Bir Geçerliliği Endoskopik Puanlama Sisteminin Kullanılması Kolit ve Kolorektal Tümörlerin Şiddetini Değerlendirmek için Farelerde esnek Kolonoskopi

Özet

Son birkaç yılda, yeni nesil endoskoplar kemirgen kolit ve kolorektal tümörlerin değerlendirilmesinde önemli bir tanı araştırma yardımcıları olarak ortaya çıkmıştır. Bu farelerde enflamasyonun ve kolorektal tümörleri endoskopik değerlendirme, hem de kolit ve kolorektal tümörleri endoskopik şiddetini belge ondalık tanımlayıcıları kullanan yeni bir skorlama sistemi için bu tarifnamede detaylı bir protokol mevcut.

Özet

Araştırma amaçlı, modern endoskopi kullanımı büyük ölçüde gastrointestinal patolojilerin anlayışımızı kolaylaştırmıştır. Özel olarak, deneysel endoskopi, kronik enflamatuar bağırsak hastalığının mekanizmaları ve kolorektal kanserin ilerlemesini değerlendirmek gibi tek bir laboratuar hayvanına tekrar değerlendirme gerektiren çalışmaları için oldukça faydalı olmuştur. Ancak, çalışmalar arasında kullanılan yöntemler oldukça değişkendir. En az üç endoskopik skorlama sistemleri kemirgen kolit yayınlanan ve kolorektal tümörlerin değerlendirilmesi için protokoller eşzamanlı kolon iltihabı varlığını ele başarısız yayınlanmıştır. Bu çalışma, geliştirir ve aynı zamanda inflamasyon ve tümörlerin hem de değerlendirme bütünleştirir tekrarlanabilir bir endoskopik skorlama sistemi doğrular. Perianal bulgularına dayanarak kolorektal inflamasyon ölçüde ve şiddeti 1) değerlendirme (wal şeffaflık: Bu yeni puanlama sistemi üç ana bileşeni vardırl, mukozal kanama, ve fokal lezyonlar), 2) tümör lezyonları (grid harita ve bar grafiği), ve gözlenen lezyonların atanmış kategorilerin ondalık birimlere dayanarak patolojik ve araştırma alaka klinik vakaların 3) sayısal sıralama kantitatif kayıt ve Endoskopik komplikasyonlar (ondalık tanımlayıcılar). Burada sunulan görüntü ve el yazması araştırmacılar yakın endoskopik kolit (D-PECS gelen distalinde ayırt etmek için sistem seçeneği ile, iyi doğrulanmış ve yüksek tekrarlanabilir endoskopik yöntem kullanılarak kendi deneysel fareler puan için izin, IACUC onaylı protokolleri takip hazırlandı .)

Giriş

Mürin endoskopi bir yılda ^1-3 için yararlı bir araştırma aracı olarak yapılmıştır. Bazıları da fleksibl sigmoidoskopi kullanılan olmasına rağmen bugüne kadar, kemirgen endoskopi kullanılarak çalışmaların çoğu, rijit endoskoplar kullandık. Mürin endoskopi hemen sonuç sağlar ve bağırsak normallik, inflamasyon şiddeti ve vücut kilo kaybı, ishal, ve histoloji gibi dolaylı önlemler, (lezyonlar yamalı zaman suboptimaldir) kıyasla progresyonla ölçüde daha objektif tahmin ederken kolon genel sağlık anlayışlar sunan. Ötenazi ve iki nokta üst üste analiz ¹ için hasat edilecek olan hayvan gerektiren geleneksel histolojik inceleme aksine En önemlisi, endoskopi, zaman içinde laboratuvar hayvan modellerinin tekrar değerlendirilmesi için izin verir. Bu avantajlara rağmen, murin endoskopik teknolojisinin kullanımı yaygın olmamıştır ve implementati için standart protokoller eksikliği ile sınırlıdırve patolojik bulgular puanlama. Düzgün uygulanan, kemirgen endoskopi daha anlayışımızı ve inflamatuvar barsak hastalıkları, kolit, ve kolorektal tümörler dahil olmak üzere birçok kronik gastrointestinal hastalık durumlarında, hayvan modellerinin karakterizasyonu kolaylaştırmak için büyük umut vaat ediyor.

