La colonscopia flessibile in topi per valutare la gravità della colite e colon-retto Tumori Utilizzo di un sistema Validated endoscopica Scoring

Riepilogo

Negli ultimi anni, endoscopi di nuova generazione sono emersi come importanti ausili di ricerca diagnostici per la valutazione colite murina e tumori colorettali. Presentiamo qui un protocollo dettagliato per la valutazione endoscopica di infiammazione e tumori colorettali nei topi, nonché un sistema di punteggio romanzo che utilizza gli identificatori decimali per documentare la gravità endoscopica di colite e tumori colorettali.

Abstract

L'uso della moderna endoscopia per scopi di ricerca ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di patologie gastrointestinali. In particolare, l'endoscopia sperimentale è stato molto utile per gli studi che richiedono valutazioni ripetute in un singolo animale da laboratorio, come quelli valutazione dei meccanismi di malattia intestinale infiammatoria cronica e la progressione del tumore colorettale. Tuttavia, i metodi utilizzati negli studi sono molto variabili. Almeno tre sistemi di punteggio endoscopici sono stati pubblicati per la colite murina e pubblicato protocolli per la valutazione dei tumori colorettali non tengono conto della presenza di concomitante infiammazione del colon. Questo studio sviluppa e convalida un sistema riproducibile punteggio endoscopico che integra valutazione sia infiammazione e tumori simultaneamente. Questo nuovo sistema di punteggio ha tre componenti principali: 1) la valutazione della portata e della gravità di infiammazione del colon-retto (basata sui risultati perianali, la trasparenza del wall, sanguinamento delle mucose e lesioni focali), 2) la registrazione quantitativa delle lesioni tumorali (sugli rete e grafico a barre), e 3) ordinamento numerico di casi clinici per la loro rilevanza patologica e la ricerca basata su unità decimali con categorie assegnate delle lesioni osservate e complicanze endoscopiche (identificatori decimali). Il video e manoscritto qui presentati sono stati preparati, seguendo protocolli IACUC approvati, per permettere agli investigatori di segnare i propri topi sperimentali utilizzando una metodologia endoscopica ben validato e altamente riproducibile, con l'opzione di sistema per differenziare distale di colite endoscopico prossimale (D-PECS ).

Introduzione

Endoscopia murino è stato eseguito come strumento di ricerca utile per oltre un decennio ^1-3. Ad oggi, la maggior parte degli studi che impiegano endoscopia murini hanno utilizzato endoscopi rigidi, anche se alcuni hanno anche utilizzato sigmoidoscopia flessibile. Endoscopia murini offre risultati immediati e una valutazione più oggettiva del grado di normalità intestinale, la gravità dell'infiammazione, e la progressione del tumore rispetto alle misure indirette, come la perdita di peso corporeo, diarrea, e istologia (che è ottimale quando le lesioni sono di leopardo), mentre offrendo approfondimenti sulla salute generale del colon. Più in particolare, l'endoscopia permette di valutare ripetuto di modelli animali di laboratorio nel tempo, al contrario di esame istologico tradizionale che richiede l'animale essere eutanasia e due punti per essere raccolti per analisi ^1. Nonostante questi vantaggi, l'uso della tecnologia endoscopica murino non e 'stato diffuso ed è limitata dalla mancanza di protocolli standardizzati per implementatisu e il punteggio di reperti patologici. Correttamente attuato, endoscopia murino rappresenta una grande promessa per facilitare ulteriormente la nostra comprensione e caratterizzazione di modelli animali di molteplici stati di malattia croniche gastrointestinali, comprese le malattie infiammatorie croniche intestinali, colite, e tumori del colon-retto.

