מדידה של סידן סה"כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

Summary

מאמר זה מתאר את היישום של מיקרוסקופיה האלקטרונית cryoanalytical למדידת כמותית של תוכן הכולל סידן והפצה ברזולוציה subcellular בדגימות ביולוגיות מוגדרות מבחינה פיזיולוגית.

Abstract

במאמר זה את הכלים, טכניקות, והכלים מתאימים למדידות כמותיות של תוכן יסודות תאיים באמצעות הטכניקה המכונה microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA) מתוארים. סידן הוא Intramitochondrial דגש מיוחד בגלל התפקיד הקריטי שעומס יתר סידן המיטוכונדריה משחק במחלות ניווניות. השיטה מבוססת על הניתוח של קרני ה-X שנוצר במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על ידי אינטראקציה של אלומת אלקטרונים עם הדגימה. על מנת לשמור על הפצת יליד אלמנטי diffusible בדגימות מיקרוסקופית אלקטרונים, EPMA דורשת "cryofixation" של רקמה אחרי הכנת cryosections Ultrathin. הקפאה מהירה של תאים בתרבית או תרבויות הפרוסה organotypic מתבצעת על ידי הצעד ההקפאה באתאן הנוזלי או על ידי הקפאת טריקה נגד גוש מתכת קר, בהתאמה. Cryosections נומינלי 80 ננומטר העבה נחתכים יבש עם סכין יהלום בCA. -16076, C, רכוב על פחם / רשתות נחושת מצופה pioloform, וcryotransferred לcryo-EM באמצעות בעל cryospecimen מיוחד. לאחר סקר חזותי ומיפוי מיקום ב≤ -160 מעלות צלזיוס ומינון אלקטרונים נמוכים, cryosections קפוא התייבשות הם ב-100 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 דקות מיובשים בהקפאה. תמונות ברמת אברון של cryosections המיובש נרשמות, גם במינון נמוך, באמצעות מצלמת CCD איטית סריקה ואזורי subcellular של העניין נבחר לניתוח. קרני ה-X הנפלטת מROIs ידי ממוקדת, אלקטרון בדיקה נייחת, בעוצמה גבוהה נאספות על ידי רנטגן באנרגיה נפיצה ספקטרומטר (edx), מעובד על ידי האלקטרוניקה קשורה, ומוצג כספקטרום ה-X, כלומר, עלילה של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. תוכנה נוספות מאפשרת: 1) זיהוי של מרכיבים יסודיים על ידי האנרגיות שלהם "האופייניות" לשיא וטביעת אצבע; ו2) ניתוח כמוני על ידי מיצוי של אזורי שיא / רקע. מאמר זה מסכם בשתי דוגמאות הממחישות טיפוסייישומי EPMA, אחד שבו ניתוח סידן המיטוכונדריה סיפק תובנה קריטית לתוך מנגנונים של פגיעת יתר רעילה ועוד, שחשפו את הבסיס של התנגדות איסכמיה.

Introduction

יוני סידן הוא ללא ספק ישות תא איתות החשובה והמגוונים ביותר בביולוגיה, ששיחק תפקיד חיוני בתהליכים נורמלים מגוון כמו שידור סינפטי וביטוי גנים. מצד השני, סידן חשוב באותה מידה במוות של תאים. בפרט, הסרת הפיקוח סידן הוא גורם מפתח בפגיעה עצבית בשבץ מוחי, פרקינסון, אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות ^3,5. לכן, חשוב באופן קריטי להבנת כמותית כמה סידן מופץ בתוך תאים, ואיך זה משתנה בעקבות גירויים פיסיולוגיים או pathophysiological. מטרה זו היא מסובכת בשל העובדה כי סידן מופץ באופן דינמי בין שתי מדינות פיזיות - חופשיות בפתרון או קשורה למצע - וכי ריכוזי סידן תאי לשנות פני כמה סדרי הגודל כתוצאה מגירוי.

