Tecnología de Inserción Metamórfica temprana para insectos de vuelo Supervisión del comportamiento

Resumen

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Resumen

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Introducción

Insertando electrodos, incluso con sistemas electrónicos conectados a los insectos para aplicaciones de grabación de telemetría, ha sido un método importante para entender cómo funcionan los sistemas neuronales durante el vuelo naturales ^1. Colocación o la implantación de sistemas artificiales en los insectos ha planteado muchos desafíos relacionados con el potencial para perturbar el vuelo natural de insecto. Apego superficial o la inserción quirúrgica de plataformas artificiales en el insecto adulto es poco fiable debido a la posible desplazamiento de los dispositivos insertados causadas por la inercia y el estrés inducido por las fuerzas del cuerpo-. Superficialmente unidos o electrodos insertados quirúrgicamente también son propensos a ser rechazado por los insectos como un cuerpo extraño. Además, la operación de implantación requiere la eliminación de las escamas y las pilas en todo el exoesqueleto. La capa de la cutícula gruesa también necesita ser penetrado por inervaciones quirúrgicos que pudieran causar daños colaterales al tejido, lo que interfiere con el vuelo natural de los insectos. Todos los tstos factores pueden hacer que una operación de implante quirúrgico o superficial una tarea difícil y delicada. Con el fin de resolver estos problemas implicados en la unión de los sistemas de control externo y de detección para los insectos, una metodología novedosa que implica el crecimiento metamórfico se describe en este artículo.

El desarrollo metamórfico de insectos holometabolic comienza con la transformación de la larva (o ninfa) en un adulto con una fase de pupa intermedio (Figura 1). El proceso de la metamorfosis implica una extensa reprogramación tejido incluyendo la degeneración seguido de remodelación. Esta transformación se vuelve una larva terrestre a un insecto adulto que demuestra varios comportamientos complejos ^2,3.

La supervivencia de los insectos después de cirugías parabiotic extremas se ha demostrado donde se realizaron las cirugías durante las primeras etapas metamórficas ^4,5. En estas cirugías, las caus histogénesis de desarrolloheridas quirúrgicas ed para ser reparado en duraciones más cortas. Siguiendo estas observaciones, una nueva técnica ha sido desarrollada donde se realizó la implantación de electrodos conductores de la electricidad durante las primeras etapas de crecimiento metamórfica (Figura 1). Esto permite una fijación biomecánicamente segura en el insecto ^6. Una interfaz altamente fiable también se asegura con neuronal del insecto y sistemas neuromusculares ^7. Esta técnica es conocida como "La tecnología de inserción temprana Metamorfosis" (MACI) ^8.

Después de la reconstrucción de todo el sistema de tejidos, estructuras insertados en la pupa surgen con el insecto adulto. Grupos de músculos de vuelo hacen hasta un 65% de la masa corporal total y torácica, por lo tanto, es un objetivo relativamente conveniente para el procedimiento EMIT ^9. Durante el batir de las alas de base, los cambios en la morfología del vuelo alimentar dorsolongitudinal (dl) y el dorsoventral (DV) músculos hacen que el ala Articulatgeometría ion para generar la elevación ^10. Por lo tanto la coordinación funcional de los músculos dl y DV ha sido un tema de investigación activa en virtud de la neurofisiología de vuelo. Insectos Tethering en entornos visuales programados electrónicamente ha sido el método más común para el estudio de la neurofisiología de los comportamientos locomotores complejas ^11,12. Arenas cilíndricas compuestas de paneles de diodos emisores de luz han sido utilizados para estos entornos de realidad virtual, donde los insectos voladores son atados en el medio y el movimiento se simula mediante la actualización dinámica de la pantalla de visualización panorámica de los alrededores. En el caso de los insectos más pequeños, tales como mosca de la fruta Drosophila, la inmovilización se logra mediante la fijación de un pasador metálico en el tórax dorsal de la insectos y colocar el pasador en virtud de un imán permanente ^13,14. Este método sólo permite la cuantificación de las respuestas motoras a través de observaciones visuales con cámaras de alta velocidad sin ningún análisis electrofisiológico. Por otra parte, esta metod ha sido ineficiente para suspender el cuerpo más grande y más pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, nos beneficiamos de los marcos de levitación magnética, donde Marcos peso ligero con imanes unidos a su parte inferior levitan mediante fuerzas electromagnéticas. Cuando se combina con amplificadores neuronales disponibles en el mercado y las matrices de LED, lo que proporciona una plataforma para controlar la salida del vuelo con motor y registrar la electrofisiología relacionados de Manduca sexta.

