Измерение общего кальция в нейронах помощью электронно-зондового рентгеновского микроанализа

Резюме

Эта статья описывает применение cryoanalytical электронной микроскопии для количественного определения общего содержания кальция и распространения на субклеточном резолюции в физиологически определенных биологических образцов.

Аннотация

В этой статье инструменты, методы и инструменты, подходящие для количественных измерений внутриклеточного содержания элементов с помощью метода, известного как электронно-зондового микроанализа (EPMA) описаны. Внутримитохондриальной кальция является особое внимание в связи с важной ролью, что митохондриальная перегрузки кальция играет в нейродегенеративных заболеваний. Метод основан на анализе рентгеновских лучей, генерируемого с помощью электронного микроскопа (ЭМ) при взаимодействии электронного пучка с образцом. В целях сохранения нативного распределение диффундирующих элементов в микроскопии образцов электрона, EPMA требует "cryofixation" из ткани с последующим подготовки ультратонких криосрезов. Быстрое замораживание культивируемых клеток или органотипических культур срез осуществляется путем погружения замораживания в жидком этана или шлема замораживания против холодного металлического блока, соответственно. Криосрезы номинально 80 нм обрезаются сухие с алмазным ножом на ок. -16076, С, установленный на углерод / pioloform покрытием медных сетей, и cryotransferred в крио-ЭМ, используя специализированный держатель cryospecimen. После визуального осмотра и отображения местоположения на ≤ -160 ° С и низкой дозы электронов, замороженные гидратированных криосрезы лиофилизируют при -100 ° С в течение ~ 30 мин. Изображения на уровне органелл высушенных криосрезов записаны, также в низкой дозе, с помощью ПЗС-камеры медленного сканирования и субклеточных регионах, представляющих интерес, выбранной для анализа. Рентгеновские лучи, испускаемые трансформирования стационарным, целенаправленной, высокой интенсивности электронного зонда собирают энергии-рентгеновской (EDX) спектрометра, обрабатывается, связанных электроники, и представлены в качестве рентгеновском спектре, то есть, Сюжет интенсивности рентгеновского излучения по сравнению энергии. Дополнительное ПО облегчает: 1) идентификацию элементарных компонентов по их "характерных" пиковых энергий и отпечатков пальцев, и 2) количественный анализ по добыче пиков / фон. Эта статья завершается двумя примерами, которые иллюстрируют типичныйПриложений EPMA, в котором митохондриальный анализ кальций обеспечивает необходимую понимание механизмов эксайтотоксичного травмы и другой, которые показали основе устойчивости к ишемии.

Введение

Ионы кальция, возможно, наиболее важным и универсальным лицо клеточной сигнализации в биологии, играя важную роль в нормальных процессов как разнообразны, как и синаптической передачи и экспрессии генов. С другой стороны, кальций не менее важно в гибели клеток. В частности, дерегулирование кальция является ключевым фактором в нейронной травмы при инсульте, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний ^3,5. Таким образом, крайне важно, чтобы количественно понять, как кальций распределяется в клетках, и как это меняет следующие физиологических или патофизиологических раздражители. Эта цель осложняется тем, что кальций динамически распределяется между двумя физическими состояниями - бесплатно в растворе или связанного с подложкой - и что концентрации сотовой кальция меняться с течением несколько порядков, как следствие стимуляции.