L'utilità della tecnologia endoscopica murino dipende dalla sua riproducibilità e oggettività, che richiede l'esistenza di procedure standardizzate di esame e di un sistema di punteggio consistente, non ridondante, affidabile per patologie intestinali. Almeno tre sistemi di punteggio descrittivi per la valutazione endoscopica di colite ^4-6, e anche per i tumori del colon ^4,7,8 in topi sono stati pubblicati. Tuttavia, questi approcci segnalati e sistemi di punteggio non sono facilmente comparabili tra gli studi. In molti casi, non esiste una definizione chiara dei criteri utilizzati per la classificazione delle lesioni, e quando i criteri sono indicati, essi variano ampiamente. Inoltre,non esistono sistemi di punteggio riferito che integrano la valutazione sia di colite e tumori, due delle patologie del colon più comuni che possono verificarsi contemporaneamente e avere effetti interattivi sul risultato, in un unico strumento di misurazione. Infine, i sistemi di scoring endoscopici che esistono per la colite hanno spesso categorie infiammatorie con la discriminazione limitati (ad esempio. Opzioni strette di punteggio su scale interi brevi, spesso 1-4) per rappresentare correttamente la malattia scenari progressione e consentire l'uso di analisi statistica parametrica.

In questo documento, si descrive l'utilizzo di un endoscopio flessibile per valutare la gravità della colite murina e tumori del colon e descrivere un protocollo standardizzato per impiegare questa tecnologia nella valutazione anatomica della regione perianale, del retto e colon distale. Illustriamo la risoluzione dei problemi efficace durante l'endoscopia per ridurre al minimo trauma e di immagine manufatti, e si descrive un sistema di punteggio riproducibilebasato su parametri clinici pubblicati validate. Il sistema di punteggio integra valutazione sia infiammazione intestinale e tumori con un elevato livello di discriminazione con 12 possibili gradi di infiammazione, mappatura tumore e opzioni di rilevamento, e un sistema di unità decimale romanzo (cioè identificatori decimali) per evidenziare risultati con valore diagnostico specifico ( vale a dire lo sviluppo del tumore, complicazioni durante l'endoscopia, ecc.) L'uso di identificatori decimali consente un rapido monitoraggio dei set di dati rilevanti per ulteriori analisi a valle. Infine, eseguiamo affidabilità e test validità del sistema di punteggio in diversi modelli murini di colite e colite cancro-associata (destrano solfato sodico (DSS)-indotta colite, infezione da Clostridium difficile, e azoxymethane / DSS-indotta cancro del colon).

Protocollo

1. Impostazione del sistema Endoscopia

1. Impostare il sistema di endoscopia prima di anestetizzare i topi, seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare un ureteroscopio video progettato per gli esseri umani di questo protocollo (Figura 1). Il diametro esterno del tubo di inserimento è 9,9 Fr (3,3 mm), la sua estremità distale è 8,5 Fr (2,8 mm), e il diametro interno del canale strumentazione è 6 Fr (1,2 mm).
2. Sebbene l'uso di endoscopi non sono stati collegati a trasmissione di malattie [9], sterilizzare l'endoscopio e lente con etanolo al 70% o ¹⁰ con tecniche appropriate quando si lavora con microrganismi sporigeni. Preparare batteriostatico lubrificante sterile e non graffiare pulire i tessuti per saturare la punta dell'endoscopio.
3. Attaccare una siringa da 3 ml pieno di aria (o una miscela di gas CO ₂ adatto) all'inizio del canale strumentazione.
4. Accendere l'alimentazione e impostare il bilanciamento del bianco in normale luce bianca,Modalità nonché stretta fascia di imaging (NBI), ove applicabile. Dal 2001, NBI ha fornito prestazioni di diagnostica per immagini, come sottolinea sottili strutture dei vasi sanguigni sulle membrane mucose, tra cui lesioni ulcerative e tumorali, che hanno caratteristiche vascolarizzazione anormale ^11. Modalità NBI-filtro limita la lunghezza d'onda della luce catturata a 390-445 nm e 530-550 nm, che mette in luce le strutture con l'emoglobina.
5. Stampare il modulo di valutazione di punteggio (Figura 2) per registrare i vostri risultati. Acquisire familiarità con le immagini attesi normali e NBI (Figura 3a) e la definizione e qualità di ogni criterio prima dell'esame (vedi Sezione 6.1).
6. Preparare una soluzione basata colorante-on tampone fosfato salino (PBS) per chromoendoscopy, se desiderato. In chromoendoscopy, l'esame viene eseguito utilizzando un colorante come mezzo di contrasto per evidenziare i cambiamenti della mucosa. Usare blu di metilene (0,1-1%) e soluzioni di indaco carminio (0,1%) (Figura 3B). Appuntoblu di metilene che è un agente di ossidazione-riduzione che può produrre radicali ossidanti, reticolazione indiretta di residui amminoacidici, e la degradazione del DNA ^12, che potrebbero interferire con l'analisi del campione.

