La colonoscopia flexible en ratones para evaluar la gravedad de la colitis y colorrectal tumores utilizando un sistema validado de puntuación endoscópica

Resumen

En los últimos años, los endoscopios de nueva generación se han convertido en importantes ayudas de investigación de diagnóstico para la evaluación de la colitis murina y tumores colorrectales. Se presenta en el presente documento un protocolo detallado para la evaluación endoscópica de la inflamación y tumores colorrectales en ratones, así como un sistema de puntuación novedoso que utiliza identificadores decimales para documentar la gravedad de la colitis endoscópica y tumores colorrectales.

Resumen

El uso de la endoscopia moderna con fines de investigación ha facilitado en gran medida nuestra comprensión de las patologías gastrointestinales. En particular, la endoscopia experimental ha sido de gran utilidad para los estudios que requieren evaluaciones repetidas en un solo animal de laboratorio, tales como los mecanismos de evaluación de la enfermedad intestinal inflamatoria crónica y la progresión del cáncer colorrectal. Sin embargo, los métodos utilizados en los estudios son muy variables. Al menos tres sistemas de puntuación endoscópicos se han publicado para la colitis murina y publicado protocolos para la evaluación de los tumores colorrectales no tienen en cuenta la presencia de inflamación colónica concomitante. Este estudio desarrolla y valida un sistema de puntuación endoscópica reproducible que integra la evaluación de la inflamación y los tumores de forma simultánea. Este novedoso sistema de puntuación tiene tres componentes principales: 1) la evaluación de la extensión y severidad de la inflamación colorrectal (basado en hallazgos perianales, la transparencia del wall, sangrado de la mucosa y lesiones focales), 2) de grabación cuantitativa de las lesiones tumorales (mapa de cuadrícula y gráfico de barras), y 3) la clasificación numérica de casos clínicos por su relevancia patológica y la investigación basada en unidades decimales con categorías asignadas de lesiones observadas y complicaciones endoscópicas (identificadores decimales). El vídeo y el manuscrito que aquí se presenta se prepararon siguiendo los protocolos aprobados por la IACUC, para permitir a los investigadores a los puntos de sus ratones experimentales utilizando una metodología endoscópica bien validado y altamente reproducible, con la opción de sistema para diferenciar distal proximal de colitis endoscópica (D-PECS ).

Introducción

Endoscopia murino se ha realizado como una herramienta de investigación útil para más de una década ^1-3. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que emplean la endoscopia murino han utilizado endoscopios rígidos, aunque algunos también han utilizado la sigmoidoscopia flexible. Endoscopia murino proporciona resultados inmediatos y una estimación más objetiva del grado de normalidad intestinal, la gravedad de la inflamación y la progresión del tumor en comparación con medidas indirectas, como la pérdida de peso, diarrea, y la histología (que no es óptima cuando las lesiones son irregulares), mientras que ofreciendo puntos de vista sobre el estado general de salud del colon. Más notablemente, la endoscopia permite la evaluación repetida de modelos de animales de laboratorio con el tiempo, a diferencia de examen histológico tradicional que requiere que el animal que ser sacrificados y los dos puntos que se recogerá para su análisis ^1. A pesar de estas ventajas, el uso de la tecnología endoscópica murino no ha sido extendido y está limitada por la falta de protocolos estandarizados para la impleen y la puntuación de los hallazgos patológicos. Implementado correctamente, endoscopia murino representa una gran promesa para facilitar aún más la comprensión y caracterización de modelos animales de múltiples estados patológicos gastrointestinales crónicas, incluyendo enfermedades inflamatorias del intestino, colitis, y los tumores colorrectales.

