Гибкая Колоноскопия у мышей, чтобы оценить тяжесть колита и колоректального опухолей возможность использования системы Validated Эндоскопическая Scoring

Резюме

За последние несколько лет, новые эндоскопы поколения появились в качестве важных диагностических исследований СПИДа для оценки мышиный колит и колоректального опухолей. Мы представляем здесь подробный протокол для эндоскопической оценки воспаления и колоректального опухолей у мышей, а также в качестве нового балльной системе, которая использует десятичные идентификаторы для документирования эндоскопическое тяжесть колита и колоректального опухолей.

Аннотация

Использование современных эндоскопии для исследовательских целей в значительной степени облегчает наше понимание желудочно-кишечных патологий. В частности, экспериментальная эндоскопия была весьма полезна для исследований, требующих повторных взносы в одной лабораторных животных, таких, как тех, кто оценивает механизмы хронического воспалительного заболевания кишечника и прогрессирование рака прямой кишки. Однако методы, используемые в различных исследованиях, крайне непостоянны. По крайней мере, три эндоскопические системы скоринга были опубликованы для мышиного колита и опубликованы протоколы для оценки толстого кишечника не решают присутствие сопутствующей толстой воспаления. Это исследование разрабатывает и утверждает воспроизводимый эндоскопическое систему подсчета очков, которая интегрирует оценку как воспаления и опухоли одновременно. Эта система роман забил состоит из трех основных компонентов: 1) оценка степени и тяжести колоректального воспаления (на основе перианальных выводов, прозрачность вальл, кровотечение слизистой, и очаговые поражения), 2) количественный учет опухолевых поражений (сетка карты и гистограммы), и 3) численное сортировки клинических случаев их патологической и исследовательской актуальности на основе десятичных единиц с назначенных категорий наблюдаемых поражений и эндоскопические осложнения (десятичные идентификаторы). Видео и рукописи, представленные здесь были подготовлены после IACUC утвержденных протоколов, чтобы следователи забить свои собственные экспериментальные мышей, используя хорошо проверенные и хорошо воспроизводимый эндоскопической методики, с возможностью системы дифференцировать дистальнее от проксимального эндоскопической колита (D-ПЕСГ ).

Введение

Мышиные эндоскопия была выполнена в качестве полезного инструмента исследования для более десяти лет ^1-3. На сегодняшний день большинство исследования с использованием мышиного эндоскопии использовали жесткие эндоскопы, хотя некоторые из них также используется гибкий сигмоидоскопию. Мышиные эндоскопия дает немедленные результаты и более объективная оценка степени кишечной нормальной, тяжести воспаления и прогрессирования опухоли по сравнению с косвенных мер, таких как потеря веса тела, диарея и гистологии (который является неоптимальным, когда поражения пятнистый), в то время как предлагая взглянуть на общее состояние здоровья толстой кишки. В частности, эндоскопии позволяет повторной оценки моделей лабораторных животных с течением времени, в отличие от традиционного гистологического исследования, что требует животному быть умерщвлены и двоеточие быть собраны для анализа ^1. Несмотря на эти преимущества, использование мышиного технологии эндоскопического не было широко распространено и ограничено отсутствием стандартных протоколов для implementatiна и озвучивание патологических. Правильно реализован, мышиный эндоскопии открывает большие перспективы для дальнейшего облегчения наше понимание и характеристика животных моделях множественными хроническими состояниями желудочно-кишечных заболеваний, в том числе воспалительных заболеваний кишечника, колита и колоректального опухолей.

Утилита мышиного эндоскопической техники петли после его воспроизводимости и объективности, который требует существование стандартизированных процедур экспертизы и последовательной, без резервирования, и надежную систему оценки для кишечных патологий. По меньшей мере три описательные системы баллов для эндоскопической оценки колита ^4-6, а также для толстой опухолей у мышей ^4,7,8 были опубликованы. Однако эти сообщенные подходы и скоринговые системы не являются легко сопоставимы в разных исследованиях. Во многих случаях нет четкого определения критериев, используемых для классификации поражений, и когда критерии приведены, они отличаются друг от друга. Кроме того,нет сообщалось системы скоринга, которые объединяют оценку как колит и опухолей, два из наиболее распространенных кишечных патологий, которые могут произойти одновременно и имеют интерактивные эффекты на исходе, в единый инструмент измерения. Наконец, эндоскопические системы скоринга, которые действительно существуют для колит часто имеют воспалительные категории с ограниченной дискриминации (т.е.. Узкие параметры скоринга на короткие целыми масштабах, часто 1-4), чтобы должным образом представляют сценарии прогрессирования заболевания и позволяющие использовать параметрического статистического анализа.

