Cedo metamórfica de Inclusão Tecnologia para o Comportamento de Monitoramento de insetos de vôo

Resumo

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Resumo

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Introdução

Inserção de eletrodos, mesmo com sistemas eletrônicos ligados aos insetos para aplicações de gravação de telemetria, tem sido um importante método para compreender como os sistemas neurais função durante o vôo naturais ^1. Colocar ou implantar sistemas artificiais em insetos tem colocado muitos desafios que envolvem o potencial de perturbar o vôo natural do inseto. Apego superficial ou inserção cirúrgica de plataformas artificiais sobre o inseto adulto não é confiável devido à possibilidade de deslocamento dos dispositivos inseridos causados ​​pela inércia e de estresse induzido por forças do corpo. Superficialmente anexado ou eletrodos inseridos cirurgicamente também são propensos a ser rejeitado pelos insetos como um corpo estranho. Além disso, a operação de implantação requer a remoção de escamas e pilhas em todo o exoesqueleto. A camada de cutícula espessa também precisa ser penetrado por inervações cirúrgicos que podem causar danos nos tecidos garantia, interferindo assim com o vôo natural do inseto. Todos os tstas fatores podem fazer uma operação de implante cirúrgico ou superficial uma tarefa desafiadora e delicado. A fim de aliviar estas preocupações envolvidas na fixação externamente sistemas de comando e sensores para os insetos, uma nova metodologia que envolve o crescimento metamórfico serão descritos neste artigo.

O desenvolvimento de insectos metamórfica holometabolic começa com a transformação da larva (ou ninfa) para um adulto com uma fase de pupa intermédia (Figura 1). O processo envolve um grande metamorfose reprogramação tecido incluindo degeneração seguido de remodelação. Esta transformação vira uma larva terrestre para um adulto inseto demonstrando vários comportamentos complexos ^2,3.

A sobrevivência dos insetos após cirurgias parabiótico extremas tem sido demonstrado que as cirurgias foram realizadas durante os primeiros estágios metamórficos ^4,5. Nestas cirurgias, as caus histogênese de desenvolvimentoferidas cirúrgicas ed para ser reparado em períodos mais curtos. Seguindo essas observações, uma nova técnica foi desenvolvida, onde a implantação de eletrodos eletricamente condutivo foi realizada durante os primeiros estágios de crescimento metamórfico (Figura 1). Isso permite que um anexo biomecanicamente seguro sobre o inseto ^6. Uma interface altamente confiável também é presa com neural do inseto e os sistemas neuromusculares ^7. Esta técnica é conhecida como "Early Metamorphosis Inclusão Tecnologia" (EMIT) ^8.

Após a reconstrução do sistema de tecido inteiro, estruturas inseridas na pupa emergir com o inseto adulto. Grupos musculares aéreas perfazer a 65% da massa total do corpo torácica e, portanto, é um alvo relativamente conveniente para o procedimento de EMIT ^9. Durante a batida de asa básica, as mudanças na morfologia do vôo ligando dorsolongitudinal (dl) e dorsoventral (dv) músculos com que a asa articulatgeometria íon para gerar sustentação ^10. Por isso, a coordenação funcional dos músculos dl e dv tem sido um tema de pesquisa ativa em neurofisiologia vôo. Insetos amarrados em ambientes visuais programados eletronicamente tem sido o método mais comum para estudar a neurofisiologia de comportamentos locomotores complexos ^11,12. Arenas cilíndricos compostos de emissores de luz de diodo painéis têm sido usados ​​por esses ambientes de realidade virtual, onde os insetos voadores são amarrados no meio eo movimento é simulado, atualizando dinamicamente a exibição visual panorâmica envolvente. No caso dos insectos menores, tais como mosca da fruta Drosophila, amarrar é conseguido ligando um pino de metal para o tórax dorsal do insecto e colocar o pino sob um íman permanente ^13,14. Este método só permite a quantificação das respostas motoras através de observações visuais com câmeras de alta velocidade, sem qualquer análise eletrofisiológica. Além disso, este metod tem sido ineficiente para suspender o corpo maior e mais pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, beneficiaram de quadros magneticamente levitando onde peso leve armações com ímãs ligados à sua parte inferior são levitado por meio de forças eletromagnéticas. Quando combinado com amplificadores neurais disponíveis comercialmente e matrizes de LED, este fornece uma plataforma para controlar a saída de vôo-motor e registrar a eletrofisiologia relacionado de Manduca sexta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