La utilidad de la tecnología endoscópica murino gira en torno a su reproducibilidad y objetividad, que requiere la existencia de procedimientos de examen estandarizados y un sistema de puntuación consistente, no redundante y confiable para las patologías intestinales. Al menos tres sistemas de puntuación para la evaluación endoscópica descriptivos de la colitis ^4-6, así como para los tumores de colon ^4,7,8 en ratones han sido publicados. Sin embargo, estos enfoques reportados y sistemas de puntuación no son fácilmente comparables entre los estudios. En muchos casos, no existe una definición clara de los criterios utilizados para la clasificación de las lesiones, y cuando se dan criterios, que varían ampliamente. Por otra parte,no hay sistemas de puntuación reportados que integran la evaluación tanto de la colitis y tumores, dos de las patologías del colon más comunes que pueden ocurrir al mismo tiempo y tienen efectos interactivos sobre el resultado, en una única herramienta de medición. Por último, los sistemas de puntuación endoscópicos que existen para la colitis menudo tienen categorías inflamatorios con la discriminación limitado (es decir. Opciones estrechas de puntuación en escalas de enteros cortos, a menudo 1-4) para representar adecuadamente los escenarios de progresión de la enfermedad y permitir el uso de análisis estadístico paramétrico.

En este trabajo se describe el uso de un endoscopio flexible para evaluar la gravedad de la colitis murino y los tumores del colon y describir un protocolo estandarizado para el empleo de esta tecnología en la evaluación anatómica de la región perianal, el recto y el colon distal. Nos ilustran la solución de problemas efectiva durante la endoscopia para minimizar el trauma y la imagen artefactos, y se describe un sistema de puntaje reproduciblebasado en parámetros clínicos publicados validados. El sistema de puntuación se integra la evaluación de la inflamación y tumores intestinales usando un alto nivel de discriminación con 12 posibles grados de inflamación, la cartografía del tumor y opciones de gráfica, y un novedoso sistema de unidades decimales (es decir, identificadores decimal) para resaltar hallazgos con valor diagnóstico específico ( el desarrollo del tumor, es decir, las complicaciones durante la endoscopia, etc.) El uso de identificadores decimales permite un rápido seguimiento de los conjuntos de datos relevantes para un análisis más profundo de aguas abajo. Por último, llevamos a cabo pruebas de fiabilidad y validez del sistema de puntuación en múltiples modelos murinos de colitis y el cáncer asociado con la colitis (dextrán sulfato sódico (DSS)-colitis inducida, infección por Clostridium difficile, y azoximetano / cáncer de colon inducida por DSS).

Protocolo

1. Configuración del sistema de endoscopia

1. Establecer el sistema de endoscopia antes de anestesiar a los ratones, siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice un ureteroscopio video diseñado para los seres humanos de este protocolo (Figura 1). El diámetro exterior del tubo de inserción es 9,9 Fr (3,3 mm), su extremo distal es 8,5 Fr (2,8 mm), y el diámetro interior del canal de instrumentación es de 6 Fr (1,2 mm).
2. Aunque el uso de endoscopios no se han relacionado con la transmisión de la enfermedad [9], esterilizar el endoscopio y la lente con etanol al 70% o ¹⁰ con técnicas apropiadas cuando se trabaja con los microorganismos que forman esporas. Preparar lubricante estéril bacteriostática y que no raye limpiar tejidos para saturar la punta del endoscopio.
3. Acople una jeringa de 3 ml lleno de aire (o una mezcla de CO ₂ gas adecuado) a la parte superior del canal de instrumentación.
4. Encienda la fuente, y configurar el balance de blancos en luz blanca normal,así como el modo de imagen de banda estrecha (NBI), según proceda. Desde 2001, NBI ha proporcionado beneficios de diagnóstico por imagen, ya que hace hincapié en las estructuras de los vasos sanguíneos finos en las membranas mucosas, incluyendo lesiones ulcerosas y tumorales, que tienen características de vascularización anormal ^11. Modo de NBI-filtro restringe la longitud de onda de la luz capturada a 390-445 nm y 530-550 nm, lo que pone de relieve las estructuras con la hemoglobina.
5. Imprima el formulario de puntuación de evaluación (Figura 2) para registrar sus hallazgos. Familiarizarse con las imágenes normales esperados y NBI (Figura 3A) y la definición y grados de cada criterio antes del examen (ver sección 6.1).
6. Preparar una solución a base de colorante en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante cromoendoscopia, si se desea. En cromoendoscopia, el examen se lleva a cabo usando un colorante como medio de contraste para resaltar los cambios de las mucosas. Utilice el azul de metileno (0,1-1%) y carmín índigo (0.1%) soluciones (Figura 3B). Notaque el azul de metileno es un agente de oxidación-reducción que puede producir radicales oxidantes, reticulación indirecta de residuos de aminoácidos, y la degradación del ADN ^12, lo que podría interferir con el análisis de la muestra.