Хотя Есть несколько передовых методологий, имеющихся для анализа фри ее внутриклеточный кальций, определение общей концентрации кальция в определенных внутриклеточных отсеков реально ограничивается одним подхода, а именно, зондовый микроанализ электронов (EPMA). EPMA является метод, который пары рентгеновский спектрометр для просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). ТЕМ электронная пушка фокусируется стационарный, субмикронного электронный зонд на субклеточном интересующей области и элементов конкретных рентгеновского излучения в результате электронной бомбардировки собираются и анализируются (см. ссылки ^{7, 4} для подробных технических обзоров). Преимущества EPMA включают одной резолюции органелл уровня и submillimolar чувствительность. На практике, однако, EPMA требует специализированных cryotechniques и аппаратуры для подготовки и анализа образцов. Здесь инструменты, методы и инструменты, подходящие для измерения внутриклеточного кальция с использованием ЭЗМА описаны. Внутримитохондриальной кальция представляет особый Iпроценты в связи с важной роли, которую играет митохондриальные перегрузки кальция в нейродегенеративных заболеваний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Описанный здесь подход был разработан с использованием конкретных инструментов, инструментов и программного обеспечения. Потому что лаборатории не будет использоваться та же экспериментальная установка подход обобщается, где это возможно.

1. Быстрое замораживание

Аналитический метод, который будет описан абсолютно зависит от криогенных подходов для: 1) "cryofixation" клеток или тканей таким образом, чтобы количественно сохраняет распределение компонентов диффундирующих тканей и химических элементов, как они были в живых клетках в момент замораживания и 2) подготовка сверхтонких криосрезы подходит для работы с изображениями и анализа в ПЭМ. Эти методы кратко описаны здесь, но детали, необходимые для воспроизведения этих процедур в других лабораториях выходят за рамки данной статьи. Заинтересованные читатели могут обратиться к превосходным последних статей ^9,14.

Внимание: В этом разделе описывается использование жидкого мылаefied этан, который легко воспламеняется и потенциально взрывоопасной; соответствующие меры предосторожности должны быть приняты. Оператор также должен быть знаком с жидким азотом (LN ₂₎ меры безопасности, в том числе защитной халате, в очках, и cryoresistant перчатки. Примечание: Здесь и далее, все инструменты (щипцы и т.д.) используются для обработки замороженные образцы должны быть предварительно охлажденный в LN ₂ перед использованием, чтобы избежать случайного размораживания.

Искусственный клетки на покровные

1. Подготовьте устройство замораживания глубоководный при конденсации газообразного этана в -160 ° C в Л.Н. ₂ охлаждением центрального колодца. Заполните на должном уровне и покрыть хорошо с крышкой поворота алюминиевой когда он не используется.
2. С использованием фильтровальной бумаги клинья, промокните пластиковые покровные культивируемых клеток под экспериментально соответствующих условиях до тонкой водной пленки. Пятно от края таким образом, чтобы они не соприкасались ткани; идеальным остаточная пленка, определяется методом проб и ошибок, это как можно тоньше, но не настолько йв качестве испаряться, и дать высохнуть на поверхности ткани.
3. Проведение покровное по краю с зажимными щипцами, быстро погружают в жидкий этан, либо вручную, либо с помощью силы тяжести питанием поршень.
4. Поместите замороженные покровное в соседнем пенополистирола миску LN _2, достаточно большой, чтобы манипулировать нужное количество покровных в долгосрочные контейнеров для хранения. Алюминиевый колпачок банки, которые не захватить под LN ₂ рекомендуется.

Быстрое замораживание культивируемых срезах мозга

5. Под микроскопом рассекает, вид и сориентироваться органотипической гиппокампа ломтик, спокойно и по-прежнему прикрепленный к культуре мембраны вставки. Наведите координатных меток на мембране вблизи края среза с черным Находчивый типа пера и фотографии.
6. Тем не менее под микроскопом, вырезать ок. 5 х 5 мм мембрана квадраты с отдельными кусочками, сосредоточенных на площадях. Старайтесь не прикасаться срез или изгиб MEMBRANэ.
7. Установите с мембраной поддерживается кусочек, мягкая на ¼ в диаметр агар площадку, на специально созданных алюминиевого диска сделал, чтобы соответствовать cryoultramicrotome (см. ниже). Быстро заморозить кусочек по пневматическим метательным его против Л.Н. ₂ охлаждением сапфирового блока с помощью настроенной "слэм замерзания" устройства.
8. Переход к хранению, как описано в культивируемых клетках.

