A colonoscopia flexível em camundongos para avaliar a gravidade da colite e colorretal Tumores Usando um sistema validado endoscópica Scoring

Resumo

Ao longo dos últimos anos, novas endoscópios geração surgiram como importantes auxiliares de pesquisa de diagnóstico para a avaliação de colite murina e tumores colorectais. Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a avaliação endoscópica de inflamação e tumores colo-rectal em ratos, bem como um novo sistema de pontuação que utiliza identificadores decimais para documentar a gravidade endoscópico de colite e tumores colorectais.

Resumo

O uso da endoscopia moderna para fins de pesquisa facilitou enormemente a nossa compreensão de patologias gastrointestinais. Em particular, a endoscopia experimental tem sido muito útil para estudos que requerem avaliações repetidas em um único animal de laboratório, tais como os mecanismos de avaliação de doença inflamatória intestinal crônica ea progressão do câncer colorretal. No entanto, os métodos utilizados em todos os estudos são altamente variáveis. Pelo menos três sistemas de pontuação endoscópicos foram publicadas para a colite murina e publicado protocolos para a avaliação dos tumores colorretais não conseguem resolver a presença de inflamação do cólon concomitante. Este estudo desenvolve e valida um sistema de pontuação endoscópica reprodutível que integra a avaliação de inflamação e tumores simultaneamente. Este novo sistema de pontuação tem três componentes principais: 1) avaliação da extensão e da gravidade da inflamação colorectal (baseado em achados perianal, a transparência do wall, sangramento das mucosas e lesões focais), 2) a gravação quantitativa de lesões tumorais (mapa de grade e gráfico de barras), e 3) a classificação numérica de casos clínicos por sua relevância patológica e de investigação com base em unidades decimais com categorias atribuídas de lesões observadas e complicações endoscópicas (identificadores decimais). Foram preparadas O vídeo eo manuscrito aqui apresentada, seguindo protocolos IACUC-aprovados, para permitir que os investigadores para marcar os seus próprios camundongos experimentais usando uma metodologia endoscópica bem validada e altamente reprodutível, com a opção de sistema para diferenciar distal de colite endoscópica proximal (D-PECS ).

Introdução

Endoscopia de murino foi realizada como uma ferramenta de pesquisa útil para mais de uma década ^1-3. Até o momento, a maioria dos estudos que empregam endoscopia murino têm utilizado endoscópios rígidos, embora alguns também têm usado a sigmoidoscopia flexível. Endoscopia Murino proporciona resultados imediatos e uma estimativa mais objetiva da extensão da normalidade intestinal, a gravidade da inflamação e progressão do tumor em comparação com medidas indiretas, tais como perda de peso, diarréia e histologia (que é abaixo do ideal quando as lesões são irregulares), enquanto oferecendo insights sobre a saúde geral do cólon. Mais notavelmente, a endoscopia permite uma avaliação repetida de modelos animais de laboratório ao longo do tempo, em oposição ao exame histológico tradicional que exige que o animal ser sacrificado e de dois pontos a ser colhido para análise ^1. Apesar destas vantagens, a utilização de tecnologia endoscópica murino não foi generalizada e é limitada pela falta de protocolos padronizados de implementatiem e pontuação de achados patológicos. Devidamente implementado, endoscopia murino é uma grande promessa para facilitar ainda mais a nossa compreensão e caracterização de modelos animais de vários estados de doença gastrointestinais crônicas, incluindo doenças inflamatórias intestinais, colite, e tumores colorretais.

