검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

요약

지난 몇 년 동안, 새로운 세대의 내시경은 쥐 대장염과 대장 종양을 평가하기위한 중요한 진단 연구 보조로 등장했습니다. 우리는 생쥐의 염증과 대장 종양의 내시경 적 평가뿐만 아니라 대장염과 대장 종양의 내시경 심각도를 문서화하는 진수 식별자를 사용하는 새로운 채점 시스템에 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

초록

연구 목적 현대 내시경의 사용은 크게 위장 병리에 대한 우리의 이해를 촉진했다. 특히, 실험 내시경은 만성 염증성 장 질환의 메커니즘과 대장 암의 진행을 평가하는 것과 같은 하나의 실험 동물에서 반복 평가를 필요로 연구에 매우 유용합니다. 그러나, 연구를 통해 사용 방법은 매우 다양하다. 적어도 세 내시경 채점 시스템은 쥐 대장염에 대해 게시 및 대장 종양의 평가를위한 프로토콜이 수반 대장 염증의 존재를 해결하기 위해 실패 출판되었습니다. 이 연구는 개발과 동시에 염증과 종양 모두의 평가를 통합하는 재생 가능한 내시경 채점 시스템의 유효성을 검사합니다. 항문 주위 결과에 따라 대장 염증의 정도와 심각도 1) 평가 (월마트의 투명성이 새로운 채점 시스템은 세 가지 주요 구성 요소가 있습니다L, 점막 출혈 및 국소 병변), 2) 종양 병변 (격자지도와 막대 그래프), 관찰 병변의 할당 된 범주와 소수점 단위를 기준으로 자신의 병리학 및 연구 관련하여 임상 사례 3) 숫자 정렬의 양적 기록 내시경 합병증 (진수 식별자). 여기에 제공된 영상과 원고는 수사관이 인접 내시경 대장염 (D-근육에서 원심을 차별화 할 수있는 시스템 옵션을 사용하여, 잘 확인하고 재현성 내시경 방법을 사용하여 자신의 실험 쥐를 득점 할 수 있도록, IACUC 승인 된 프로토콜에 따라 제조 하였다 ).

서문

쥐 내시경을 통해 ^1-3 년을위한 유용한 연구 도구로 수행되었습니다. 일부는 S 상 결장경을 사용하고 있지만 지금까지 쥐 내시경을 사용하는 대부분의 연구는, 딱딱한 내시경을 사용했습니다. 뮤린 내시경 즉각적인 결과를 제공하고 장내 정상, 염증의 중증도, 이러한 체중 감소, 설사 및 조직학 간접 측정, (병변 누덕 때 차선이다)에 비해 종양의 진행의 정도를 객관적 추정하면서 결장의 전반적인 건강에 대한 통찰력을 제공. 안락사하고 콜론 분석 ^1을위한 수확하는 동물을 필요로 기존의 조직 학적 검사에 반대 특히, 내시경 검사는 시간이 지남에 따라 실험 동물 모델의 반복 평가를 할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고, 뮤린 내시경 기술의 광범위한 사용은 불가능했습니다 implementati 및 표준화 된 프로토콜의 부족에 의해 제한된다에 대한 병리학 적 연구 결과의 점수. 제대로 구현, 쥐 내시경 검사는 더 이상 우리의 이해와 염증성 장 질환, 대장염, 대장 종양을 포함한 여러 만성 위장 질환 상태의 동물 모델의 특성을 용이하게하기 위해 큰 약속을 보유하고 있습니다.

쥐 내시경 기술의 유틸리티는 표준화 된 시험 절차의 존재와 장 병리에 대한 일관성, 비 중복 및 신뢰성 평가 시스템이 필요 재현성 및 객관성에 달려있다. 적어도 세 가지 설명 득점 대장염 ^4-6의 내시경 평가를위한 시스템뿐만 아니라 대장 종양 생쥐의 ^4,7,8에 출판되었다. 그러나 이러한보고 방법 및 채점 시스템은 연구를 통해 쉽게 비교할 수 없습니다. 많은 경우에, 병변의 분류에 사용되는 기준에 대한 명확한 정의가없고, 기준이 관련 될 때, 이들은 매우 다양. 또한,대장염 종양, 하나의 측정 도구에 동시에 발생 및 결과에 대한 상호 작용 효과를 가질 수있는 가장 일반적인 대장 병변의 두 가지 모두의 평가를 통합보고 된 채점 시스템이 없습니다. 마지막으로, 대장염에 존재 내시경 채점 시스템은 종종 제한 차별 염증 카테고리가 (즉. 종종 1-4 short 정수 저울에 좁은 득점 옵션) 제대로 질병의 진행 시나리오를 대표하는 매개 변수 통계 분석의 사용을 가능하게합니다.

