電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

要約

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。

要約

この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて​​組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。

概要

カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患^3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。

FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献^7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。

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プロトコル

ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。

1。急速凍結

彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「低温固定」：後述する分析方法は、極低温のためのアプローチに絶対に依存していると、2）TEMで画像化及び分析に適した超薄凍結切片の調製。これらの技術は、ここで簡単に説明しますが、他の研究室では、これらの手順を再現するために必要な詳細はこの記事の範囲を超えています。興味のある読者は、優れた最近の記事を^9,14と呼ばれている。

注意：このセクションでは、液体石鹸の使用が記載されている引火性が高いと爆発する可能性あるefiedエタン;適切な予防措置が取られるべきである。また、オペレータは、液体窒素に精通している必要があります（LN _2）保護白衣、メガネ、そしてcryoresistant手袋など安全上の注意、。注：ここでは全体を通して、（鉗子など ）凍結した検体を処理するために使用されるすべてのツールは、偶発的な融解を避けるために、使用前に、LN ₂で予冷されている必要があります。

カバースリップ上で培養した細胞

1. LN ₂冷却された中央ウェル中に-160℃で気体状エタンを凝縮して、デバイスを凍結思い切って準備します。マークに記入し、ピボットアルミ蓋、使用しないときによくカバーしています。
2. 濾紙ウェッジを用いて、薄い水性フィルムに、実験的に適切な条件下で培養された細胞のプラスチック製カバースリップブロット。組織に触れないようにするために、端からブロット、試行錯誤によって決定理想的な残留フィルムは、できるだけ薄いではないので、目組織表面の乾燥を蒸発させて可能にするためにある。
3. クランプ鉗子でエッジカバーグラスを持ち、迅速に手動で、または重力駆動のプランジャーを用い、液体エタン中に浸す。
4. 長期保存容器にカバースリップ所望の数を操作するのに十分な大きさ、LN ₂の近くの発泡スチロールのボールに凍結したカバーガラスを配置します。 LN ₂の下で押収しないアルミスクリューキャップ缶を推奨します。

培養された脳スライスの急速凍結

5. 解剖顕微鏡下で、ビューと邪魔されず、まだ培養膜インサートに付属器官型海馬スライスを、向けます。黒シャーピー型ペンと写真でスライスのエッジ付近の膜上の基準マークを配置します。
6. それでも、顕微鏡下で、約切り出す。正方形を中心とした個々のスライスに5×5ミリメートルの膜の正方形。スライスに触れたりmembranを曲げないE。
7. （後述）cryoultramicrotomeに合うように作られたカスタム設計されたアルミニウム製ディスク上に、直径寒天パッドに¼によりクッション性の膜サポートスライスを、マウントします。急速に空気圧でカスタマイズされた「スラム凍結」装置を用いて、LN ₂冷却型サファイアブロックに対してそれを推進することでスライスを凍結。
8. 培養細胞について記載したようにストレージに移動します。

2。凍結切片

注意点は：正常に超薄切片のドライカットのリボンを生産する、簡単で論理的ながら、訓練、忍耐とかなりの練習が必要です。

1. -135℃にcryoattachmentとクールな装備cryoultramicrotomeを焼く
2. 約に凍結されたカバースリップをカット。シャープ、予備冷却メスを用いて3×3ミリメートルの正方形。培養物は、標準的な3に、粘性のある液体」cryoglue」に（エタノールの午前1時06分混合し、2 -プロパノール^11）を上にして作品を埋め込 ​​むミクロトーム試料チャックに適合するように設計直径のアルミニウムピン。培養表面上にcryoglueが漏れないようにしてください。 -160℃で≤するcryobox温度を下げることによってcryoglueを固める
   • 凍結した脳スライスの場合は、しっかりとネジカラーを用いてカスタムメイドの試料チャックに直接ディスクを添付します。
3. 約に-スライスのカバーガラス片または識別された領域の例えば 、細胞が豊富な地域-凍結した検体の選択された領域をトリミング。ダイヤモンドのトリミングツールを使用して250×250程度のブロック面と〜100μmの深さ。
4. カリフォルニア州での薄い切片のドライカットのリボン。-160℃のreferencs ^4、9に記載されて本質的に、35°のダイヤモンドcryoknifeを使用。切削速度とナイフ逃げ角を経験的に決定され、良好な出発点は、9°で0.4〜0.6ミリメートル/秒である。水和された部分の公称厚さ、 すなわち標本アドバンス、Iの項では、主に圧縮のために、実際には1.5-2.0倍厚いが、一般的には80n​​mだ。満足の切片化のため、静電気防止用器具が不可欠です。ナイフエッジからデバイス0.5〜1センチメートルのイオン化の先端を置き、セクション満足なリボンが生成されるまで、出力電力を調整します。
5. 木製アプリケータースティックに（エポキシで）まつげを接着することによってまつげプローブを準備します。このようなプローブを使用し、100メッシュの銅グリッドを折り畳み、背後にある作業用の棚に折りインジウム箔封筒に載っ上にキャストグロー放電を行うと、炭素被覆PIOLOFORMの支持フィルム上にナイフの背面からピックアップし、転送部ナイフ。冷間プレスツールでグリッドと封筒の上半分には、を押します折り重なり。
6. アルミ便利グリッドボックスとストアへの転送包まれたグリッドが、ステップ1.4で説明することができます。