A utilidade da tecnologia endoscópica murino dobradiças em cima de sua reprodutibilidade e objetividade, o que requer a existência de procedimentos de análise padronizados e um sistema de pontuação consistente, não redundante e confiável para patologias intestinais. Pelo menos três sistemas de pontuação descritivo para a avaliação endoscópica de colite ^4-6, bem como para os tumores do cólon em ratinhos ^4,7,8 foram publicados. No entanto, estas abordagens relatados e sistemas de pontuação não são facilmente comparáveis ​​entre os estudos. Em muitos casos, não existe uma definição clara dos critérios utilizados para a classificação das lesões, e quando os critérios são dados, eles variam muito. Além disso,não existem sistemas de pontuação relataram que integram a avaliação de ambos colite e tumores, duas das patologias do cólon mais comuns que podem ocorrer simultaneamente e têm efeitos interativos sobre o resultado, em uma única ferramenta de medição. Por fim, os sistemas de pontuação endoscópicos que existem para a colite têm frequentemente categorias inflamatórios com discriminação limitada (ie. Opções estreitas de pontuação em escalas de inteiros curtos, muitas vezes 1-4) para representar adequadamente os cenários progressão da doença e permitem o uso de análise estatística paramétrica.

Neste trabalho, descreve-se o uso de um endoscópio flexível para avaliar a gravidade da colite murina e tumores do cólon e descrever um protocolo padronizado para empregar esta tecnologia na avaliação anatômica da região perianal, reto e cólon distal. Nós ilustramos solução de problemas eficaz durante a endoscopia para minimizar traumas e artefatos de imagem, e descrevemos um sistema de pontuação reprodutívelcom base nos parâmetros clínicos publicados validados. O sistema de pontuação integra avaliação tanto a inflamação intestinal e tumores utilizando um elevado nível de discriminação com 12 possíveis graus de inflamação, o mapeamento do tumor e as opções de traço, e um novo sistema de unidade decimal (isto é, os identificadores decimais) para destacar resultados com valor de diagnóstico específico ( ou seja, o desenvolvimento de tumores, complicações durante a endoscopia, etc.) A utilização de identificadores decimais permite monitoramento rápido de conjuntos de dados relevantes para uma análise mais aprofundada a jusante. Finalmente, realizamos testes de confiabilidade e do sistema de pontuação validade em vários modelos murinos de colite e câncer associado-colite (dextran sulfato de sódio (DSS), colite induzida, infecção Clostridium difficile, e azoximetano / câncer do cólon induzida por DSS).

Protocolo

1. Configuração do Sistema de Endoscopia

1. Configure o sistema de endoscopia antes de anestesiar os ratos, seguindo as instruções do fabricante. Use um ureteroscope vídeo projetado para os seres humanos para este protocolo (Figura 1). O diâmetro externo do tubo de inserção é de 9,9 Fr (3,3 mm), a sua extremidade distal é de 8,5 Fr (2,8 mm), e o diâmetro interno do canal de instrumentação é 6 Fr (1,2 mm).
2. Embora o uso de endoscópios não têm sido associados a transmissão da doença [9], esterilizar a lente do endoscópio e com etanol a 70% ou ¹⁰ com técnicas adequadas quando se trabalha com microorganismos que formam esporos. Prepare lubrificante estéril bacteriostática e não coçar limpar tecidos para saturar a ponta do endoscópio.
3. Anexar uma seringa de 3 ml cheio de ar (ou de uma mistura de gases adequados CO ₂₎ para a parte superior do canal de instrumentação.
4. Ligue o aparelho e configurar o balanço de branco em luz branca normal,modo, assim como estreita banda de imagem (NBI), quando aplicável. Desde 2001, a NBI tem proporcionado benefícios de diagnóstico por imagem, uma vez que enfatiza estruturas dos vasos sanguíneos finos nas membranas mucosas, incluindo lesões ulcerativas e tumorais, que têm característica vascularização anormal ^11. Modo NBI-filtro restringe o comprimento de onda da luz captada para 390-445 nm e 530-550 nm, que destaca as estruturas com a hemoglobina.
5. Imprimir o formulário de pontuação de avaliação (Figura 2) para registrar suas descobertas. Familiarize-se com as imagens normais e esperados NBI (Figura 3A) ea definição e graus de cada critério antes do exame (ver Secção 6.1).
6. Prepara-se uma solução à base de corante em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para cromoendoscopia, se desejado. Em cromoendoscopia, o exame é realizado utilizando um corante como meio de contraste para realçar as alterações da mucosa. Use azul de metileno (0,1-1%) e indigotina (0,1%) soluções (Figura 3B). Notaque o azul de metileno é um agente de oxidação-redução, que pode produzir radicais oxidantes, reticulação indirecta de resíduos de aminoácidos e degradação de ADN ^{de 12,} o que poderia interferir com a análise de uma amostra.