2. Anestesia General del Ratón

1. Elija la ruta agente y administración de la anestesia. Consulte a un veterinario de un centro de recursos animales o Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en cuanto a la posible interferencia de los medicamentos con el sistema inmune y los objetivos de investigación. Algunos medicamentos pueden influir en el perfil de la expresión de citoquinas en animales, incluyendo roedores ^13. Utilice tribromoethanol inyectable para procedimientos terminales o isoflurano para endoscopias de supervivencia, junto con los controles adecuados.
2. Para la inducción, administrar 4-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de 0,2-0,5 l / min, el uso de 0,5-2% para el mantenimiento. Este protocolo no es apropiado para todos los animales. Consulte a su veterinario instalaciónpara las instrucciones y la formación adecuadas. Cumplir con las recomendaciones pertinentes del IACUC para alcanzar los más altos estándares de bienestar animal. Asegúrese de que el ratón si está completamente anestesiado.
3. 'Correa' el ratón anestesiado a una tabla en una superficie de apoyo dorsal o ventral posición con cinta adhesiva de laboratorio. Cuidado con la orientación anatómica en la pantalla del endoscopio. Asegure sus extremidades inferiores y la cola. Una banda de cinta también se puede colocar sobre el pecho para evitar el movimiento lejos de la mascarilla de respiración, pero evitar la restricción de movimientos ventilatorios torácicos.

3. Examen detallado endoscópica

1. Busque lesiones perianales antes de introducir el endoscopio en el recto, y luego avanzar en el ámbito de aplicación a través del ano.
2. Escudo del endoscopio con lubricante quirúrgico estéril. Asegúrese de no cubrir la superficie del CCD (dispositivo de carga acoplada) sensor.
3. Inserte el endoscopio y empezar a grabar. Los vídeos grabados son útiles para mEvaluación eticulous de endoscopia si es necesario después del examen. Intente realizar la endoscopia en la menor duración posible para minimizar la irritación intestinal / mucosa.
4. Aplicar aire mediante el uso de una jeringa para establecer lentamente aparte de las paredes intestinales. Dependiendo del tamaño del ratón, utilizar 1-2 ml de aire. Evite la excesiva insuflación de aire, ya que puede causar dificultad respiratoria y la muerte del ratón anestesiado.
5. Haga avanzar el endoscopio hacia adelante a medida que despejar el camino con el aire o rotación suave del alcance. No haga avanzar el endoscopio si no ve la luz intestinal. Perforaciones o desgarros rectales / colónica pueden ocurrir en esta etapa, especialmente en ratones jóvenes (<8-10 semanas de edad). Tome fotografías según sea necesario.
6. Como el alcance avanza, evaluar si hay sangrado espontáneo (definido como natural hemorragia mucosa no se asocia con la endoscopia traumática). El sangrado espontáneo se puede observar como el endoscopio entra en el recto y el colon.
7. ComoSESS la transparencia de la pared del colon. La transparencia se define como la capacidad de visualizar los vasos sanguíneos intramurales en el colon y el de las otras vísceras circundantes (Figura 4). Movimiento suave del alcance (back-hacia adelante, hacia la derecha, hacia la izquierda) le ayudará a determinar si los vasos sanguíneos pueden ser vistos en el contexto de otras vísceras. Tejido adiposo mesentérica también puede ser visto. Nota si el recto dentro de la cavidad pélvica aparece menos transparente que la pared del colon en la cavidad abdominal.
8. Inspeccione para determinar el tipo y el número de lesiones focales (áreas edematosas, erosiones, úlceras, masas tumorales). Esto se hará constar en el formulario de puntuación mediante la puntuación de la inflamación del colon y los identificadores de decimales que se han desarrollado.
9. Una vez se alcanza el área en la que el colon se flexiona caudalmente en el colon proximal, retirar el endoscopio lentamente y buscar la presencia de contactos de sangrado (que se produce debido a la mucosa después de la friabilidadendoscopio es avanzado o eliminado). No es necesario para raspar la superficie de colon intencionalmente. Mucosa colorrectal sana no sangra después de un examen endoscópico adecuado.