Kemirgen endoskopik teknoloji programı standart bir muayene prosedürlerinin varlığını ve bağırsak patolojileri için tutarlı olmayan gereksiz ve güvenilir puanlama sistemi gerektirir üretilebilmesi ve nesnellik, üzerine menteşeleri. En az üç açıklayıcı puanlama kolit ^4-6 endoskopik değerlendirme sistemleri, hem de kolon tümörleri farelerde ^4,7,8 için yayınlanmıştır. Ancak, bu rapor yaklaşımlar ve puanlama sistemleri çalışmalar arasında kolayca karşılaştırılabilir değildir. Birçok durumda, lezyonların sınıflandırılması için kullanılan kriterlerin net bir tanımı yoktur, ve kriterler verildiğinde, onlar büyük ölçüde değişmektedir. Ayrıca,kolit ve tümörler, tek bir ölçme aracı haline anda ortaya çıkar ve sonuç üzerinde interaktif etkileri olabilir en yaygın kolon patolojilerin iki, hem de değerlendirmesini entegre bildirilen hiçbir skorlama sistemleri vardır. Son olarak, kolit için var olmayan endoskopik skorlama sistemleri genellikle sınırlı ayrımcılık ile inflamatuvar kategoriler var (yani. Genellikle 1-4 kısa tamsayı ölçekleri üzerinde dar puanlama seçenekleri) düzgün hastalığın ilerlemesi senaryolar temsil ve parametrik istatistiksel analiz kullanımını etkinleştirmek için.

Bu yazıda, murin kolit ve kolonik tümörlerin şiddetini değerlendirmek ve perianal bölge, rektum ve distal kolon anatomik değerlendirilmesinde bu teknolojiyi kullanarak için standart bir protokolü tarif etmek için esnek bir endoskop kullanılmasını tarif eder. Biz Travma ve görüntü bozulmalarını en aza indirmek için endoskopi sırasında etkili giderme göstermek, ve biz bir tekrarlanabilir skorlama sistemi tanımlamakvalide yayınlanan klinik parametrelere dayalı. Skorlama sistemi (özel tanı değeri ile bulgularını vurgulamak için 12 iltihap, tümör haritalama olası notları ve komplo seçenekleri ve yeni bir ondalık birim sistemi (yani, ondalık tanımlayıcılar) ile ayrımcılık yüksek düzeyde kullanarak bağırsak iltihabı ve tümörlerin hem de değerlendirme bütünleştirir yani tümör geliştirme, endoskopi, vb sırasında komplikasyonlar). Ondalık tanımlayıcıların kullanılması daha fazla alt analizi hakkında veri setlerinin hızlı izleme sağlar. Son olarak, kolit ve kolit ile ilişkili kanser (dekstran sülfat sodyum (DSS) kaynaklı-kolit, Clostridium difficile enfeksiyonu ve azoksimetan / DSS-kaynaklı kolon kanseri) birden kemirgen modellerinde güvenilirlik ve puanlama sisteminin geçerliliği test gerçekleştirin.

Protokol

1.. Endoskopi Sistemi Kurma

1. Üreticinin talimatlarına, fareler anestezi önce endoskopi sistemi kurun. Bu protokol için, insanlar için dizayn edilmiş bir görüntü üreteroskop (Şekil 1) kullanın. Ekleme tüpün dış çapı 9,9 Fr (3.3 mm) olan, kendi uzak uç 8,5 Fr (2.8 mm) olan ve enstrümantasyon kanalın iç çapı 6 Fr (1,2 mm) 'dir.
2. Endoskop kullanımının hastalık bulaşma ile bağlantılı olmasına rağmen [9], spor oluşturan mikroorganizmalar ile çalışırken% 70 etanol ¹⁰ ile ya da uygun tekniklerle endoskop ve lens sterilize. Bakteriyostatik steril yağ ve non-kaşıma endoskop ucu doyurmak için dokuları silin hazırlayın.
3. Enstrümantasyon kanalın üst hava dolu bir 3 ml şırınga (ya da uygun bir _CO2 gaz karışımı) takın.
4. Gücü açın ve normal beyaz ışık beyaz dengesini kurmak,uygulanabildiği gibi dar bantlı görüntüleme (NBI) modu. Bu karakteristik anormal kanlanmalı ¹¹ var ülseratif ve tümöral lezyonların dahil mukoza üzerinde ince damar yapıları, vurgular gibi 2001 yılından bu yana, NBI tanısal görüntüleme faydalar sağlamıştır. NBI-filtre modunda hemoglobin olan yapıların vurgular 390-445 nm ve 530-550 nm, yakalanan ışığın dalga boyunu kısıtlar.
5. Bulgularını kaydetmek için değerlendirme puanlama formu (Şekil 2) yazdırın. (Bkz. Bölüm 6.1) sınav öncesi beklenen normal ve NBI görüntüleri (Şekil 3A) ve tanım ve her kriter sınıflarda aşina.
6. Arzu edildiği takdirde, kromoendoskopi için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) bir boyar madde bazlı çözelti hazırlayın. Kromoendoskopi olarak, sınav mukozal değişiklikleri vurgulamak için bir kontrast ortamı olarak bir boya kullanılarak gerçekleştirilir. Metilen mavisi (% 0.1-1) ve indigo karmin (% 0.1) çözümleri (Şekil 3B) kullanın. Notbu metilen mavisi numune analiz engelleyebilir oksitleyici radikalleri, amino asit kalıntılarının dolaylı çapraz bağlanmasını, bozulmasını ve DNA ^12, üretebilen bir oksitleme-indirgeme maddesidir.