NOTA: A fonte de os materiais e reagentes necessários para seguir o protocolo é fornecida na Tabela "reagentes" abaixo.

1. Preparar placas de circuito impresso (PCB) para Gravação Eletrodo Conexão

NOTA: A fim de fornecer um procedimento experimental prático, eletrodos de fio são soldadas a uma PCB para inserir esses eletrodos em um conector FFC (cabo plano flexível).

1. Corte um 0.5x5 cm ² pedaço de cobre revestido de laminado.
2. Usando um marcador de ponta fina, faça três almofadas 0.1x5cm ² retângulo como gravura padrões de máscara.
3. Etch o laminado exposto usando um etchant PCB dentro de uma área ventilada ou coifa. Cubra cerca de 1 cm de comprimento do corte laminado com fita não reativa. Encha um copo graduado com pelo menos 100 ml de etchant PCB e fita do corte laminado de cobre para o interior do copo graduado com fita adesiva. Metade do cutou laminado de cobret deve ser submerso no produto corrosivo PCB.
4. Colocar a proveta numa plataforma rotativa durante 20 min.
5. Remover o recorte do etchant e colocá-la num copo cheio de água por 10 min.
6. Usando um lenço de papel, aplique álcool isopropílico e remover as marcações para expor as pastilhas de cobre não gravadas.
7. Corte a placa de circuito impresso em pequenos quadrados de aproximadamente 1 cm de comprimento.
8. Corte dois pedaços de arame revestido, recozido, aço inoxidável (0,11 "revestidos, 0.008" desprotegidas), utilizando uma lâmina afiada para comprimentos de 3 cm cada. Esses pedaços de fio de aço inoxidável são os eletrodos ativos que serão inseridos no tórax do inseto.
9. Usando uma lâmina, remover a 4-5 mm do revestimento de plástico de cada uma das extremidades de cada fio. O uso de um microscópio é recomendada.
10. Corte um pedaço de 0,7 centímetros de fio de aço inoxidável isolada para criar uma extensão de ponta para o eletrodo de aterramento. Remova cuidadosamente o revestimento com uma lâmina ou derretê-lo com o calor de um ri de soldaem que realizada no passo 1.9.
11. Para a ligação à terra, corte um pedaço de flexível (Litz ou indutor) fio a uma distância de 4,5 cm.
12. Soldar o pedaço de 0,7 centímetros de aço inoxidável preparada no passo 1.10 ao fio de conexão terra preparada no passo 1.11. Uma ponta de aço inoxidável exposto deve estar na extremidade da ligação à terra.
13. Tape o tabuleiro eletrodo preparado com firmeza para o espaço de trabalho de solda usando uma fita não reativa. Use a fita para mascarar tudo, mas 1-2 mm das almofadas na placa onde os eletrodos serão soldados. Esta extremidade livre-solda mascarado das almofadas serão inseridos no conector FFC descrito no passo 4.1.
14. Alinhar os três fios de eléctrodos de tal modo que uma extremidade de cada um podem ser soldadas às almofadas correspondentes da placa do eléctrodo. Aplicar fluxo de aço inoxidável através das almofadas de eletrodo para facilitar a soldagem.
15. Solda cada um dos eletrodos expostos nas almofadas.
16. Mergulhar os eléctrodos em acetona e álcool isopropílico durante 10 mincada um de limpar os resíduos de solda. A utilização de um banho de ultra-sons melhora o desempenho de limpeza.