אמנם יש מספר שיטות מתקדמות זמינות עבור הניתוח של free סידן תוך תאי, קביעת ריכוזי סידן הכולל בתאים תאיים מוגדרים מוגבלת באופן מציאותי לגישה אחת, כלומר, microanalysis אלקטרון הבדיקה (EPMA). EPMA היא טכניקה שזוגות ספקטרומטר X-ray למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). תותח האלקטרונים TEM מתמקד אלקטרון בדיקה נייחת, submicron באזור subcellular של ריבית וקרן ה-X האלמנט ספציפי הנפלטת כתוצאה מהפגזת אלקטרונים שנאספו ונותח (ראה אזכור ^{7, 4} לביקורות טכניות מפורטות). יתרונותיו של EPMA כוללים רזולוציה ברמת אברון אחת ורגישות submillimolar. בפועל, עם זאת, דורשת EPMA cryotechniques מיוחד ומכשור להכנת דגימה וניתוח. הנה, את הכלים, הטכניקות והמכשירים מתאימים למידות של סידן תוך שימוש בEPMA מתוארות. סידן הוא Intramitochondrial של i המיוחדתnterest על חשבון התפקיד הקריטי שמחזות עומס יתר סידן המיטוכונדריה במחלות ניווניות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הגישה המתוארת כאן פותחה תוך שימוש במכשירים ספציפיים, כלים ותוכנות. משום שמעבדות לא תהיה באמצעות ההתקנה ניסיונית את גישתו כללית במידת האפשר.

1. הקפאה מהירה

השיטה אנליטית ללהיות מתואר היא תלויה לחלוטין בגישות קריוגני ל: 1) "cryofixation" של תאים או רקמות באופן שמשמר את כמותית ההפצה של רכיבי רקמות diffusible ויסודות כימיים כפי שהיו בתאי חיים ברגע של הקפאה , ו 2) הכנת ultrathin cryosections מתאימה להדמיה וניתוח בTEM. טכניקות אלו מתוארות כאן בקצרה, אבל פרטים נחוצים כדי לשחזר נהלים אלה במעבדות אחרות הם מעבר להיקף של מאמר זה. קוראים מעוניינים מופנים למאמרים האחרונים מצוינים ^9,14.

זהירות: סעיף זה מתאר את השימוש בסבון נוזליאתאן efied, שהוא דליק מאוד ונפיץ; יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימה. גם מפעיל חייב להיות מוכר עם חנקן נוזלי (LN ₂₎ אמצעי בטיחות, כולל מעיל מגן מעבדה, משקפיים, כפפות וcryoresistant. הערה: פה ולאורך כל דרך, כל הכלים (מלקחיים, וכו ') המשמשים לטיפול בדגימות קפואות חייבים להיות precooled בLN ₂ לפני השימוש, כדי למנוע הפשרה מקרית.

תאים בתרבית על coverslips

1. הכן את מכשיר הקפאה לצלול על ידי עיבוי אתאן גזים ב-160 מעלות צלזיוס בבאר המרכזית _{מקוררת-2} LN. מלא לציון ולכסות היטב עם מכסה אלומיניום ציר כאשר אינו בשימוש.
2. באמצעות טריזי נייר סינון, למחוק coverslips פלסטיק של תאים בתרבית באופן ניסיוני תנאים מתאימים לסרט מימיים דק. למחוק מהקצה כדי להימנע מלגעת ברקמה; סרט שיורי האידיאלי, שנקבע על ידי ניסוי וטעייה, הוא דק ככל האפשר, אך לא כל כך הכבלהתאדות ולאפשר ייבוש של פני השטח הרקמות.
3. מחזיק את coverslip על ידי הקצה עם מלקחיים מתהדקים, לטבול במהירות באתאן הנוזלי, באופן ידני או באמצעות הבוכנה המופעלת כוח הכבידה.
4. מקום coverslip הקפוא בקערה סמוכה קלקר של LN _2, גדולה מספיק כדי לתפעל את המספר הרצוי של coverslips לתוך מיכלי אחסון לטווח ארוך. פחיות כובע בורג אלומיניום שלא לתפוס תחת LN ₂ מומלצות.