3。電子顕微鏡の試料のクライオトランスファー

EPMAのコア測定器この研究室で120 kVので作動し、低温顕微鏡のために装備、つまり、クリーンな真空、試料面積anticontaminator、2K X 2Kの高感度デジタルカメラやクライオトランスファー試料ホルダーに設計された分析電子顕微鏡がある。両方の低·高倍率モードで顕微鏡のアライメントおよび動作条件を事前に確認して、理想的≤10 ^-7トル、満足なカラム真空を確認する。必要に応じてチューンアップする。

1. cryoholderのデュワー部品の真空断熱が十分であることを確認します。必要に応じてポンプ。
2. 顕微鏡ステージ内で高真空下にある間、その最低温度、少なくとも-160℃までcryoholderを冷却、そのコントロールボックスにホルダーを接続するケーブルを取り外す。オペレータおよび顕微鏡表面にこぼれるLN _2を最小化するためにホルダーを取り外す前に、角度計45°時計回りに傾けます。
3. 一体型絶縁するを冷却することによりベンチトップcryoworkstationを準備160℃〜≤Dカップ
4. 転送（quickly!）クライオワークステーションに顕微鏡から冷却cryoholder。保有者の霜シールドを撤回。
5. LN ₂ cryoworkstationの作業テーブル上のストレージと場所からグリッド·サンドイッチの下で取得します。ホルダの試料ウェルについての保持リングは、テーブル上に置かれる。
6. インジウム封筒を開き、cryoholderの検体ウェルに囲まれた折りたたみグリッドを移動します。提供スパナツールを使用して、保持リングとグリッドを確保し、霜シールドを閉じます。
7. 迅速cryoworkstationからcryoholderを削除して、顕微鏡のエアロックに挿入し、可能な限り迅速に、ポンピングシーケンスを通過。挿入時に、カラム真空の中断を最小限に抑えるがあるはずです。
8. 0°チルト角度計を返します。再接続してreenergizeコントロールボックスを、試料温度が150℃≤であることを確認
9. のデュワーを補充試料ホルダーと真空と温度が完全に回復することができます。

4。セクションの視覚的な調査

1. 試料を露出し、電子ビームをオンにするホルダーの霜シールドを後退させる。
2. 視覚的には低倍率、通常は250倍、低照度での試料を評価する。 図1に示されるように、セクションでは、薄くて滑らかで、折り畳まれていないか、または重複し、平らで十分に支持膜に付着してもよく、一般的には、グリッド·バーで隠さないようにしてください。
3. 必要に応じて選択した部分を撮影しています。 （注：凍結した水和の項では、ビーム誘起損傷を非常に受けやすいことから、ビーム露光を最小限に抑えます。）選択したセクションの座標を保存するために自動化されたデジタルゴニオステージを使用してください。

5。セクションの凍結乾燥

1. 凍結乾燥切片を約するホルダ温度を増加させることによって-100°C〜30分間。
2. 下の-160℃以下にホルダーを再冷却。
イメージングの前に、熱サイクルおよび/または振動ピックアップに像ドリフトを避けるためにcryoholder制御ユニットと、物理的に切断コントローラーケーブルをオフにしてください。

6。細胞およびオルガネラのイメージング

凍結乾燥されたセクションの構造の画像は、約で得られる。 -160°Cのような低用量、適切なソフトウェアによって制御さ2kのX 2kのスロースキャンCCDカメラを用いてデジタル的に記録されたゼロロス像。

1. こんにちは-MAGモードでEMをアクティブにします。
2. 選択したセルや場所、以前に記録し、保存した高品質のセクションへの関心の細胞内の領域（TIFFのように、 図2を参照）〜2000 xで選択した画像。 （注：乾燥した切片は、現在実質的に壊れにく​​く、電子ビームによる損傷を受けにくい。
3. X線分析のための関心領域（ROI）を選択するために画像を評価する。このステップは、必要に応じてEMをオンにすることができる場合には、オフラインで行うことができるオフし、室温まで温めた試料。