2. Inserção cirúrgica ao Manduca Sexta pupas

NOTA: Os insetos serão mais ativos durante as transições entre dia e noite. Portanto, deve ser estabelecido um ciclo de dia / noite artificial dentro de uma câmara de inseto usando temporizadores automáticos de saída. Estes devem ser definidos para simular um escuro 7 horas e 17 horas ciclo de luz.

1. Examine a sexta pupas Manduca diariamente para determinar um tempo de inserção apropriada. As pupas estão prontos para a inserção de aproximadamente um dia após as asas apresentam manchas escuras.
2. Para anestesiar as pupas, coloque-os na geladeira (4C) por cerca de 6 horas.
3. Prepare o espaço de trabalho de inserção. O espaço de trabalho deve incluir o álcool isopropílico, pinças afiadas, lâminas, e um G agulha hipodérmica 30. Como opção, o adesivo de cianoacrilato pode ser usado para melhorar a fixação do eléctrodo.
4. Esterilizar a agulha, uma pinça, e os eléctrodos mergulhando-as para dentro ou para a limpeza com álcool isopropílico.
5. Retire a pupa do frigorífico e transferi-lo para o espaço de trabalho.
6. Determinar a localização no tórax que corresponde ao grupo de músculos de interesse. O foco do trabalho neste exemplo são os músculos responsáveis ​​pelo movimento dorsoventral asa movimento ascendente.
7. Usando uma lâmina afiada, risque suavemente um 1x1 cm ² retângulo através da camada exocutical. Usando a pinça, lentamente descascar essas peças.
8. (Opcional) Utilizar um vácuo para remover o cabelo asa da região exposta do tórax.
9. Insira lentamente a agulha cerca de 5 mm no mesothorax onde as asas anexar ao tórax para criar dois pontos de inserção de segmentação do grupo muscular.
10. Com uma pinça, guiar os dois eletrodos de registro para os dois pontos de inserção.
11. (Opcional) Para aumentar a durabilidade mecânica, limpar o cabelo em torno dos eletrodose generosamente aplicar adesivo de cianoacrilato em torno de cada ponto de inserção no tórax com um aplicador de arame.
12. Prepare uma gaiola para emergência com material adequado (áspero e texturizado) que cobre as paredes eo teto, de modo que o inseto pode subir em cima de emergência. Podem ser usados ​​caixas de papelão perfuradas ou papel de embalagem.
13. Prepare uma vara rígida fixação com cerca de 6 cm de comprimento e 2 mm de diâmetro. Agitadores de plástico, um cotonete de algodão ou os fios de metal podem ser utilizados para esta etapa.
14. Deslize cuidadosamente esta vara pelo buraco debaixo da tromba protuberante.
15. Fix ambos os lados da vara na superfície de tal forma que a gaiola de pupa não pode rolar. Posicionar a pupa dentro da gaiola de tal modo que o mesothorax está virada para cima. Extensa movimento pode causar danos ao eletrodo, perda de hemolinfa, ou tornar a inserção inútil.

3. Inserir o eletrodo terra em Manduca sexta

NOTA: O chão (consultecia) eléctrodo devem ser inseridas nas partes distais do abdómen ou do tórax para evitar acoplamento de sinal. Esta inserção pode ser feito tanto durante as fases posteriores do desenvolvimento de pupa ou depois do inseto emerge. A janela para o eletrodo terra tem que estar preparado na fase de pupa para qualquer um de pupa ou fase adulta inserção eletrodo terra.