הקפאה מהירה של פרוסות מוח בתרבית

5. תחת מיקרוסקופ לנתח, להציג ולהתמצא פרוס בהיפוקמפוס organotypic, ללא הפרעה ועדיין מחובר להוספת קרום התרבות. הצב סימני fiducial על הקרום ליד הקצה של הפרוסה עם עט לנוכל מסוג שחור ולצלם.
6. עדיין מתחת למיקרוסקופ, לחתוך את כ. 5 X 5 ריבועי קרום מ"מ עם פרוסות בודדות מתמקדות בריבועים. הימנע מלגעת בפרוסה או כיפוף membranדואר.
7. הר פרוסה נתמך קרום, מרופדת ב¼ במשטח אגר קוטר, על דיסק אלומיניום מעוצב אישית עשה כדי להתאים cryoultramicrotome (שיפורט להלן). במהירות להקפיא את הפרוסה ידי pneumatically דוחף אותו כנגד גוש ספיר LN ₂ מקורר באמצעות מכשיר "הקפאת טריקה" מותאם אישית.
8. מעבר לאחסון כפי שתואר לתאים בתרבית.

2. Cryosectioning

אזהרה: בהצלחה בהפקת סרטים בחיתוך היבש של חלקים דקים במיוחד, ואילו פשוט והגיוני, דורש אימון, סבלנות ותרגול רב.

1. אופים את cryoultramicrotome מצויד בcryoattachment ומגניב -135 ° C.
2. חותכים coverslips הקפוא לכ. 3 x 3 מ"מ ריבועים באמצעות אזמל חד, precooled. להטביע חתיכות עם התרבויות פונות כלפי מעלה ב" cryoglue "צמיג נוזל (תערובת של אתנול ו1:06 2-propanol ^11), ב -3 בתקןסיכות מ"מ קוטר אלומיניום נועדו להתאים את צ'אק דגימת microtome. הימנע דולף cryoglue על גבי משטח התרבות. לחזק cryoglue על ידי הורדת טמפרטורת cryobox ל≤ -160 ° C.
   • לפרוסות מוח קפוא, באופן מאובטח לצרף דיסקים ישירות לצ'אק דגימת מחוייט באמצעות צווארון בורג.
3. Trim אזורים נבחרים של הדגימות קפואות - למשל אזורי תא עשיר של יצירות coverslip או באזורים מזוהים של פרוסות - לכ. פנים 250 x 250 מיקרומטר בלוק ו~ 100 עומק מיקרומטר באמצעות כלי יהלום זמירה.
4. סרטים לחתוך יבש של סעיפים דקים בCA. -160 מעלות צלזיוס באמצעות cryoknife יהלומים 35 °, למעשה, כמתואר בreferencs ^{4, 9.} מהירויות חיתוך וזווית אישור סכין נקבעות באופן אמפירי; נקודת התחלה טובה היא 0.4-0.6 מ"מ / שנייה בשעה 9 מעלות. העובי הנומינלי, כלומר מראש דגימה, סעיפים התייבשות iזה בדרך כלל 80 ננומטר, למרות שחלקים הם למעשה 1.5-2.0x עבים יותר, בעיקר עקב דחיסה. עבור חתך משביע רצון, מכשיר אנטי סטטי הוא חיוני. הנח את הקצה מייננת של מכשיר 0.5-1 סנטימטר מקצה הסכין ותפוקת חשמל להתאים עד סרטים מספקים של חלקים מיוצרים.
5. הכן את הבדיקות על ידי הדבקת ריסים (עם אפוקסי) ריסים למקלות המוליך עץ. באמצעות בדיקה כזו, להרים וחתכים העברה מהחלק האחורי של הסכין על, סרטי תמיכת pioloform זוהרים משוחרר מצופה פחמן להטיל על רשתות נחושת מתקפל 100 רשת ונח על מעטפת נייר כסף אינדיום חצי מקופלת על מדף שמאחורי עבודה הסכין. מקפלים מעל את החצי העליון של הרשת והמעטפה, לחץ עם כלי כבישה קר.
6. רשתות עטופות העברה לתיבה נוחה רשת וחנות באלומיניום יכולות כפי שמתוארות בשלב 1.4.

