisé dans ces travaux est décrit dans le tableau 1.)

1. Configurer l'EM pour l'acquisition de rayons X par l'insertion, le détecteur EDX dans la colonne (si nécessaire), le retrait de l'ouverture objectif, et l'insertion et le centrage des ouvertures de rayonnement parasite. Ajuster le cryoholder à la plus basse température à laquelle le gel contamination de l'échantillon est évitée, mais au moins au-dessous de -100 ° C.
2. Incliner le support à 20 ° vers le détecteur.
3. Dans des conditions de formation d'image à grand champ, et en supposant que l'on envisage d'analyser la matrice d'un individual mitochondries, choisissez une mitochondrie pour l'analyse, le déplacer vers le centre du champ et de se concentrer.
4. Passer en mode spot (sur certains microscopes juste converger le faisceau en utilisant deuxième foyer du condenseur) et augmenter le courant de faisceau à ca. 3 nA (mesurée avec une cage de Faraday ou similaire) dans un endroit 100 nm.
5. Lancez le logiciel d'acquisition de spectre et de commencer à 100 acquisitions sec, qui peut être consulté temps en direct sur l'écran d'affichage. Enregistrer spectre enregistré (Figure 2). Le format EMSA standard de l'industrie est préférable.
6. Arrêtez l'EM et transférer le fichier (s) multi-spectres à un (offline) analyse poste de travail.

8. Analyse des rayons X Spectra

L'analyse qualitative

Un spectre EDX (figure 2, en médaillon) est essentiellement un complot xy de l'intensité des rayons X vs énergie. Spectra contiennent des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de til a analysé volume, en ce que l'énergie "caractéristique" d'un pic identifie l'élément donnant lieu à ce que l'intensité maximale alors que reflète la quantité de cet élément. Les pics caractéristiques montent au-dessus d'un fond lentement variable, le "continuum". (La légende de la figure 2 présente en outre des détails importants sur les spectres EDX). L'énergie des collecteurs de pointe pour l'ensemble du tableau périodique sont définis par la structure électronique bien connue d'éléments, donc tous les liens de logiciels EDX à une base de données qui identifie automatiquement les éléments de un analyte. Dans un contexte physiologique, éléments d'intérêt général qui sont bien adaptées à l'analyse EDX comprennent Na (K _α à 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) et Ca (3,69 keV).

1. Profitez de base de données de logiciels disponibles et routines pic correspondant à identifier les éléments majeurs dans les spectres. Dans un échantillon biologique s'attendre à trouver des pics de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et. (ATTENTION:Les deux derniers éléments se superposent!)

Analyse quantitative

L'analyse quantitative des spectres EDX consiste à extraire l'aire intégrée des pics identifiés, et la conversion de cette valeur à une concentration. Pour l'analyse biologique, la méthode est la méthode établie pic / continuum salle ^4,7,10, qui tire parti du fait que l'intensité du continuum (défini ci-dessus et sur ​​la figure 2) est proportionnelle à la masse sèche du volume analysé . Ainsi, le rapport du pic de la zone / zone continuum, par rapport au même rapport dans les spectres de normes de composition connue, indique la concentration dans le compartiment cellulaire ciblée. Notez que cette approche fournit des concentrations en unités de moles par poids, généralement exprimées en mmol / kg de poids sec. Cette unité est inhabituel et d'interprétation peut exiger la conversion supplémentaire, par exemple, mmol / L poids humide ou mmol / mg de protéine, comme décrit elsewhere ^4,10.

2. Extraire des zones de pointe (et des estimations d'erreur) d'éléments biologiques entre Z = 10 à 20 (0,5 à 4,0 keV), à savoir Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et, avec l'une des routines de montage intégrée dans le logiciel d'analyse (voir le tableau 1, en ​​particulier la note 4). Ce laboratoire utilise Simplex ou plusieurs places-moins approprié. Notez que cette mise en place nécessite une attention particulière à la résolution du chevauchement entre K et Ca pics (voir la figure 2).
3. Intégrer le continuum entre 1,45 à 1,61 keV. Régions sans interférences alternatives peuvent être utilisées.
4. Le calcul des ratios de pointe / continuum puis concentrations par rapport aux normes. Propager des erreurs tout au long de l'analyse.
5. Utiliser des logiciels et des formules statistiques standard pour estimer les moyennes qui reflètent la variabilité biologique.

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Résultats

Les cellules du cerveau subissent généralement des blessures excitotoxic à la suite de la libération de neurotransmetteurs pathologique qui se produit dans des conditions ischémiques. EPMA était essentiel pour découvrir comment la capacité des mitochondries neuronales pour séquestrer des quantités massives de calcium sous-tend le mécanisme de la blessure. La micrographie électronique de la figure 3 illustre l'aspect des mitochondries dans les cryosections lyophilisées de neurones d'...

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Discussion

La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l'identification et la quantification de plusieurs éléments d'intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d'identifier les structures d'intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)