2. Anestesia generale del mouse

1. Scegliere il percorso agente e la somministrazione di anestetici. Consultare un veterinario di una struttura risorsa animale o Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (IACUC) per quanto riguarda possibili interferenze dei farmaci con il sistema immunitario e gli obiettivi della ricerca. Alcuni farmaci possono influenzare il profilo delle citochine espressione in animali, tra cui roditori ^13. Utilizzare tribromoethanol iniettabile per le procedure di terminali o isoflurano per endoscopie sopravvivenza, insieme a controlli appropriati.
2. Per l'induzione, somministrare 4-5% di isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di 0,2-0,5 L / min; utilizzare 0,5-2% per la manutenzione. Questo protocollo non è appropriato per tutti gli animali. Consultare il veterinario strutturaper le istruzioni corrette e la formazione. Rispettare le raccomandazioni pertinenti IACUC per raggiungere i più alti standard di benessere degli animali. Assicurarsi che il mouse, se completamente anestetizzato.
3. 'Strap' il topo anestetizzato ad un tavolo superficie di appoggio in una dorsale o posizione ventrale con del nastro adesivo di laboratorio. Attenzione l'orientamento anatomico sul vostro schermo endoscopio. Fissare le estremità inferiori e coda. Una banda di nastro può anche essere posizionato sul petto per impedire il movimento lontano dal respiratore, ma evitare di limitare i movimenti respiratori toracici.

3. Dettagliata endoscopica esame

1. Ricerca lesioni perianali prima di inserire l'endoscopio nel retto, poi avanzare la portata attraverso l'ano.
2. Cappotto l'endoscopio con lubrificante sterile chirurgica. Assicuratevi di non rivestire la superficie del CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) del sensore.
3. Inserire l'endoscopio e avviare la registrazione. I video registrati sono utili per mla valutazione eticulous dell'endoscopia se necessario dopo l'esame. Provare a eseguire l'endoscopia nel minor possibile durata del ridurre al minimo l'irritazione intestinale / mucosa.
4. Applicare aria usando una siringa per impostare lentamente a parte le pareti intestinali. A seconda delle dimensioni del mouse, usare 1-2 ml di aria. Evitare l'eccessiva insufflazione di aria, può causare difficoltà respiratorie e la morte del topo anestetizzato.
5. Far avanzare l'endoscopio avanti come si cancella il modo con aria o la rotazione dolce del campo di applicazione. Non far avanzare l'endoscopio se non si vede lume intestinale. Perforazioni o lacerazioni rettali / colon possono verificarsi in questa fase, soprattutto in topi giovani (<8-10 settimane di età). Scattare foto come necessario.
6. Poiché la portata avanza, valutare se vi è sanguinamento spontaneo (definito come in natura mucosa emorragia non associata a endoscopia traumatico). Sanguinamento spontaneo può osservare come l'endoscopio entra nel retto e del colon.
7. ComeSess la trasparenza della parete del colon. La trasparenza è definita come la capacità di visualizzare i vasi sanguigni intramurali nel colon e quella degli altri visceri circostanti (Figura 4). Dolce movimento del campo di applicazione (back-forward, in senso orario, antiorario) contribuirà a determinare se i vasi sanguigni può essere visto nel contesto di altri visceri. Tessuto adiposo mesenterico può anche essere visto. Nota se il retto all'interno della cavità pelvica appare meno trasparente rispetto alla parete del colon nella cavità addominale.
8. Controllare per determinare il tipo e il numero di lesioni focali (aree edematose, erosioni, ulcere, masse tumorali). Questo verrà registrato nella forma di punteggio con il punteggio di infiammazione del colon e gli identificatori decimali che sono stati sviluppati.
9. Una volta che la zona in cui il colon flette caudalmente nel colon prossimale viene raggiunto, ritirare l'endoscopio lentamente e cercare la presenza di contatto sanguinamento (che si verifica a causa di friabilità della mucosa dopo l'endoscopio è avanzato o rimosso). Non è necessario raschiare la superficie colon intenzionalmente. Healthy mucosa del colon-retto non sanguina dopo un esame endoscopico corretta.