2. Anestesia Geral do Rato

1. Escolher o agente e via de administração do anestésico. Consulte um veterinário de uma facilidade de recursos animais ou Animal Care e Use Institucional Committee (IACUC) sobre a possibilidade de interferências de medicamentos com o sistema imunológico e os objetivos da pesquisa. Alguns medicamentos podem influenciar a expressão do perfil de citocinas em animais, incluindo roedores ^13. Use tribromoetanol injetável para procedimentos terminais ou isoflurano para endoscopias sobrevivência, junto com controles adequados.
2. Por indução, administrar 4-5% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 0,2-0,5 L / min; usar 0,5-2% para manutenção. Este protocolo não é apropriado para todos os animais. Consulte seu veterinário facilidadepara instruções e treinamento adequados. Agir de acordo com as recomendações pertinentes IACUC para alcançar os mais altos padrões de bem-estar animal. Certifique-se de que o mouse se totalmente anestesiado.
3. "Strap" o rato anestesiado para uma mesa em uma superfície de apoio dorsal ou posição ventral com fita adesiva laboratório. Cuidado com a orientação anatômica na tela endoscópio. Proteja suas extremidades e cauda inferiores. A banda de fita também pode ser colocado sobre o peito para evitar o movimento para longe do respirador, mas evite restringir movimentos ventilatórios torácicas.

3. Endoscópica exame detalhado

1. Procure lesões perianais antes de introduzir o endoscópio no reto, em seguida, avançar o escopo através do ânus.
2. Brasão do endoscópio com lubrificante cirúrgico estéril. Não se esqueça de revestir a superfície do CCD (Charge Coupled Device) sensor.
3. Insira o endoscópio e iniciar a gravação. Os vídeos gravados são úteis para mavaliação eticulous da endoscopia, se necessário após o exame. Tente realizar a endoscopia no menor período de tempo possível para minimizar a irritação intestinal / mucosa.
4. Aplicar ar usando uma seringa para definir lentamente para além das paredes intestinais. Dependendo do tamanho do animal, usar 1-2 ml de ar. Evite insuflação de ar excessiva, que pode causar dificuldade respiratória e morte do rato anestesiado.
5. Avançar o endoscópio para a frente como você limpar o caminho com o ar ou a rotação suave do escopo. Não avance o endoscópio, se você não ver a luz intestinal. Perfurações ou lágrimas reto / cólon pode ocorrer nesta fase, especialmente em ratos jovens (<8-10 semanas de idade). Tire fotos, se necessário.
6. Como o escopo avanços, avaliar se há sangramento espontâneo (definido como natural hemorragia mucosa não associados a endoscopia traumático). Hemorragia espontânea pode ser observada quando o endoscópio entra no recto e cólon.
7. ComoSess a transparência da parede do cólon. A transparência é definido como a capacidade de visualizar os vasos sanguíneos intramurais no cólon e que das outras vísceras circundantes (Figura 4). Movimento suave do escopo (back-frente, no sentido horário, anti-horário) vai ajudar a determinar se os vasos sanguíneos pode ser visto no contexto de outras vísceras. Tecido adiposo mesentérica pode também ser visto. Nota se no recto para dentro da cavidade pélvica parece menos transparente do que a parede do cólon na cavidade abdominal.
8. Inspecione para determinar o tipo e número de lesões focais (áreas edematosas, erosões, úlceras, massas tumorais). Este será gravado na forma de pontuação pelo escore inflamação do cólon e os identificadores de decimais que têm sido desenvolvidos.
9. Uma vez que a área onde o cólon flexiona caudal no cólon proximal é atingido, retirar o endoscópio lentamente e procure a presença de hemorragia de contacto (que ocorre devido a mucosa após a friabilidadeendoscópio é avançado ou removido). Não é necessário para raspar a superfície do cólon intencionalmente. Mucosa colorectal saudável não sangra após exame endoscópico adequado.