2. Fare Genel Anestezi

1. Anestezik ajan ve yönetim rotayı seçin. Bağışıklık sistemi ve araştırma hedefleri ile ilaçların olası müdahalesi konusunda bir hayvan kaynak tesis veya Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) bir veteriner danışın. Bazı ilaçlar kemirgenler de dahil olmak üzere ^13, hayvanlarda sitokin profili ifade etkileyebilir. Uygun kontroller ile birlikte, sağkalım endoskopi terminal prosedürleri izofluran veya enjektabl tribromoethanol kullanın.
2. Indüksiyonu için, 0.2-0.5 L / dk 'lık bir oranda% 100 oksijen izofluran 4-5% yönetmek, bakım için 0.5-2% kullanın. Bu protokol, tüm hayvanlar için uygun değildir. Lütfen tesis veteriner hekiminuygun talimatlar ve eğitim için. Hayvan refahı için en yüksek standartlara ulaşmak için ilgili IACUC tavsiyelerine uymak. Fare tamamen anestezi eğer emin olun.
3. "Kayış 'laboratuar yapışkan bant kullanılarak bir dorsal veya ventral bir pozisyonda bir destek yüzeyi tabloya anestezi fare. Lütfen endoskop ekranda anatomik oryantasyon sakının. Alt ekstremite ve kuyruk sabitleyin. Bant bir bant da uzak respiratöre gelen hareketini engellemek, ancak göğüs solunum hareketlerini kısıtlayan önlemek için göğüs üzerine yerleştirilebilir.

3. Ayrıntılı Endoskopik Sınav

1. Sonra anüs yoluyla kapsamını ilerlemek, rektum içine endoskop takmadan önce perianal lezyonlar arayın.
2. Coat steril cerrahi yağlayıcı ile endoskop. Değil CCD (şarj bağlı cihaz) sensör kat yüzeyini emin olun.
3. Endoskop takın ve kaydetmeye başlayın. Kaydedilen videolar m için yararlıdırmuayeneden sonra gerekirse endoskopi eticulous değerlendirilmesi. Mukozal / bağırsak tahrişi en aza indirmek için zaman mümkün olan en az uzunluğu endoskopi gerçekleştirmek için çalışın.
4. Yavaş yavaş bağırsak duvarları ayrı ayarlamak için bir şırınga kullanarak hava uygulayın. Fare boyutuna bağlı olarak, havanın 1-2 ml kullanın. Aşırı hava insuflasyonu kaçının, bu anestezi fare solunum sıkıntısı ve ölüme neden olabilir.
5. Eğer hava veya kapsam nazik rotasyonu ile önünü olarak öne endoskop ilerlemek. Eğer bağırsak ışığını göremiyorsanız endoskop ilerlemek etmeyin. Perforasyonlar ya da kolon / rektal yırtıklar, özellikle genç farelerde (<8-10 haftalık), bu aşamada oluşabilir. Gerektiğinde fotoğraf çekmek.
6. Kapsamı ilerledikçe (tanımlandığı gibi doğal olarak meydana gelen mukozal kanama travmatik endoskopi ile ilişkili olmayan) kendiliğinden kanama olup olmadığını değerlendirmek. Endoskop rektum ve kolon girer gibi spontan kanamalar görülebilir.
7. Olarakkolon duvarının şeffaflık Sess. Şeffaflık kolon içi kan damarları görselleştirmek ve çevredeki diğer organların (Şekil 4) yeteneği olarak tanımlanır. Kapsam nazik hareketi (back-forward, saat yönünde, saat yönünün tersine) kan damarlarının diğer organların bağlamında görülebilir olmadığını belirlemede yardımcı olacaktır. Mezenterik yağ dokusu da görülebilir. Pelvik boşluğun içindeki rektum karın boşluğunda kolonik duvar daha az saydam görünür olmadığına dikkat ediniz.
8. Fokal lezyonların (ödemli alanlar, erozyonlar, ülserler, tümoral kitlelerin) türünü ve sayısını belirlemek için kontrol edin. Bu kolon enflamasyon skoru ve geliştirilmiştir ondalık tanımlayıcıları kullanarak puanlama şeklinde kaydedilecektir.
9. Kolon yakın kolon içine caudally şişiriyor alan ulaşıldığında, yavaş yavaş endoskop çekilme ve sonra ufalanabilirliğinin mukozal kanama nedeniyle oluşur temas (varlığı için bakmakendoskop) ileri veya kaldırılır. Bu kasıtlı olarak kolon yüzeyine temas için gerekli değildir. Sağlıklı kolorektal mukoza uygun endoskopik muayene sonrasında kanamaz.