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Protocolo

NOTA: La fuente de los materiales y reactivos necesarios para seguir el protocolo se proporciona en la tabla "Reactivos" a continuación.

1. Preparación de placas de circuito impreso (PCB) para la grabación de electrodos de conexión

NOTA: Con el fin de proporcionar un procedimiento experimental práctico, electrodos de alambre se sueldan a un PCB para insertar estos electrodos en un conector FFC (cable plano flexible).

1. Corte un 0.5x5 cm ² pieza de revestimiento de cobre laminado.
2. El uso de un marcador de punta fina, dibuja tres almohadillas 0.1x5cm ² rectángulo como el grabado patrones de máscara.
3. Grabe el laminado expuesto usando un grabador de PCB dentro de un área ventilada o campana de humos. Cubre alrededor de 1 cm de longitud del corte laminado con cinta no reactivo. Llene un vaso graduado con al menos 100 ml de reactivo de ataque PCB y cinta del corte lámina de cobre en el interior del vaso graduado con cinta scotch. La mitad de la lámina de cobre cutout debe ser sumergido en el grabador de PCB.
4. Colocar el vaso de precipitados sobre una plataforma giratoria durante 20 min.
5. Retire el recorte de la solución de ataque y colocarlo en un vaso lleno de agua durante 10 minutos.
6. El uso de un pañuelo de papel, aplique alcohol isopropílico y borrar las marcas para exponer las almohadillas de cobre no grabadas.
7. Cortar la placa de circuitos impresos en cuadrados más pequeños de aproximadamente 1 cm de largo.
8. Corte dos pedazos de alambre de acero revestido, recocido, acero (0.11 "revestidos, 0.008" desnudos) con una cuchilla afilada para longitudes de 3 cm cada uno. Estas piezas de alambre de acero inoxidable son los electrodos activos que se pueden insertar en el tórax del insecto.
9. Utilizando una cuchilla, de 4-5 mm de eliminar el recubrimiento de plástico de cada extremo de cada cable. Se recomienda el uso de un microscopio.
10. Cortar un trozo de 0,7 cm de alambre de acero inoxidable aislado para crear una extensión de la punta del electrodo de tierra. Retire con cuidado el revestimiento con una cuchilla o derretir con el calor de un ir de soldadurasobre como se realizó en el paso 1.9.
11. Para la conexión a tierra, cortar una pieza de flexible (Litz o inductor) de alambre a una longitud de 4,5 cm.
12. Suelde la pieza 0.7 cm de acero inoxidable preparada en el paso 1.10 al cable de conexión a tierra preparada en el paso 1.11. Una punta de acero expuesto debe estar al final de la conexión a tierra.
13. Pegue la placa de electrodos dispuestos firmemente al espacio de trabajo de soldadura utilizando una cinta no reactivo. Utilice la cinta para enmascarar todos menos 1-2 mm de las pastillas en el tablero donde se sueldan los electrodos. Este extremo enmascarado,-soldadura libre de las almohadillas se inserta en el conector FFC descrito en el paso 4.1.
14. Alinear los tres hilos de los electrodos de tal manera que un extremo de cada uno puede ser soldado a las almohadillas correspondientes de la placa de electrodo. Aplicar flujo de acero inoxidable a través de los electrodos para soldadura más fácil.
15. Soldar cada uno de los electrodos expuestos en las almohadillas.
16. Sumergir los electrodos en acetona y alcohol isopropílico durante 10 mincada uno para limpiar los residuos de soldadura. El uso de un baño de ultrasonidos mejora el rendimiento de limpieza.