2. Cryosectioning

Предостережение: успешно производит сухие нарезанные ленты ультратонких срезов, а просто и логично, требует подготовки, терпения и значительной практики.

1. Выпекать вне cryoultramicrotome оснащенный cryoattachment и охлаждают до -135 ° С.
2. Вырезать замороженные покровные в ок. 3 х 3 мм квадраты, используя острый, предварительно охлажденного скальпель. Вставить куски с культурами вверх в вязкой жидкости "cryoglue" (A 1:06 смеси этанола и 2-пропанола ^11), на стандартном 3мм диаметр булавки алюминиевые разработаны, чтобы соответствовать микротоме образца патрона. Не допускайте утечки cryoglue на поверхность культуры. Укрепить cryoglue путем понижения температуры cryobox до ≤ -160 ° С.
   • Для замороженных срезах мозга, надежно закрепить диски прямо на заказ образца патрона с помощью винтовой воротником.
3. Обрежьте выбранные участки замороженных образцов - например, мобильные богатых районах покровное части или определенных областях ломтиками - к прим. Блок лицо 250 х 250 мкм и ~ 100 глубина мкм с помощью инструмента алмазного обрезки.
4. Сухой резки ленты тонких срезов в ок. -160 ° С с использованием 35 ° алмазного cryoknife, по существу, как описано в referencs ^{4, 9.} Скорость резания и задний угол нож определяются эмпирически; хорошая отправная точка составляет 0,4-0,6 мм / сек при 9 °. Номинальная толщина, то есть образец заранее, гидратированных секциях яы обычно 80 нм, хотя на самом деле секции 1.5-2.0x толще, в основном за счет сжатия. Для удовлетворительного срезов, антистатической устройство имеет важное значение. Поместите ионизирующего конца устройства 0,5-1 см от ножа и отрегулировать выходную мощность до удовлетворительные ленты разделами производятся.
5. Подготовьте ресниц зондов путем склеивания (с эпоксидной смолой) ресницы к деревянным аппликатором палками. Использование такой зонд, и трансфер сечения из задней части ножа Onto свечения разряженный, углерода покрытием поддержки pioloform фильмов, поданных более чем 100-сетки складывающиеся медных сетей и отдыха на половину сложенный индия фольги конверт на рабочей полке позади нож. Раза по сравнению с верхней половины сетки и конверт, нажмите с холодного прессования инструмента.
6. Передача завернутые сетки в удобной коробке сетки и хранить в алюминиевом как описано в шаге 1.4.

3. Cryotransfer из образцов в электронный микроскоп

Ядро инструментом EPMAВ этой лаборатории представляет собой аналитический электронный микроскоп работает при 120 кВ и оборудованы для cryomicroscopy, то есть, предназначенный чистой вакууме, образец-области anticontaminator, в 2k 2k х высокой чувствительности цифровой камеры и держателем cryotransfer образца. Проверьте заранее выравнивание микроскопа и условия эксплуатации в обоих режимах с низким и большим увеличением и подтвердите удовлетворительное Вакуумная колонна, в идеале ≤ 10 ^-7 мм рт.ст.. Настройтесь, как это необходимо.

1. Убедитесь, что вакуумная изоляция компонента Дьюара в cryoholder удовлетворительное. Насос по мере необходимости.
2. Охладите cryoholder его минимальной температуры, по крайней мере, -160 ° C, в то время как в высоком вакууме в течение столик микроскопа; отсоединить кабель, соединяющий держатель в коробке управления. Наклоните гониометра 45 ° по часовой стрелке, прежде чем снимать держатель для минимизации LN ₂ проливая на оператора и микроскопа поверхностей.
3. Подготовьте настольный cryoworkstation охлаждением интегральное изолироватьг стакана до ≤ 160 ° C.
4. Передача (quickly!) охлажденный cryoholder от микроскопом, чтобы крио станцию. Уберите от замерзания щит его владельца.
5. Получить под LN ₂ сэндвич сетка из хранилища и места на рабочем столе в cryoworkstation. Кольцо стопорное для пробы владельца будет также размещена на столе.
6. Откройте индия конверт и двигаться прилагаемую складной сетку для образца лунку cryoholder. Закрепите сетку с стопорное кольцо с помощью инструмента гаечный ключ для и закрыть мороза щит.
7. Быстро удалить cryoholder от cryoworkstation и вставьте в шлюз микроскопа и пройти последовательности насосной как можно быстрее. На вставке, должно быть минимальным ущербом вакуума колонки.
8. Вернуться гониометра до 0 ° наклона. Подключите и оживления блок управления и убедитесь, что температура образца ≤ 150 ° C.
9. Пополните дьюареДержатель образцов и позволяют вакуум и температура, чтобы полностью восстановиться.