본 논문에서는 뮤린 대장염 및 결장 종양의 중증도를 평가하고, 항문 주위 영역, 직장 및 원위부 대장의 해부학 적 평가에이 기술을 채용하기위한 표준화 된 프로토콜을 설명하는가요 성 내시경을 사용하는 방법을 설명한다. 우리는 외상 및 이미지 유물을 최소화하기 위해 내시경 검사를하는 동안 효과적인 문제 해결을 설명하고, 우리는 재현 할 수있는 평가 시스템을 설명검증 게시 된 임상 매개 변수를 기반으로. 채점 시스템 (특정 진단 값으로 결과를 강조하기 위해 12 염증, 종양의 매핑이 가능 등급과 플로팅 옵션, 새로운 소수점 유닛 시스템 (즉, 진수 식별자)와 차별의 높은 수준을 사용하여 장의 염증과 종양 모두의 평가를 통합 즉, 종양 개발, 내시경 검사 등 중 합병증). 소수점 식별자의 사용은 더욱 하류 분석에 대한 중요한 데이터 세트를 신속하게 추적을 허용한다. 마지막으로, 우리는 대장염 및 대장염 관련 암 (덱스 트란 황산 나트륨 (DSS) 유도 성 대장염, 클로스 트리 디움 남과 어울리지 않는 감염 및 azoxymethane / DSS 유발 대장 암)의 여러 쥐 모델에서 신뢰성 및 채점 시스템의 유효성 테스트를 수행합니다.

프로토콜

1. 내시경 시스템 설정

1. 제조업체의 지시에 따라 쥐를 마취하기 전에 내시경 검사 시스템을 설정합니다. 이 프로토콜에 대한 인간을 위해 디자인 된 비디오 ureteroscope (그림 1)를 사용합니다. 삽입 튜브의 외경은 9.9 프랑스 (3.3 mm)이며, 그 선단부가 8.5 프랑스 (2.8 mm)이며, 계측 채널의 내부 직경은 6 프랑스 (1.2 mm)이다.
2. 내시경의 사용이 질병 전송에 연결되지 않은 있지만, [9], 포자 형성 미생물로 작업 할 때 70 % 에탄올 ⁽¹⁰⁾ 또는 적절한 기술과 내시경 및 렌즈를 소독. 세균 살균 윤활유 및 비 긁힘은 내시경 끝을 포화시키는 조직을 닦아 준비한다.
3. 계측 채널의 상단에 공기의 전체 3 ML의 주사기 (또는 적절한 CO ₂ 가스 혼합물)를 연결합니다.
4. 전원을 켜고, 정상 흰색 빛의 화이트 밸런스를 설정,적용뿐만 아니라 협 대역 영상 (NBI) 모드. 이 특성 비정상적인 혈관 ^(11)이 궤양 성 및 종 양성 병변 등의 점막에 미세 혈관 구조를 강조하는 등 2001 년 이후, NBI는 진단 영상의 혜택을 제공하고 있습니다. NBI 필터 모드는 헤모글로빈과 구조를 강조 390-445 nm의 530-550 nm의에 캡처 빛의 파장을 제한합니다.
5. 당신의 결과를 기록하기 위해 평가 점수 양식 (그림 2)를 인쇄합니다. (6.1 절 참조) 시험 전에 예상되는 정상 및 NBI 이미지 (그림 3A)와 정의와 각 기준의 성적에 익숙해 지.
6. 원하는 경우, chromoendoscopy 위해 인산 완충 식염수 (PBS)에 착색제 기반 솔루션을 준비. chromoendoscopy에서, 시험은 점막 변화를 강조하기 위해 조영제 등의 염료를 사용하여 수행됩니다. 메틸렌 블루 (0.1-1 %)과 인디고 카민 (0.1 %) 솔루션 (그림 3B)를 사용합니다. 주의즉, 메틸렌 블루는 시료 분석을 방해 할 수있는 산화 라디칼, 아미노산 잔기의 간접적 가교 및 DNA 분해 ^(12)를 생산할 수있는 산화 환원제이다.