2. Inserción quirúrgica a la Manduca Sexta Pupas

NOTA: Los insectos serán más activos durante las transiciones entre el día y la noche. Por lo tanto, un ciclo día / noche artificial debe establecerse dentro de una cámara de insectos utilizando temporizadores automáticos de salida. Los ajustes deben ser para simular un oscuro 7 horas y 17 ciclo de luz hr.

1. Examine la sexta pupas Manduca diariamente para determinar un tiempo de inserción correspondiente. Las pupas están listos para la inserción de aproximadamente un día después de las alas presentan manchas oscuras.
2. Para anestesiar las pupas, colóquelos en el refrigerador (4C) por alrededor de 6 horas.
3. Prepare el área de trabajo de inserción. El espacio de trabajo debe incluir alcohol isopropílico, pinzas cortantes, cuchillas, y una aguja hipodérmica 30 G. Como una opción, adhesivo de cianoacrilato puede ser utilizado para mejorar la fijación del electrodo.
4. Esterilizar la aguja, pinzas, y los electrodos sumergiéndolos en o limpiando con alcohol isopropílico.
5. Retire la pupa de la nevera y la transfiere al área de trabajo.
6. Determine la ubicación en el tórax que corresponde al grupo muscular de interés. El enfoque de los trabajos en este ejemplo es que los músculos responsables del movimiento dorsoventrales ala carrera ascendente.
7. Usando un cuchillo afilado, rascar suavemente un 1x1 cm ² rectángulo a través de la capa de exocutical. Usando las pinzas, tire lentamente estas piezas.
8. (Opcional) Utilice una aspiradora para eliminar el vello de ala de la región expuesta del tórax.
9. Introduzca lentamente la aguja alrededor de 5 mm en el mesotórax donde las alas se unen al tórax para crear dos puntos de inserción dirigidos al grupo de músculos.
10. Usando las pinzas, guiar a los dos electrodos de registro en los dos puntos de inserción.
11. (Opcional) Para mejorar la durabilidad mecánica, limpiar el pelo alrededor de los electrodosy generosamente aplicar adhesivo cianoacrilato alrededor de cada punto de inserción en el tórax con un aplicador de alambre.
12. Preparar una jaula para la emergencia con el material adecuado (áspero y con textura) que cubren las paredes y el techo para que el insecto puede subirse a la emergencia. Cajas de cartón perforadas o papel de embalaje se pueden utilizar.
13. Prepare un palo fijación rígida con una longitud en torno a 6 cm y 2 mm de diámetro. Agitadores de plástico, un hisopo de algodón, o alambres de metal se pueden utilizar para este paso.
14. Deslice con cuidado este palo a través del orificio debajo de la trompa que sobresale.
15. Fijar los dos lados de la palanca en la superficie de jaula de tal manera que la pupa no puede rodar alrededor. Coloque la pupa dentro de la jaula de manera que el mesotórax quede hacia arriba. Amplia movimiento puede causar daños en el electrodo, pérdida de hemolinfa, o hacer la inserción inútil.

3. Insertar el electrodo de masa en Manduca Sexta

NOTA: La tierra (consultecia) electrodo debe ser insertado en las partes distales del abdomen o el tórax para evitar el acoplamiento de la señal. Esta inserción se puede hacer ya sea durante las etapas posteriores del desarrollo pupal o después de que el insecto emerge. La ventana para el electrodo de tierra tiene que estar preparado en la etapa de pupa, ya sea para una pupa o adulto etapa de inserción de electrodos de tierra.