3. Cryotransfer של דוגמאות למיקרוסקופ אלקטרונים

מכשיר הליבה לEPMAבמעבדה זו הוא מיקרוסקופ אלקטרונים אנליטית המופעל ב120 KV ומצויד לcryomicroscopy, כלומר, נועד עם ואקום נקי, anticontaminator דגימה באזור, מצלמה דיגיטלית רגישות גבוהה 2k x 2k ובעל דגימת cryotransfer. בדקו מראש יישור מיקרוסקופ ותנאי הפעלה בשני מצבים נמוכים וגבוהה בהגדלה ולאשר ואקום עמודה משביע רצון, באופן אידיאלי ≤ 10 ^-7 טור. כוון את צורך.

1. ודא שבידוד הוואקום של רכיב דיואר של cryoholder הוא משביעת רצון. לשאוב לפי צורך.
2. מגניב cryoholder לטמפרטורה שלו מינימאלית, לפחות -160 מעלות צלזיוס, ואילו תחת ואקום גבוה בתוך הבמה מיקרוסקופ; לנתק את כבל חיבור למחזיק בן תיבת ששליטתה. הטה את 45 ° עם כיוון השעון goniometer לפני הסרת בעל למזער LN ₂ נשפך על משטחי מפעיל ומיקרוסקופ.
3. הכן את cryoworkstation המעבדתיים על ידי קירור הבודד נפרדכוס ד ל≤ 160 ° C.
4. העברה (quickly!) cryoholder מקורר ממיקרוסקופ כדי Cryo תחנת עבודה. לחזור בו מגן הכפור של בעל.
5. אחזר תחת LN ₂ כריך רשת מאחסון ומקום על שולחן העבודה של cryoworkstation. טבעת תמך ולדגימה של בעל היא גם מונחת על השולחן.
6. פתח את מעטפת אינדיום ולהעביר את הרשת מתקפל המצורפת כדי גם הדגימה של cryoholder. לאבטח את הרשת עם טבעת חיזוק שימוש באפשרות הברגים המסופק ולסגור את המגן הכפור.
7. להסיר במהירות את cryoholder מcryoworkstation ולהכניס לתוך מנעל האוויר של המיקרוסקופ ולעבור את רצף השאיבה מהר ככל האפשר. בכניסה, לא אמור להיות הפרעה מזערית של ואקום העמודה.
8. לחזור goniometer ל0 ° הטיה. חבר מחדש וreenergize תיבת הבקרה ולוודא כי טמפרטורת הדגימה היא ≤ 150 ° C.
9. למלא את דיואר שלהדגימה בעל ולאפשר ואקום וטמפרטורה כדי להחלים באופן מלא.

4. סקר חזותי של סעיפים

1. לחזור בו מגן הכפור של בעל לחשוף את הדגימה ולהפעיל את קרן האלקטרונים.
2. מבחינה ויזואלית להעריך את הדגימה בהגדלה נמוכה, בדרך כלל 250X, ותאורה נמוכה. כפי שמודגם באיור 1, סעיפים צריכים להיות דקים וחלק, לא מקופל או חופפים, שטוחים ומחובר היטב לסרט התמיכה, ובאופן כללי לא מוסתרים על ידי סורגי רשת.
3. לחלופין לצלם קטעים נבחרים. (הערה: מזעור חשיפת קרן, שכן חלקים קפואים-התייבשות הם מאוד רגישים לנזקים הנגרם קורה.) השתמש בשלב goniometer הדיגיטלי האוטומטי לאחסון קואורדינטות של קטעים נבחרים.