4. Biopsia

1. Quando sono necessarie biopsie, inserire le pinze biopsia attraverso il canale dell'endoscopio dedicato per la strumentazione. Monitorare l'avanzamento della pinza sullo schermo endoscopio per evitare perforazione intestinale.
2. Aprire le tazze biopsia della pinza a circa 60-80 ° angolo tazza al bicchiere, e dirigerli verso la zona di interesse. Forcipe o pressione eccessivamente aperti possono comprendere strati supplementari di tessuto intestinale, che si traduce in una perforazione biopsia indotta delle pareti intestinali trasparenti sani. Se si verifica la perforazione, eutanasia dell'animale durante l'anestesia con le raccomandazioni IACUC. Perforazioni comportano dell'endotossemia e peritonite.
3. Chiudere le coppe biopsia, e tirarli fuori mantenendo le pinze chiuse.
4. Remove il campione dal forcipe dal lavaggio del tessuto con una soluzione che è delicato per il tessuto e le pinze. RNA tardi e PBS sono soluzioni di lavoro comuni, se necessario, utilizzare l'ago per rimuovere il campione. Evitare erodendo le tazze forcep o taglienti.

5. Recupero da anestesia

1. Al termine dell'esame, fornire un ambiente caldo al mouse finché non recupera. Utilizzare una luce elettrica, o un pad calda a 37 ° C. Evitare il surriscaldamento; vasodilatazione periferica compromette il recupero degli animali. Monitorare il mouse vicino fino al completo recupero.

6. Integrato endoscopica Scoring System of Colorectal Salute con decimali identificatori

1. Utilizza il modulo di punteggio (Figura 2) e le definizioni dei parametri sottostanti (valutazione endoscopica del colon-retto murini infiammazione e tumori utilizzo di un sistema di punteggio decimale ponderato: parametri definizioni, e il protocollo) peresempi e opzionale 'sistema di punteggio distale-prossimale endoscopica Colite' (D-PECS) come linee guida per la valutazione nonbiased e dettagliata tenuta dei registri.
2. Segnare i quattro parametri di infiammazione colorettale descritti nel modulo sistema di punteggio (Figura 2). Meticolosamente valutare la regione perianale, trasparenza intestinale, tipo di sanguinamento intestinale (se presente), e la presenza e la quantità di lesioni focali (erosiva, ulcerativa, e / o tumorale).
3. Nel valutare i tumori per scopi di ricerca, di esaminare la quantità, la posizione e le dimensioni, e descriverli utilizzando la mappa del colon e grafico a barre sul modulo di punteggio. La somma numerica dei punteggi ottenuti ed il numero di lesioni (se del caso) determinerà sfondo infiammazione del colon, il tipo più predominante di lesione, e il numero di lesioni.

Risultati

Il protocollo e le immagini presentate in questo studio sono stati preparati con una Olympus URF-V endoscopio flessibile ¹⁴ e NBI ^11,15. Le immagini video sono state salvate in formato MPEG-2 e le immagini in formato JPG, TIF, PNG, o in formato DICOM con un massimo di 1.280 x 1.024 pixel, valori di memorie portatili USB flash standard. NBI aumenta il contrasto visivo dei tessuti-emoglobina contiene. Luce normale e di imaging NBI sono caratteristiche fondamentali per illustrare l'anatomia normal...

Discussione

Ci sono diverse considerazioni per quanto riguarda la modifica e la risoluzione dei problemi della tecnica endoscopica nei topi. Aspetti critici della procedura che deve essere padroneggiato durante l'uso di endoscopia flessibile includono la regolazione del volume d'aria necessario per prevenire distensione addominale e compromissione respiratoria del mouse, e gli aspetti tecnici minori del controllo della vista con il coordinamento dei controlli angolazione e di coppia . Controllo di coppia è importante ridur...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System