4. Biyopsi

1. Biyopsileri ihtiyaç olduğunda, enstrümantasyon için özel endoskop kanalından biyopsi forseps yerleştirin. Intestinal perforasyon önlemek için endoskop ekranda forseps ilerlemesini izleyin.
2. 60-80 ° cup-fincan açı yaklaşık forseps biyopsi bardak açın ve ilgi alanına yönlendirmek. Aşırı açılmış forseps veya basınç sağlıklı şeffaf bağırsak duvarlarının bir biyopsi kaynaklı delinmesi ile sonuçlanan bağırsak dokusu, ekstra katmanları kavramak olabilir. Perforasyon ortaya çıkarsa, IACUC şu önerilerde anestezi sırasında hayvan euthanize. Perforasyonlar endotokseminin ve peritonit sonucu.
3. Biyopsi bardak kapatın ve forseps kapalı tutarken onları çekin.
4. Remodoku ve forseps nazik bir çözelti ile yıkama ile doku Forseps numune ettik. RNA daha sonra PBS ve ortak bir çalışma çözüm yolu; gerekirse, örnek çıkarmak için iğne kullanın. Forcep bardak aşındıran ya da kesme kenarları kaçının.

5. Anestezi Kurtarma

1. Kurtarır kadar muayene tamamlandıktan sonra, fare için sıcak bir ortam sağlamak. Bir elektrik ışığı veya 37 ° C'ye ayarlanmış sıcak bir bez ya da kullanma Aşırı ısınmayı önlemek; periferik damar genişlemesi hayvan kurtarma uzlaşma. Tam iyileşme kadar yakından fare izleyin.

6. Ondalık tanımlayıcıları ile Kolorektal Sağlık Entegre Endoskopik Puanlama Sistemi

1. Için: (Parametre Tanımlar ve Protokolü bir ondalık ağırlıklı Puanlama Sisteminin Kullanılması Mürin Kolorektal iltihaplanma ve Tümörler Endoskopik Değerlendirilmesi) puanlama formu (Şekil 2) ve aşağıdaki parametre tanımlarını kullanınörnekler ve nonbiased değerlendirilmesi ve ayrıntılı kayıt tutmak için kurallar olarak isteğe bağlı 'Distal-Proksimal Endoskopik Kolit skorlama sistemi' (D-PECS).
2. Skorlama sistemi şeklinde (Şekil 2) açıklandığı kolorektal inflamasyon dört parametre skor. Titizlikle perianal bölgeyi, bağırsak şeffaflık, kanama bağırsak tipini (varsa) ve varlığı ve fokal lezyonların miktarını (erozif, ülseratif ve / veya tümöral) değerlendirir.
3. Araştırma amaçlı tümörleri değerlendirirken, miktarı, konumu ve boyutunu incelemek ve kolon harita ve puanlama formunda çubuk grafiği kullanarak bunları açıklamak. Elde edilen puanları ve lezyon sayısı (varsa) ait sayısal toplamı plan kolon iltihabı, lezyonun en baskın türü ve lezyonların sayısını belirleyecektir.

Sonuçlar

Bu çalışmada sunulan protokol ve görüntüleri Olympus URF-V esnek endoskop ¹⁴ ve NBI ^11,15 ile hazırlanmıştır. Video görüntüleri MPEG-2 formatında ve JPG, TIF, PNG, veya standart USB flash taşınabilir belleklere devredilemez maksimum 1.280 x 1.024 piksel, ile DICOM formatındaki resimlerin kaydedildi. NBI hemoglobin içeren dokuların görsel kontrast artırır. Normal ışık ve NBI görüntüleme kolorektal mukozanın normal anatomi ve ülser ve tümör gelişimi (Şekil 3A...

Tartışmalar

Farelerde endoskopik tekniğinin modifikasyonu ve sorun giderme ile ilgili çeşitli hususlar vardır. Esnek endoskopi kullanımı sırasında hakim olması gereken prosedürün kritik yönleri açılanma ve tork kontrollerinin koordinasyonu ile karın şişliği ve fare solunum uzlaşma önlemek için gerekli hava hacmi ayarı ve görünümü kontrol minör teknik yönlerini kapsamaktadır . Tork kontrol intestinal perforasyon riskini en aza indirmek için önemlidir. Düzgün bir şekilde ele alınıp, kemirgen esnek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System