4. Визуальный обзор разделов

1. Уберите мороза щит держателя подвергать образец и включите электронного пучка.
2. Визуально оценить образец при малом увеличении, обычно 250X и низкой освещенности. Как показано на рисунке 1, секции должны быть тонкими и гладкими, не сложить или перекрытия, плоские и хорошо прикреплен к опорной фильма, да и вообще не видно из-за сетки баров.
3. При желании сфотографировать выбранные разделы. (ПРИМЕЧАНИЕ: Свести к минимуму воздействие луча, так как замороженные гидратированных разделы очень чувствительны к повреждениям луча-индуцированной.) Используйте автоматическую этап цифровой гониометра для хранения координаты выбранных разделов.

5. Лиофилизация разделов

1. Freeze-сухие участки, увеличивая температуру держатель для ок. -100 ° C для ~ 30 мин.
2. Recool держатель до -160 ° С или ниже.
Перед изображений, выключите блок управления cryoholder и физически отсоединить кабель контроллера, чтобы избежать дрейфа изображения из-за термоциклирования и / или пикап вибрации.

6. Визуализация клеток и органелл

Структурные изображения лиофилизированных секций получены при ок. -160 ° C, а в низких дозах, нулевой потери изображения, записанные в цифровом использовании 2k х 2k с медленной разверткой ПЗС-камеры контролируется соответствующим программным обеспечением.

1. Активируйте EM в режиме привет-маг.
2. Выбрать и изображения на ~ 2000 X (как TIFFs, см. рисунок 2) выбранные ячейки и субклеточных областях, представляющих интерес в качественных участков, местоположение которых ранее были записаны и сохранены. (ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные разделы теперь существенно менее хрупкими и менее восприимчивы к повреждениям электронного пучка.
3. Оценка фотографий, чтобы выбрать интересующие участки (Rois) для рентгеноструктурного анализа. Этот шаг может быть необязательно выполнены в автономном режиме, и в этом случае EM может быть включенс, а образец оставляли нагреваться до комнатной температуры.

7. Приобретение Рентгеновские спектры

Рентгеновские спектры могут быть записаны с использованием любого из нескольких коммерческих или специально разработанный рентгеновский анализ системы минимально, состоящие из рентгеновских лучей (EDX) детектора энергии-дисперсионные, связанных импульсно-процессорных электроники и совместимым определение и отображение программного обеспечения. (Система, используемая в этой лаборатории описана в таблице 1.)

1. Настройте EM для приобретения рентгеновского, вставив детектор EDX в колонну (при необходимости), снятия объективную диафрагму, и вставки и центрирования любые беспризорные излучения отверстия. Отрегулируйте cryoholder самой низкой температуре, при которой мороз загрязнение образца избежать, но по крайней мере ниже -100 ° С
2. Наклоните держатель 20 ° по отношению к детектору.
3. В условиях формирования изображения шириной поля, и предполагая, один намерен проанализировать матрицу с индивидовл митохондрии, выбрать митохондрии для анализа, переместить его в центре поля и сосредоточиться.
4. Переход в режим точечной (на некоторых микроскопов просто сходятся луч с помощью второй фокус конденсатор) и увеличить ток пучка в прим. 3 нА (при измерении с Фарадея или аналогичный) в пятно 100 нм.
5. Запустите программу приобретения спектр и начать 100 приобретений сек, которые могут быть просмотрены живой времени на экране монитора. Сохранить записанный спектр (рис. 2). Предпочтительным является отраслевым стандартом формат EMSA.
6. Выключите EM и передать файл (ы) с несколькими спектров к (Offline) станции анализа.