7。 X線スペクトルの取得

X線スペクトルは、最小エネルギー分散型X線（EDX）検出器、関連するパルスプロセッサエレクトロニクスと互換取得および表示ソフトウェアからなるいくつかの商用またはカスタム設計されたX線分析装置のいずれかを用いて記録することができる。 （このラボで使用されるシステムは、 表1に記載されている。）

1. 、コラム（必要な場合）にEDX検出器を挿入する対物絞りを撤回し、浮遊放射開口部を挿入し、センタリングにより、X線取得のためのEMを構成します。試料の霜汚染が回避される最低温度にcryoholderを調整するが、少なくとも-100℃以下の
2. ホルダの検出器に向けて20°に傾けます。
3. 広視野撮像条件の下で、一方がindividuaのマトリックスを分析しようとすると仮定しLのミトコンドリアは、分析のためのミトコンドリアを選択するフィールドの中央に移動し、焦点を当てています。
4. 100 nmのスポットにスポットモード（一部の顕微鏡にちょうど第二凝縮フォーカスを用いたビームを集束）に移動し、CAにビーム電流を大きくしてください。3 NA（ファラデーカップまたは類似で測定した）。
5. スペクトル取得ソフトウェアを起動し、表示モニターにライブの時間を表示することができます100秒の買収を、開始します。記録されたスペクトル（ 図2）を保存します。業界標準のEMSA形式が好ましい。
6. EMをシャットダウンして（オフライン）分析ワークステーションに複数のスペクトルのファイルを転送します。

8。 X線スペクトルの解析

定性分析

EDXスペクトル（ 図2、挿入図）は、本質的なエネルギー対のX線強度のX-Yプロットである。スペクトルはTの元素組成についての定性的および定量的な情報が含まれていますピークの「特徴」エネルギーは強度がその要素の量を反映しながら、そのピークを生じさせる要素を識別するという点で、彼は、ボリュームを分析した。特徴的なピークは「連続体」、ゆっくりと変化する背景の上に乗っている。 （ 図2伝説がさらにEDXスペクトルの顕著な詳細を説明します。）全体の周期表のピーク多様体のエネルギーは、要素のよく知られた電子構造、自動的にコンポーネントを識別し、データベースへのため、すべてのEDXソフトウェアリンクによって定義されています分析対象。生理的な文脈では、EDX分析に非常に適している一般的な関心の要素は、NA（1.04 keVの時の_{Kα）、P（2.01} keVの）、K（3.31 keVの）、およびCa（3.69 keVの）が含まれています。

1. スペクトル中の主要な要素を識別するために利用可能なソフトウェア·データベースとピーク·マッチング·ルーチンを活用。生体試料中のNa、Mgを、P、S、CL、K、およびCAのピークを見つけることを期待しています。 （注意：最後の2つの要素が重なって！）

定量分析

EDXスペクトルの定量分析は、同定されたピークの積分面積を抽出し、この濃度値を変換することからなる。生物学的分析のために、確立されたアプローチは、（上記および図2で定義された）連続体の強度が分析され、ボリュームの乾燥質量に比例するという事実を利用するホールピーク/連続法^4,7,10、ある。既知の組成の標準のスペクトルの同じ比率と比較した場合、これにより、ピーク面積/連続面積の比は、標的細胞区画中の濃度を特定する。このアプローチは、一般的ミリモル/ kg乾燥重量として表される重量当たりのモル単位での濃度を、提供することに注意してください。このユニットは珍しいとELが説明されているように解釈のため、例えば、ミリモル/ Lの湿重量またはモル/ mgタンパク質に付​​加的な変換が必要な場合があります^4,10を sewhere。

2. Z = 10〜20（0.5〜4.0 keVの）との間の生物学的エレメントのピーク面積（及び誤差推定値）を抽出する、 すなわちナトリウム、およびMg、P、S、Clで、K、およびCa、解析ソフトウェアに組み込まれたフィッティングルーチンのいずれかを使用して（特に4脚注、 表1を参照）。このラボでは、シンプレックスまたは複数の最小二乗フィッティングを使用しています。このフィッティングは、KおよびCaのピークの間のオーバーラップをします（ 図2を参照） を解決するには十分注意が必要であることに注意してください。
3. 1.45から1.61 keVの連続体を統合する。代替的な干渉のない領域を使用することができる。
4. 標準との比較により、ピーク/連続比および濃度を計算します。分析を通じてエラーを伝播する。
5. 生物学的変動を反映して平均値を推定するために、標準的な統計ソフトウェアや数式を使用してください。

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結果

脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミ?...

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ディスカッション

ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)