1. Para inserção fase de pupa: após o descascamento da cutícula mesotorácicas ao redor do eletrodo ativo (veja o passo 2.7), risque outro retângulo através da camada exocutical (cerca de 0.5x0.5 cm ²⁾ no abdômen dorsal perto do tórax usando o G hipodérmica 30 agulha. Insira o eletrodo de aterramento para esta janela usando a técnica descrita na seção 2.
2. Para o adulto inserção eletrodo terra etapa: uma vez que o inseto surgiu, coloque-o na geladeira a 4 ° C por 6 a 24 horas para imobilizar.
   Os restantes passos são os mesmos para ambos pupa e inserções estágio adulto.
3. Prepare a inser ção do espaço de trabalho, incluindo o álcool isopropílico, pinças afiadas, um G agulha hipodérmica 30, adesivo de cianoacrilato, um pedaço de arame para aplicação de cola, um cauterizador térmica (opcional), e um pau de cera dental (opcional).
4. Localize um ponto de inserção de aproximadamente 1-2 cm de distância dos eletrodos de registro ao longo do abdômen posterior.
5. Insira lentamente a agulha para perfurar o abdômen e proporcionar um local de inserção.
6. Com uma pinça inserir cuidadosamente o eléctrodo de terra para o local de inserção e aplicar pressão até que seja 3-4 mm de profundidade. Segurar o eléctrodo no lugar e usar um fio para aplicar cola em torno do local de inserção.
7. (Opcional) Para aumentar a resistência mecânica, utilize o cauterizador térmica e coletar uma pequena (2-3 mm) gota de cera na ponta. Coloque a ponta perto do local de inserção e aplicar calor de tal forma que a cera circunda o eletrodo e prende-lo firmemente no lugar.

4. Preparação do Conselho Adaptador

ONTEÚDO "> NOTA:. Uma placa de adaptador é necessário para conectar a placa de eletrodo para o headstage gravação sem fio através de um conector FFC (cabo liso flexível) Para isso, um conselho semelhante à placa eletrodo precisa ser preparado seguindo os passos de 1,1 a 1,7 .

1. Solde um conector FFC a uma das extremidades do tabuleiro preparado.
2. Solda três de 30 AWG (American Wire Gauge) ligar fios a três almofadas na outra extremidade.
3. Solda três conectores mini-aos três almofadas na placa adaptador para leituras do osciloscópio, conforme descrito na próxima fase.
4. Soldar a outra extremidade destes três fios para o conector headstage.
5. Fixe a placa de circuito headstage no topo do quadro de levitação.

5. Prerecording com osciloscópio (Opcional)

NOTA: Para avaliar a confiabilidade dos eletrodos e observar a relação sinal-ruído, as gravações do osciloscópio tethered pode ser obtido antes de implantar o wirelsistema de gravação ess. Os conectores mini-fios na placa de adaptador deve ser utilizado para este.

1. Conecte o osciloscópio a um amplificador de gravação neural extracelular. Defina os parâmetros do amplificador para uma frequência de corte passa-alta de 1 Hz, a frequência de corte passa-baixa de 20 kHz, e um ganho de 100.
2. Conecte cada um dos conectores de fio mini-femininos na placa adaptador para os canais de entrada do amplificador.
3. Retire o inseto com a placa do eletrodo implantado a partir da gaiola quando ele está em um estado ativo (durante o seu tempo de madrugada). Coloque um pedaço de papel de seda sob o inseto para que possa descansar antes de as medidas são tomadas.
4. Com uma pinça, deslize a placa de eletrodo para o receptor FFC na placa adaptadora. Observar uma linha de base plana e baixa tensão quando o inseto está em repouso ea geração de eletromiografia (EMG) picos como o inseto bate as asas.
   NOTA: Consulte a Seção 6: Observar vôo de insetos com o sistema de gravação sem fio para representative resultados osciloscópio.
5. Ajuste os parâmetros de exibição do osciloscópio, conforme necessário. Capture os dados sobre o osciloscópio e salvar os dados.