8. Анализ рентгеновских спектрах

Качественный анализ

EDX спектр (рис. 2, вставка), по существу, ху график интенсивности рентгеновского против энергии. Спектры содержат качественную и количественную информацию о элементного состава тон проанализировал объем, в том, что «характерной» энергии пика идентифицирует элемент порождая этого пика в то время как интенсивность отражает количество этого элемента. Характерные пики ездить на вершине медленно меняющейся фоне, в «континуума». (Легенда Рисунок 2 далее обсуждает существенные детали спектров EDX.) Энергия пиковых коллекторы для всей периодической таблицы определяются известной электронной структуры элементов, таким образом всех программных EDX ссылки на базы данных, которая автоматически идентифицирует компоненты Аналит. В физиологическом контексте, элементы, представляющие общий интерес, которые хорошо подходят для анализа EDX включают Na (K _α на 1,04 кэВ), P (2,01 кэВ), K (3.31 кэВ) и Ca (3,69 кэВ).

1. Воспользуйтесь доступны программного обеспечения базы данных и пик согласующих процедур для выявления основных элементов в спектрах. В биологическом образце рассчитывают найти пики для Na, Mg, P, S, Cl, K и Са. (ВНИМАНИЕ:Последние два элемента перекрываются!)

Количественный анализ

Количественный анализ спектров EDX заключается в извлечении интегрированную площадь выявленных пиков и преобразования этого значения до концентрации. Для биологического анализа, установлено, подход является метод пик / континуум Hall ^4,7,10, который использует тот факт, что интенсивность континуума (определенный выше, и на фиг.2) пропорциональна массе сухого вещества анализируемого объема . Таким образом, отношение площади пика область / континуума, по сравнению с тем же соотношением в спектрах стандартам известного состава, указывает концентрацию в целевой сотовой отсеке. Следует отметить, что этот подход обеспечивает концентраций в единицах молей на весу, обычно выражается в виде ммоль / кг сухого веса. Это устройство является необычным и для интерпретации может потребоваться дополнительное преобразование в, например, ммоль / л сырой вес или ммоль / мг белка, как описано ELsewhere ^4,10.

2. Выписка пиков (и оценки погрешности) биологических элементов между Z = 10-20 (0,5-4,0 кэВ), то есть Na, Mg, P, S, Cl, К, Са, используя один из установочных процедур, встроенный в программное обеспечение для анализа (см. таблицу 1, особенно примечание 4). Эта лаборатория использует Simplex или несколько-наименьших квадратов фитинг. Заметим, что это уместно требует особого внимания к решению перекрытие между К и Са пиков (см. рисунок 2).
3. Интеграция континуум между 1.45-1.61 кэВ. Альтернативные без помех регионы могут быть использованы.
4. Рассчитать коэффициенты пик / континуума, а затем концентраций по сравнению с стандартами. Propagate ошибок по всему анализа.
5. Используйте стандартный статистического программного обеспечения и формулы для оценки средние, которые отражают биологическую изменчивость.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Клетки мозга, как правило, поддерживать эксайтотоксический травмы в результате патологического высвобождения нейромедиаторов, которое происходит при ишемических состояний. EPMA имеет решающее значение для открытия, как способность нейронов митохондрий поглощать огромное количество ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Электронный микроскоп на основе аналитический метод, представленный здесь позволяет для обнаружения, идентификации и количественного определения нескольких элементов биологический интерес, в том числе Na, K, P, и особенно Са. Эти анализы могут проводиться на субклеточном, т.е. внут?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)