1. Para la inserción estado de pupa: después de pelar de la cutícula mesothoracic alrededor del electrodo activo (vea el paso 2.7), rayar otro rectángulo a través de la capa de exocutical (alrededor de 0.5x0.5 cm ²⁾ en el abdomen dorsal cerca del tórax utilizando el hipodérmica 30 G aguja. Inserte el electrodo de tierra en esta ventana utilizando la técnica descrita en la sección 2.
2. Para adultos la inserción de electrodos de tierra etapa: una vez que ha surgido el insecto, colóquelo en el refrigerador a 4 ° C durante 6 a 24 horas para inmovilizar.
   Los pasos restantes son los mismos para ambos de pupa y las inserciones etapa adulta.
3. Preparar la inserción ción del espacio de trabajo, incluido el alcohol isopropílico, pinzas cortantes, una aguja hipodérmica 30 G, adhesivo de cianoacrilato, un pedazo de alambre para la aplicación de pegamento, un cauterizador térmico (opcional) y un palo de cera dental (opcional).
4. Localice un punto de inserción de aproximadamente 1-2 cm de distancia de los electrodos de registro a lo largo de la parte posterior del abdomen.
5. Introduzca lentamente la aguja para perforar el abdomen y el proporcionar un sitio de inserción.
6. Usando las pinzas inserte con cuidado el electrodo de masa en el sitio de inserción y aplique presión hasta que quede 3-4 mm de profundidad. Mantenga el electrodo en su lugar y usar un alambre para aplicar pegamento alrededor del sitio de inserción.
7. (Opcional) Para mejorar la resistencia mecánica, utilice el cauterizador térmico y recoger un pequeño (2-3 mm) gota de cera en la punta. Coloque la punta cerca de la zona de inserción y aplicar calor de tal manera que la cera rodea el electrodo y lo mantiene firmemente en su lugar.

4. Preparación de la tarjeta de adaptador

ontenido "> NOTA:. una placa de adaptador es necesario para conectar la placa del electrodo a la headstage grabación inalámbrica a través de un FFC (cable flexible plano) Conector Para ello, una tabla similar a la placa de electrodos tiene que estar preparado siguiendo los pasos 1,1 a 1,7 .

1. Soldar un conector FFC a un extremo de la placa preparada.
2. Suelde tres 30 AWG (American Wire Gauge) conectar cables a tres almohadillas en el otro extremo.
3. Suelde tres conectores mini-a las tres almohadillas en la placa del adaptador para las lecturas del osciloscopio como se describe en la siguiente etapa.
4. Soldar el otro extremo de estos tres cables al conector de headstage.
5. Fije la placa de circuito headstage en parte superior del marco de la levitación.

5. Pregrabando con osciloscopio (Opcional)

NOTA: Con el fin de evaluar la fiabilidad de los electrodos y observar la relación señal-ruido, grabaciones osciloscopio atados pueden ser obtenidos antes de desplegar la WIRELSistema de grabación de ess. Los mini conectores de cables en la placa del adaptador se debe utilizar para esto.

1. Conecte el osciloscopio a un amplificador de grabación extracelular neural. Establezca los parámetros del amplificador a una frecuencia de corte de paso alto de 1 Hz, la frecuencia de corte de paso bajo de 20 kHz, y una ganancia de 100.
2. Conecte cada uno de los mini conectores de cable hembra de la placa del adaptador a los canales de entrada del amplificador.
3. Retire el insecto con el tablero electrodo implantado desde la jaula cuando está en un estado activo (durante su tiempo de la madrugada). Coloque un pedazo de papel de tejido bajo el insecto para que descanse antes de que se tomen medidas.
4. Usando las pinzas, deslice la placa de electrodos en el receptor FFC en el tablero de adaptador. Observar una línea de base de tensión plana y baja cuando el insecto está en reposo y la generación de electromiograma (EMG) remata mientras el insecto aletea.
   NOTA: Consulte la Sección 6: La observación de vuelo del insecto con el Sistema de grabación inalámbrico para representative resultados osciloscopio.
5. Ajuste los parámetros de visualización del osciloscopio, según sea necesario. Captura de los datos en el osciloscopio y guardar los datos.