6. Observing Insect avião com o sistema de gravação sem fio

NOTA: Uma plataforma de levitação eletromagnética pode ser construído para a gravação sem fio de sinais de EMG durante tethered vôo sexta Manduca. A plataforma de levitação consiste numa estrutura concebida para equilibrar um mecanismo de amarração. A levitação permite que o quadro, e, portanto, o inseto, a guinada durante o teste, sem a restrição de fios de amarração. O quadro pode ser rápida protótipo usando uma modelagem por fusão e deposição (FDM) máquina. Um íman deve ser ligado à parte inferior desta estrutura para ser levitado por uma série de imans na plataforma de base. O insecto está ligado ao conector do FFC suspensa a partir do topo da armação. Esta plataforma levitando está localizado dentro da Arena LED que foi construído usin60 g de painéis compostos por uma matriz de LEDs individuais 5x7. Este sistema foi baseado em métodos estabelecidos para o desenvolvimento de um meio para estimulação visual de moscas da fruta ^{15, 16, 17.} A arena é controlado por um microcontrolador que permite a simulação de ambos os sentidos de rotação anti-horário, assim como o controle da velocidade de rotação.

1. Configure o sistema de gravação sem fio, conectando o headstage ao conector da placa do adaptador na plataforma levitação.
2. Retire o inseto da gaiola quando ele está em um estado ativo de preferência durante o seu tempo de madrugada.
3. Com uma pinça, insira cuidadosamente a placa de eletrodo para o receptor FFC na moldura levitando de tal forma que o inseto está suspenso firmemente dentro do setup.
4. Coloque a varinha magnética perto da chave magnética no headstage para ativar a transmissão de dados sem fio. Uma luz azul acende, indicando que o headstage está ativo.
5. Desligue as luzes doespaço para a completa escuridão. Uma luz vermelha pode ser usado para adicionar a iluminação para a sala. Abra o software de coleta de dados de telemetria em um computador e selecione o arquivo de configuração pré-carregado apropriada, se fornecido. Iniciar a aquisição de dados para iniciar a visualização de sinais.
6. Selecione a interface de usuário relevante para a observação de sinais de EMG no sistema de gravação sem fio para garantir a operação de conexão e eletrodo sem fio confiável.
7. Ligue todos os componentes LED Arena: fonte de alimentação regulada e microcontroladores DC. O microcontrolador pode ajustar as rotações por minuto do padrão de luz cíclico e pode também controlar a direcção da rotação da luz.
8. Lentamente equilibrar a plataforma levitação dentro da arena. Alinhar a moldura acima do centro da base de levitação com cuidado, de outra forma a estrutura irá ser puxado rapidamente para o solo, possivelmente ferindo o insecto.
9. Iniciar o sistema de gravação de vídeo.
10. Selecione a guia de gravação relevante do softwareinterface. Designar o tempo de gravação e arquivo de save destino. Escolha as configurações de saída apropriadas para salvar os dados. Clique no botão Iniciar para iniciar uma sessão de gravação dentro do software. Isto irá salvar o arquivo de dados que pode ser importado para ambientes de computação numérica.
11. Observe que o insecto voa na direcção que corresponde ao movimento dos LEDs. Inverter o sentido dos LEDs e confirmar que o inseto inverte a direção. Realize esta como quantas vezes desejar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Um diagrama esquemático do processo global EMIT é apresentado na Figura 1, mostrando as principais etapas no ciclo metamórfica do hawkmoth e os passos de inserção do eléctrodo correspondentes. A inserção do eléctrodo deve ser realizada na fase de pupa tardia 4 a 7 dias antes da eclosão. Isto permite que as fibras musculares para desenvolver em torno dos eléctrodos e fixar o implante no insecto.

O resultado típico de uma fase de pupa tardia inserção concluído q...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Há vários passos críticos durante a inserção cirúrgica dos eletrodos de registro que afetam a capacidade de gravar dados nas etapas posteriores do protocolo. Os eletrodos de registro deve ser inserido na pupa um dia depois de expor pontos de asa para o lado dorsal. Se a inserção é feita de dois ou mais dias, após esse tempo, o tecido do insecto não terá tempo suficiente para se desenvolver em torno e estabilizar os eléctrodos inseridos. Isto poderia levar ao movimento dos eléctrodos implantados e gravaçõ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.