2. 마우스의 전신 마취

1. 마취제 및 관리 경로를 선택합니다. 면역 체계 및 연구 목표와 약물의 잠재적 인 간섭에 대한 동물 자원 시설이나 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 수의사를 참조하십시오. 일부 약물은 설치류 ^(13)를 포함하여, 동물의 사이토 카인의 프로필 발현에 영향을 미칠 수있다. 적절한 관리와 함께, 생존 내시경 검사를위한 터미널 절차 또는 이소 플루 란에 주사 tribromoethanol를 사용합니다.
2. 유도의 경우, 0.2 ~ 0.5 L / 분의 속도로 100 % 산소에 이소 플루 란 4 ~ 5 %가 관리, 유지 보수를 위해 0.5 %를 사용합니다. 이 프로토콜은 모든 동물에 적합하지 않습니다. 귀하의 시설 수의사에게 문의적절한 지침과 교육. 동물 복지에 대한 높은 기준을 달성하기 위해 관련 IACUC 권장 사항을 준수. 마우스가 완전히 마취 경우 있는지 확인합니다.
3. '띠'실험실 접착 테이프를 사용하여 지느러미 또는 복부 위치에서지지면 테이블 마취 된 쥐. 당신의 내시경 화면의 해부학 적 방향에주의하십시오. 그 하부 사지와 꼬리를 고정합니다. 테이프의 밴드는 떨어져 호흡의 움직임을 방지하지만, 흉부 환기의 움직임을 제한하지 않도록 가슴에 배치 할 수 있습니다.

3. 자세한 내시경 검사

1. 다음 항문을 통해 범위를 사전에, 직장에 내시경을 삽입하기 전에 항문 주위 병변을 찾습니다.
2. 코트 불임 수술 윤활제 내시경. 하지 CCD (전하 결합 소자) 센서의 코트 표면을해야합니다.
3. 내시경을 삽입하고 녹음을 시작합니다. 녹화 된 동영상은 M 유용합니다검사 후 필요한 경우 내시경 검사의 eticulous 평가. 점막 / 장에 자극을 최소화하기 위해 시간의 최소한의 길이 내시경 검사를 수행하려고합니다.
4. 천천히 창자 벽을 구별하기 위해 주사기를 사용하여 공기를 적용합니다. 마우스의 크기에 따라, 공기의 1-2 밀리리터를 사용한다. 과도한 공기 취입을 방지, 그것은 마취 된 쥐의 호흡 곤란 및 사망의 원인이 될 수 있습니다.
5. 당신은 공기 또는 범위의 부드러운 회전과 방법을 취소로 앞으로 내시경을 사전. 당신은 창자 루멘을 보지 않는 경우에 내시경을 진행하지 마십시오. 천공이나 대장 / 직장 눈물이 특히 젊은 마우스 (<8-10주) 이전에,이 단계에서 발생할 수 있습니다. 필요에 따라 사진을 촬영합니다.
6. 범위는 진행으로 (정의 등 자연적으로 발생하는 점막 출혈은 외상 내시경과 관련이없는) 출혈 자연이있는 경우, 평가합니다. 내시경은 직장과 결장으로 들어가는 자연 출혈이 관찰 될 수있다.
7. 으로결장 벽의 투명성 SESS. 투명성은 결장에 교내 혈관을 시각화하고 주변의 다른 내장의 (그림 4) 할 수있는 능력으로 정의된다. 범위의 부드러운 움직임 (백 포워드, 시계 방향, 반 시계 방향) 혈관 다른 내장의 개념으로 이해 될 수 있는지 결정하는 것을 도울 것이다. 장간막 지방 조직 또한 볼 수 있습니다. 골반강 내 직장은 복강의 결장 벽보다 투명하게 나타나는 경우 주.
8. 초점 병변 (부종 지역, 미란, 궤양, 종 양성 대중)의 종류와 수를 결정하는 검사. 이것은 결장 염증 스코어 및 개발되었다 소수점 식별자를 사용하여 스코어링 형태로 기록 될 것이다.
9. 콜론 결장에 꼬리 쪽 구부러 지역에 도달하면 천천히 내시경을 철회 한 후 파쇄 점막으로 인해 발생하는 출혈 접촉 (의 존재를 찾아내시경) 고급 또는 제거된다. 그것은 의도적으로 대장 표면을 긁어 할 필요가 없습니다. 건강한 대장 점막 적절한 내시경 검사 후 출혈하지 않습니다.