4. Biopsia

1. Quando são necessárias biópsias, insira a pinça de biópsia através do canal endoscópio dedicado para instrumentação. Monitorar o avanço da pinça na tela do endoscópio para evitar perfuração intestinal.
2. Abra os copos de biópsia da pinça a cerca de um ângulo de copo para copo de 60-80 °, e dirigi-los para a área de interesse. Fórceps ou pressão excessivamente abertas pode compreender camadas adicionais de tecido intestinal, o que resulta numa perfuração induzida por biópsia de paredes intestinais transparentes saudáveis. Se ocorrer perfuração, a eutanásia do animal durante a anestesia seguindo suas recomendações IACUC. Perfurações resultar em endotoxemia e peritonite.
3. Feche os copos de biópsia, e retirá-los, mantendo a pinça fechada.
4. Remove a amostra de a pinça, através de lavagem do tecido com uma solução que é suave para o tecido e a pinça. ARN posterior e PBS são soluções de trabalho comuns, e se necessário, usar a agulha para retirar a amostra. Evite corroendo os copos de fórceps ou arestas cortantes.

5. A recuperação da anestesia

1. Após a conclusão do exame, proporcionar um ambiente acolhedor para o mouse até que ele se recupere. Utilize uma luz elétrica, ou uma almofada quente fixada em 37 ° C. Evitar o sobreaquecimento; vasodilatação periférica compromete a recuperação dos animais. Monitorar o mouse perto até a recuperação completa.

6. Integrado Scoring System endoscópica de colorretal Saúde com decimais Identifiers

1. Utilize o formulário de pontuação (Figura 2) e as definições de parâmetros abaixo (Avaliação endoscópica de Murino colorretal Inflamação e Tumores Usando um sistema decimal ponderada pontuação: Definições dos parâmetros e Protocol) paraexemplos e "sistema distal-proximal endoscópica Colite marcando 'opcional (D-PECS) como diretrizes para avaliação nonbiased e manutenção de registros detalhados.
2. Marque os quatro parâmetros de inflamação colorectal descritos no formulário sistema de pontuação (Figura 2). Meticulosamente avaliar a região perianal, a transparência intestinal, tipo de sangramento intestinal (se houver), e presença e quantidade de lesões focais (erosiva, ulcerosa, e / ou tumoral).
3. Ao avaliar tumores para fins de pesquisa, analisar a quantidade, localização e tamanho, e descrevê-los usando o mapa do cólon e gráfico de barras no formulário de pontuação. A soma numérica das pontuações obtidas e número de lesões (quando aplicável) irá determinar o fundo inflamação do cólon, o tipo mais predominante de lesão, e do número de lesões.

Resultados

O protocolo e as imagens apresentadas neste estudo foram preparadas com um endoscópio flexível Olympus URF-V ¹⁴ e NBI ^11,15. As imagens de vídeo foram salvas em formato e de imagens em JPG, TIF, PNG ou formato DICOM com o máximo de 1280 x 1024 pixels, transferíveis para memórias Flash portátil USB padrão MPEG-2. NBI aumenta o contraste visual dos tecidos que contêm hemoglobina. A luz normal e NBI imagens são características fundamentais para ilustrar a anatomia normal da mucosa retal e a...

Discussão

Há várias considerações sobre modificação e solução de problemas da técnica endoscópica em camundongos. Aspectos críticos do procedimento que precisa ser dominado durante o uso da endoscopia flexível incluem o ajuste do volume de ar necessário para evitar a distensão abdominal e comprometimento respiratório do rato, e os aspectos técnicos menores de controle de exibição com a coordenação dos controles de angulação e torque . Controle de torque é importante para minimizar o risco de perfuração in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System