4. Biopsia

1. Cuando se necesitan biopsias, insertar los fórceps de biopsia a través del canal del endoscopio dedicado para la instrumentación. Monitorear el avance de las pinzas en la pantalla endoscopio para prevenir la perforación intestinal.
2. Abra las copas de biopsia de la pinza alrededor de a un ángulo de excavación-cup 60-80 º, y dirigirlos a la zona de interés. Fórceps o presión excesivamente abiertas pueden comprender capas adicionales de tejido intestinal, lo que resulta en una perforación inducida por biopsia de las paredes intestinales transparentes sanos. Si ocurre una perforación, la eutanasia a los animales durante la anestesia tras sus recomendaciones IACUC. Perforaciones resultan en la endotoxemia y la peritonitis.
3. Cierre las tazas de la biopsia, y tirar de ellos hacia fuera, manteniendo las pinzas cerradas.
4. Remove la muestra de los fórceps por lavado el tejido con una solución que es suave para el tejido y los fórceps. ARN más tarde y PBS son soluciones comunes de trabajo, si es necesario, utilice la aguja para sacar la muestra. Evitar la erosión de las copas de fórceps o bordes de corte.

5. La recuperación de la anestesia

1. Una vez finalizado el examen, proporcionar un ambiente cálido para el ratón hasta que se recupere. Utilice una luz eléctrica, o una compresa caliente a 37 ° C. Evitar el sobrecalentamiento; vasodilatación periférica compromete la recuperación de los animales. Vigilar estrechamente el ratón hasta la recuperación completa.

6. Sistema de puntuación endoscópica Integrado de Salud colorrectal con decimales Identificadores

1. Utilice el formulario de puntuación (Figura 2) y las definiciones de los parámetros por debajo (Evaluación endoscópica de murino colorrectal Tumores Inflamación y uso de un sistema ponderado Decimal Scoring: Definiciones de los parámetros, y el Protocolo) paraejemplos y el "sistema de distal-proximal endoscópica Colitis anotando 'opcional (D-PECS) como directrices para la evaluación no sesgada y mantenimiento de registros detallados.
2. Puntuación de los cuatro parámetros de inflamación colorrectal descritos en el formulario de sistema de puntuación (Figura 2). Meticulosamente evaluar la región perianal, la transparencia intestinal, tipo de sangrado intestinal (si está presente), y la presencia y la cantidad de lesiones focales (erosiva, ulcerosa, y / o tumoral).
3. Al evaluar los tumores con fines de investigación, examinar la cantidad, la ubicación y el tamaño, y describirlas utilizando el mapa del colon y el gráfico de barras en la forma de puntuación. La suma numérica de las puntuaciones obtenidas y número de lesiones (cuando sea aplicable) determinará el fondo de la inflamación del colon, el tipo más predominante de la lesión, y el número de lesiones.

Resultados

El protocolo y las imágenes se presenta en este estudio se prepararon con un endoscopio flexible Olympus URF-V ¹⁴ y NBI ^11,15. Las imágenes de vídeo se guardan en formato MPEG-2 y las imágenes en formato JPG, TIF, PNG o formato DICOM con un máximo de 1280 x 1024 píxeles, transferibles a las memorias portátiles USB flash estándar. NBI mejora el contraste visual de los tejidos que contienen hemoglobina. La luz normal y la imagen NBI son características clave para ilustrar la anatomía normal...

Discusión

Hay varias consideraciones respecto a la modificación y la resolución de problemas de la técnica endoscópica en ratones. Aspectos críticos del procedimiento que tiene que ser dominado durante el uso de la endoscopia flexible incluyen el ajuste del volumen de aire necesario para evitar la distensión abdominal y el compromiso respiratorio del ratón, y los aspectos técnicos de menor importancia del control de vista de la coordinación de los controles de angulación y torque . El control de par es importante reduci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System