5. הקפאת ייבוש של סעיפים

1. להקפיא יבשים חלקים על ידי הגדלת טמפרטורת בעל CA. C ° -100 ל~ 30 דקות.
2. Recool בעל ל-C ° -160 או מתחת.
3. לפני ההדמיה, כבה את יחידת בקרת cryoholder וכבל בקר נתק פיזי כדי למנוע סחיפת תמונה עקב רכיבה תרמית ו / או איסוף רטט.

6. הדמיה של תאים ואברונים

תמונות מבניות של חלקים מיובשים בהקפאה מתקבלות בחברת CA. -160 ° C כמו במינון נמוך, תמונות אפס הפסד שנרשמו באופן דיגיטלי באמצעות מצלמת CCD איטי סריקת 2k x 2k נשלטת על ידי תוכנה מתאימה.

1. הפעל את EM במצב Hi-mag.
2. בחר ותמונה ב2,000 X ~ (כמו בפורמט TIFF, ראה איור 2) תאים שנבחרו ואזורי subcellular של עניין בחלקים באיכות גבוהה במקומות שנרשמו בעבר ומאוחסן. (הערה: הקטעים היבשים נמצאים כעת באופן משמעותי פחות שבירים ופחות רגישים לנזקי קרן אלקטרונים.
3. להעריך את התמונות על מנת לבחור אזורים של עניין (ROIs) לניתוח ה-X. לחלופין ניתן לבצע צעד זה off-line, ובמקרה זה ניתן להפעיל EMומהדגימה מותר לחמם לטמפרטורת חדר.

7. רכישת רנטגן ספקטרה

ספקטרום ה-X ניתן להקליט באמצעות כל כמה מסחרי או אישית מעוצב רנטגן מערכות ניתוח מינימאלי בהיקף של גלאי אנרגיה נפיצה רנטגן (edx), אלקטרוניקה דופק מעבד קשורה ורכישת תוכנה והתצוגה תואמת. (המערכת בשימוש במעבדה זו מתוארת בטבלה 1).

1. הגדר את EM לרכישת קרני ה-X על ידי החדרת גלאי EDX לתוך הטור (במידת צורך), נסיגת הצמצם האובייקטיבי, והחדרת ומרכוז כל פתחי קרינה תועים. התאם את cryoholder לטמפרטורה הנמוכה ביותר שבי זיהום כפור של הדגימה הוא נמנע, אבל לפחות מתחת -100 ° C.
2. הטה את בעל 20 ° לכיוון הגלאי.
3. בתנאי הדמיה רחב בתחום, ובהנחה שמתכוון לנתח את המטריצה ​​של individuaמיטוכונדריה ליטר, בחר mitochondrion לניתוח, להעביר אותה למרכז השדה ולהתמקד.
4. עבור למצב נקודה (בחלק מהמיקרוסקופים רק להתכנס הקרן באמצעות מוקד הקבל שני) ולהגדיל את הקרן הנוכחית לCA. 3 Na (כפי שנמדד עם כוס פאראדיי או דומה) למקום 100 ננומטר.
5. הפעל את תוכנת רכישת הספקטרום ולהתחיל 100 רכישות שניות, אשר ניתן לצפות בשידור חי בזמן המסך להציג. להציל את הספקטרום שנרשם (איור 2). פורמט EMSA תקן התעשייה הוא מועדף.
6. כבה את EM ולהעביר את הקובץ מרובה ספקטרום (ים) לתחנת עבודה (לא מקוון) ניתוח.

8. ניתוח של קרני ה-X ספקטרה

ניתוח איכותי

ספקטרום EDX (איור 2, הבלעה) הוא למעשה עלילת XY של עוצמת קרני ה-X לעומת אנרגיה. ספקטרה להכיל מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של tהוא ניתח את עוצמת קול, שבאנרגיה "האופיינית" של שיא מזהה את האלמנט הוליד שיא שבעוד עוצמת משקפת את הסכום של רכיב זה. הפסגות האופייניות לרכב על גבי רקע משתנה באיטיות, "הרצף". (האגדה באיור 2 נוספת דנה בפרטים בולטים של ספקטרום EDX.) האנרגיה של יריעות השיא לטבלה המחזורית כולו מוגדרות על ידי המבנה הידוע האלקטרוני של אלמנטים, ובכך כל קישורי תוכנת EDX למסד נתונים שמזהה באופן אוטומטי רכיבים של אנליטי. בהקשר פיסיולוגי, אלמנטים של אינטרס כללי כי הם גם מתאימים לניתוח edx כוללים Na _(α K ב1.04 Kev), P (2.01 Kev), K (3.31 Kev), וCa (3.69 Kev).