В данной работе мы описываем использование гибкого эндоскопа для оценки тяжести мышиного колит и толстой опухолей и описать стандартизированный протокол для использования этой технологии в анатомическом оценки перианальной области, прямой кишки и дистального отдела толстой кишки. Проиллюстрируем эффективное устранение неполадок при эндоскопии, чтобы минимизировать травмы и графические артефакты, и опишем воспроизводимую систему подсчета очковна основе проверенных опубликованных клинических параметров. Система подсчета очков интегрирует оценку как воспаления кишечника и опухолей с использованием высокий уровень дискриминации с 12 возможных сортов воспаления, отображение опухоли и построения вариантов, и нового блока десятичной системе (т.е. десятичные идентификаторы), чтобы выделить результаты с конкретной диагностической ценности ( т.е. развитие опухоли, осложнения во время эндоскопии и т.д.). Использование десятичных идентификаторов позволяет быстро отслеживания соответствующих наборов данных для дальнейшего нисходящего анализа. Наконец, мы выполняем надежность и тестирование действия системы скоринга в нескольких мышиных моделей колит и колит рака, ассоциированного с (декстран сульфат натрия (DSS), индуцированное-колит, Clostridium несговорчивый инфекции, и azoxymethane / DSS-индуцированной рака толстой).

протокол

1. Настройка Эндоскопия системы

1. Настройте систему эндоскопии до обезболивающее мышей, в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте видео уретероскопа предназначен для людей для этого протокола (рис. 1). Наружный диаметр вставной трубки составляет 9,9 Fr (3,3 мм), его дистальный конец составляет 8,5 Fr (2,8 мм), а внутренний диаметр измерительной канала 6 Fr (1,2 мм).
2. Хотя использование эндоскопов не были связаны с передачи заболеваний [9], стерилизовать эндоскоп и объектив с 70% этанола ¹⁰ или с соответствующими методами при работе с спорообразующих микроорганизмов. Приготовьтесь бактериостатическое стерильной смазки и не царапины протрите ткани того чтобы насытить подсказку эндоскопа.
3. Прикрепите шприц 3 мл, полный воздуха (или подходящий CO ₂ газовой смеси) к верхней части приборного канала.
4. Включите питание, и настроить баланс белого в нормальном белом свете,а также узким изображений полоса (НБР) режим, когда это применимо. С 2001 года НБР предоставил диагностические преимущества визуализации, как это подчеркивает тонкие структуры кровеносных сосудов на слизистые оболочки, в том числе язвенных и опухолевых поражений, которые имеют характерный ненормальное васкуляризации ^11. Режим НБР-фильтр ограничивает длину волны захваченного света 390-445 нм и 530-550 нм, в которой подчеркивается структур с гемоглобином.
5. Распечатать Количественная оценка форму (рис. 2), чтобы записать ваши выводы. Ознакомиться с ожидаемыми нормальными и НБР изображений (рис. 3А) и определения и сортов каждого критерия перед экзаменом (см. раздел 6.1).
6. Подготовка краситель на основе раствора на фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение хромоэндоскопии, если это необходимо. В хромоэндоскопии, экзамен проводится с использованием красителя, как контрастного вещества, чтобы выделить слизистых изменения. Используйте метиленовый синий (0,1-1%) и индиго кармин (0,1%) решения (рис. 3б). Примечаниечто метиленовый синий является агентом окислительно-восстановительный, которые могут производить окислительные радикалы, косвенное сшивание аминокислотных остатков и деградации ДНК ^12, которые могут повлиять на анализ пробы.

2. Общая анестезия Мыши

1. Выберите анестетика и способа введения. Проконсультируйтесь с ветеринаром из центра учета ресурсов животных или институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) относительно возможных помех лекарств с иммунной системой и исследовательских целей. Некоторые лекарства могут влиять на экспрессию цитокинов профиля в животных, в том числе грызунов ^13. Используйте инъекций tribromoethanol для терминальных процедур или изофлураном для эндоскопии выживания, наряду с соответствующим контролем.
2. Для индукции, администрирование 4-5% изофлуран в 100% кислорода со скоростью 0,2-0,5 л / мин; использовать 0,5-2% на техническое обслуживание. Этот протокол не подходит для всех животных. Обратитесь в ветеринаруза инструкциями и обучения. Соблюдать соответствующие рекомендации IACUC для достижения самых высоких стандартов защиты животных. Убедитесь в том, что мышь, если полностью под наркозом.
3. 'Ремень' под наркозом мыши к опорной поверхности стола в спинной или брюшной положение с помощью лабораторных клейкую ленту. Остерегайтесь анатомической ориентации на экране эндоскопа. Закрепите свои нижние конечности и хвост. Полоса ленты также могут быть размещены на груди, чтобы предотвратить движение от респиратора, но не ограничивать грудной движения вентиляционной.