4. 생체 검사

1. 조직 검사가 필요한 경우, 계측 전용 내시경 채널을 통해 생검 겸자를 삽입합니다. 장천공을 방지하기 위해 화면에 내시경 겸자의 발전을 모니터한다.
2. 60 ~ 80 ° 컵에 컵 각도에 대해에 집게의 생검 컵을 열고 관심의 영역으로 연출합니다. 지나치게 열 집게 또는 압력 건강 투명 장 벽의 조직 검사에 의한 천공 결과 장 조직의 여분의 레이어를 파악할 수있다. 천공이 발생하면, IACUC 권장 다음 마취 동안 동물을 안락사. 구멍은 내 독소 혈증과 복막염이 발생할.
3. 생검 컵을 닫고 집게는 폐쇄 유지하면서 그들을 잡아 당깁니다.
4. 레모조직과 집게에 부드러운 솔루션으로 조직을 세척하여 집게의 표본을했습니다. RNA는 나중에하고 PBS 일반적인 작업 솔루션입니다, 필요한 경우, 샘플을 제거하기 위해 바늘을 사용합니다. forcep 컵 침식 또는 가장자리를 절단하지 마십시오.

5. 마취에서 회복

1. 이 복구 될 때까지 검사를 완료하면, 마우스에 따뜻한 환경을 제공한다. 전기 빛, 또는 37 ℃로 설정 따뜻한 패드 중 하나를 사용 과열을 방지, 말초 혈관 확장 동물의 회복을 저해. 전체 복구 될 때까지 밀접하게 마우스를 모니터링합니다.

6. 진수 식별자와 대장 건강의 통합 내시경 채점 시스템

1. 를 위해 : (매개 변수 정의 및 프로토콜 진수 가중 점수 시스템을 사용 쥐과 대장 염증과 종양의 내시경 평가) 점수 형태 (그림 2) 아래의 매개 변수 정의를 사용하여예와 nonbiased 평가 및 상세한 기록 보관에 대한 지침과 선택 '말초-근위 내시경 대장염 점수 시스템'(D-근육).
2. 채점 시스템의 형태 (그림 2)에 설명 대장 염증의 네 개의 매개 변수를 점수. 꼼꼼하게 항문 주위 영역, 장 투명성, 출혈 장 유형 (있는 경우), 그리고 존재와 국소 병변의 양 (미란, 궤양, 및 / 또는 종 양성)을 평가한다.
3. 연구 목적으로 종양을 평가할 때, 수량, 위치 및 크기를 검사하고 대장지도 및 채점 양식에 막대 그래프를 사용하여 설명합니다. 얻은 점수와 병변의 수 (해당되는 경우)의 수치 합이 배경 대장 염증, 병변의 가장 주된 유형 및 병변의 수를 결정합니다.

결과

본 연구에서 제시하는 프로토콜과 이미지는 올림푸스 URF-V 유연한 내시경 ^(14)과 NBI ^{11, 15으로} 제조 하였다. 영상은 MPEG-2 포맷과 JPG, TIF, PNG, 또는 표준 USB 플래시 휴대용 메모리에 양도 최대 1,280 X 1,024 픽셀,와 DICOM 형식으로 사진에 저장되었다. NBI는 헤모글로빈을 함유 조직의 시각적 대비를 향상시킵니다. 일반 빛과 NBI 영상은 대장 점막의 정상적인 해부학과 궤양과 종양 개발

토론

생쥐의 내시경 기술의 수정 및 문제 해결에 대한 몇 가지 고려 사항이있다. 가요 성 내시경의 사용 중에 마스터해야 절차의 중요한 측면은 만곡 및 토크 제어의 코디 복부 팽만 및 마우스 호흡기 손상을 방지하는 데 필요한 공기량의 조절, 및보기 컨트롤의 사소한 기술적 측면을 포함 . 토크 제어는 장천공의 위험을 최소화하기 위해 중요하다. 제대로 처리하면, 쥐 유연한 내시경 검사는 직접 시각...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System