1. נצל את היתרון של מסד הנתונים של תוכנה זמינה ושגרת התאמת השיא לזהות אלמנטים עיקריים בספקטרום. בדגימה ביולוגית מצפה למצוא פסגות לNa, Mg, P, S, Cl, K, ו-CA. (זהירות:שני האלמנטים שעבר חפיפה!)

ניתוח כמותי

ניתוח כמותי של ספקטרום EDX המורכב של חילוץ באזור המשולב של פסגות מזוהות והמרת הערך הזה לריכוז. לניתוח ביולוגי, הגישה שנקבעה היא שיטת הול שיא / רצף ^4,7,10, שמנצלת את העובדה שעוצמת הרצף (שהוגדר לעיל ובאיור 2) היא פרופורציונלית למסה היבשה של הנפח ניתח . לפיכך, היחס בין שטח האזור / רצף שיא, בהשוואה לאותו היחס בספקטרום של סטנדרטים של הרכב ידוע, מציין את הריכוז בתא הסלולרי הממוקד. שים לב שגישה זו מספקת ריכוזים ביחידות של שומות לפי משקל, בדרך כלל באו לידי ביטוי כמשקל יבש מילימול / קילוגרם. יחידה זו היא יוצאת דופן ופרשנות עשוי לדרוש המרה נוספת ל, למשל, משקל רטוב mmol / L או מילימול / חלבון מ"ג, כפי שתוארה אלsewhere ^4,10.

2. לחלץ אזורי שיא (והערכות שגיאה) של אלמנטים ביולוגיים בין Z = 10-20 (.5-4.0 Kev), כלומר Na, Mg, P, S, Cl, K, ו-CA, תוכנה משתמש באחד מהרוטינות הולמת נבנה לניתוח (ראה טבלת מס '1, ובמיוחד הערת שוליים 4). מעבדה זו משתמשת סימפלקס או ריבועים מרובים לפחות הולם. שים לב שהתאמה זו דורשת תשומת לב קפדנית לפתרון החפיפה בין פסגות K ו Ca (ראה איור 2).
3. לשלב את הרצף בין 1.45-1.61 קו. ניתן להשתמש בם אזורים נקיים מהפרעות אלטרנטיביים.
4. חישוב יחס שיא / רצף ולאחר מכן ריכוזים בהשוואה לסטנדרטים. הפץ טעויות לאורך כל הניתוח.
5. השתמש בתוכנה סטטיסטית מקובלת ונוסחאות להערכה ממוצעים המשקפות את השונות ביולוגיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תאים במוח בדרך כלל לקיים פציעת יתר רעילה כתוצאה משחרור הנוירוטרנסמיטר פתולוגיים המתרחש בתנאי איסכמי. EPMA הייתה קריטית כדי לגלות כיצד היכולת של המיטוכונדריה העצבית כדי לעקל כמויות אדירות של סידן עומדת בבסיס המנגנון של פציעה. מיקרוסקופ האלקטרונים באיור 3 ממח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטת האלקטרונים המבוסס על מיקרוסקופ האנליטיות שהוצגה כאן מאפשרת לגילוי, זיהוי והכימות של כמה אלמנטים של עניין ביולוגי, כוללים Na, K, P, ובמיוחד Ca. ניתן לבצע ניתוחים אלה יצאו בsubcellular, כלומר, תוך אברון, רזולוציה בשל היכולת לאתר ולזהות מבנים של עניין בתמונות באיכות גבו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)