6. Observación de insectos de vuelo con el sistema de grabación sin hilos

NOTA: Una plataforma de levitación electromagnética se puede construir para la grabación inalámbrica de señales de EMG durante tethered vuelo Manduca sexta. La plataforma de levitación consiste en un marco diseñado para equilibrar un mecanismo de inmovilización. La levitación permite el marco, y por lo tanto el insecto, a guiñada durante la prueba sin la limitación de alambres de atadura. El marco puede ser rápida-un prototipo utilizando un modelado por deposición fundida (FDM) de la máquina. Un imán tiene que ser fijado a la parte inferior de esta trama que se levita mediante una serie de imanes en la plataforma base. El insecto está conectado al conector FFC suspendido de la parte superior del marco. Esta plataforma de levitación se encuentra en el interior de la Arena LED que fue construido using 60 paneles compuestos por una matriz de LEDs individuales 5x7. Este sistema se basa en métodos establecidos para el desarrollo de un entorno para la estimulación visual de moscas de la fruta ^{15, 16, 17.} La arena es controlado por un microcontrolador que permite la simulación de tanto en sentido horario y en sentido antihorario de rotación así como el control de la velocidad de rotación.

1. Configurar el sistema de grabación inalámbrico conectando la headstage al conector de la placa del adaptador en la plataforma de la levitación.
2. Retire el insecto de la jaula cuando está en un estado activo preferiblemente durante su tiempo de amanecer.
3. Usando las pinzas, inserte con cuidado la junta del electrodo en el receptor FFC en el marco de levitación de tal manera que el insecto se suspende firmemente dentro de la configuración.
4. Coloque la varita magnética cerca del interruptor magnético en la headstage para activar la transmisión inalámbrica de datos. Una luz azul se enciende para indicar que el headstage está activo.
5. Apague las luces de laespacio para la más completa oscuridad. Una luz roja se puede utilizar para agregar iluminación a la habitación. Abra el software de recopilación de datos de telemetría en un ordenador y seleccione el archivo de configuración precargado apropiada si se proporciona. Inicie la adquisición de datos para comenzar señales de visualización.
6. Seleccione la interfaz de usuario correspondiente para la observación de las señales EMG en el sistema de grabación inalámbrico para asegurar una operación de conexión y electrodos inalámbrica confiable.
7. Encienda todos los componentes LED Arena: Fuente de alimentación regulada y microcontroladores DC. El microcontrolador puede ajustar las revoluciones por minuto del patrón de luz cíclica y también puede controlar la dirección de la rotación de la luz.
8. Lentamente equilibrar la plataforma de levitación dentro de la arena. Alinear el marco por encima del centro de la base de levitación cuidadosamente, de lo contrario el marco se retiró rápidamente al suelo, posiblemente, lesionar al insecto.
9. Iniciar el sistema de grabación de vídeo.
10. Seleccione la pestaña de registro pertinente del softwareinterfaz. Designe el tiempo de grabación y el archivo Destino de almacenamiento. Elija los ajustes de salida adecuados para guardar los datos. Haga clic en el botón de inicio para iniciar una sesión de grabación en el software. Esto guardará el archivo de datos que se puede importar en entornos de cálculo numérico.
11. Observe que el insecto vuela en la dirección que se corresponde con el movimiento de los LEDs. Invertir el sentido de los LEDs y confirme que el insecto cambia de dirección. Realice este tantas veces como se desee.

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Resultados

Un diagrama esquemático del procedimiento global EMIT se presenta en la Figura 1, que muestra las principales etapas en el ciclo metamórfico de la hawkmoth y los pasos de inserción de electrodos correspondientes. La inserción del electrodo se debe realizar en la fase de pupa tarde de 4 a 7 días antes de la eclosión. Esto permite que las fibras musculares que se desarrollan alrededor de los electrodos y fijar el implante en el insecto.

El resultado típico de una inserc...

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Discusión

Hay varios pasos críticos durante la inserción quirúrgica de los electrodos de registro que afectan a la capacidad de grabar datos en los pasos posteriores del protocolo. Los electrodos de registro se deben insertar en la pupa un día después de que exhibe manchas del ala en su lado dorsal. Si la inserción se realiza dos o más días después de este tiempo, el tejido del insecto no tendrá tiempo suficiente para desarrollar y estabilizar alrededor de los electrodos insertados. Esto podría dar lugar al movimiento ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.