3. Подробное эндоскопическое обследование

1. Ищите перианальных поражений, прежде чем вставлять эндоскоп в прямую кишку, затем перейти сферу через анус.
2. Пальто эндоскоп стерильной хирургической смазки. Убедитесь, что не покрывать поверхность ПЗС сенсора (прибор с зарядовой связью).
3. Вставьте эндоскоп и начните запись. Записанное видео можно использовать для мпри необходимости после осмотра eticulous оценка эндоскопии. Попробуйте провести эндоскопию в мере возможного промежутка времени, чтобы минимизировать кишечника / слизистой раздражение.
4. Применить воздух с помощью шприца медленно отделил стенки кишечника. В зависимости от размера мыши, использовать 1-2 мл воздуха. Избегайте чрезмерного вдувания воздуха; это может привести к дыхательной недостаточности и смерти анестезированной мыши.
5. Авансовые эндоскоп вперед, как вы расчистить путь воздухом или легким вращением сферы. Не продвижения эндоскопа, если вы не видите просвет кишечника. Перфорации или ректальные / толстой слезы может происходить на этой стадии, особенно в молодых мышей (<8-10 недель). Сфотографируйте по мере необходимости.
6. По мере развития сферы, оценить, если есть спонтанное кровотечение (определяется как естественным кровоизлияние слизистой не связано с травматической эндоскопии). Спонтанные кровотечения могут наблюдаться как эндоскоп входит прямой и толстой кишки.
7. КакSESS прозрачность кишечной стенки. Прозрачность определяется как способность визуализировать очной кровеносные сосуды в толстой кишке, и что из других близлежащих внутренних органов (рис. 4). Слабый движение рамки (назад-вперед, по часовой стрелке, против часовой стрелки) поможет определить, если кровеносные сосуды можно увидеть в контексте других внутренних органов. Брыжеечный жировой ткани может также рассматриваться. Помните, что если прямой кишки внутри полости малого таза кажется менее прозрачным, чем кишечной стенки в брюшную полость.
8. Проверьте, чтобы определить тип и количество очаговых поражений (отечные районов, эрозий, язв, опухолевых масс). Это будет записан в виде скоринга с использованием толстой счет воспаления и десятичные идентификаторы, которые были разработаны.
9. После того, как область, где двоеточие сгибает каудально в проксимальном отделе толстой кишки достигается, снять эндоскоп медленно и смотреть на наличие контакта кровотечения (которое происходит из-за слизистой рыхлость послеэндоскоп является передовой или удален). Это не обязательно, чтобы очистить поверхность толстой кишки намеренно. Здоровый колоректальный слизистая не кровоточит после тщательного осмотра эндоскопической.

4. Биопсия

1. При биопсии необходимы, вставьте щипцы биопсии через эндоскоп канала, выделенной для приборов. Контролировать продвижение пинцетом на экране эндоскопа для предотвращения перфорации кишечника.
2. Откройте биопсии чашек пинцетом до 60-80 ° чашки к чашке углом, и направить их в интересующей области. Чрезмерно открытые щипцы или давление может понять дополнительные слои ткани кишечника, что приводит к биопсии, вызванной перфорации здоровых прозрачных стенок кишечника. Если перфорация происходит, усыпить животное во время анестезии следующие ваших рекомендаций IACUC. Перфорация привести к эндотоксемии и перитонита.
3. Закройте биопсии чашки, и вытащить их, сохраняя при этом щипцы закрыты.
4. Ремове образца из щипцов с помощью промывки ткани раствором, приятный для ткани и пинцетом. РНК позже и PBS общие рабочие растворы; при необходимости, использовать иглу, чтобы выбить образца. Избегайте подрывает Forcep чашки или режущих кромок.

5. Восстановление после анестезии

1. После завершения экспертизы, обеспечить теплую среду для мыши, пока он не выздоровеет. Используйте либо электрический свет или тепло колодки для при 37 ° С Избегайте перегрева; периферическая вазодилатация компромиссы восстановление животных. не Монитор мыши тесно до полного выздоровления.

6. Интегрированный Эндоскопическая система оценки колоректального здравоохранения с десятичной идентификаторов

1. Используйте голевой форму (рис. 2) и определения параметров ниже (эндоскопической оценки мышиной колоректального Воспаление и опухолей с помощью десятичной-взвешенный система подсчета очков: определения параметров и протокол) дляпримеры и дополнительный "Дистальная-Проксимальный Эндоскопическая колит забив система '(Д-УИК) в качестве руководства для nonbiased оценки и детального учета.
2. Оценка четыре параметры колоректального воспаления, описанные на скоринг системы виде (рис. 2). Тщательно оценить перианальной области, кишечные прозрачность, тип кишечное кровотечение (если есть), а наличие и количество очаговых поражений (эрозивно, язвенный, и / или опухолевой).
3. При оценке опухолей в исследовательских целях, изучить количество, расположение и размер, и описать их с помощью толстой карту и гистограмму на форме выигрыше. Численное сумму баллов, полученных и число поражений (когда применимо) будет определять фона толстой воспаление, наиболее преобладающим типом поражения, и количество поражений.

Результаты

Протокол и изображения представлены в данном исследовании были подготовлены с Olympus СПС-V гибким эндоскопом ¹⁴ и НБР ^11,15. Видео изображения были сохранены в формате MPEG-2 и фотографии в формате JPG, TIF, PNG, или в формате DICOM с максимальными 1280 х 1024 пикселей, передаваемых со стандартны...

Обсуждение

Есть несколько соображений относительно модификации и поиска неисправностей в эндоскопической техники у мышей. Критические аспекты процедуры, которые должны быть освоены в ходе использования гибкой эндоскопии включают регулировку объема воздуха, необходимого для предотвращения вз...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System