Böcek Uçuş Behavior Monitoring için erken Metamorfik Yerleştirme Teknoloji

Özet

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Özet

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Giriş

Elektrotlar takma, hatta telemetrik kayıt uygulamaları için böceklere bağlı elektronik sistemler ile, doğal uçuş ^1. sırasında nasıl sinir sistemleri işlevini anlamak için önemli bir yöntem olmuştur. Böceklerde yapay sistemleri takılması veya implante böceğin doğal uçuş rahatsız potansiyelini içeren birçok zorluklar ortaya etti. Yüzeysel bağlanma ya da yetişkin böcek yapay platformlar cerrahi ekleme dolayı vücut kaynaklı atalet ve stres kuvvetlerin neden sokulan cihazların olası kayması için güvenilir değildir. Yüzeysel bağlı ya da cerrahi olarak yerleştirilen elektrotlar da bir yabancı cisim gibi böcekler tarafından reddedilmesi yatkındır. Ayrıca, implantasyon operasyonu dış iskelet etrafında pul ve kazık çıkarılmasını gerektirir. Kalın kütikül tabakası aynı zamanda, böylece böceğin doğal uçuş ile müdahale, teminat doku hasarına neden olabilir cerrahi innervasyon için nüfuz edilmesi gerekmektedir. Tüm tHese faktörler cerrahi ya da yüzeysel implantasyon işlemi zor ve hassas bir görev yapabilir. Harici olarak böcekler için kontrol ve algılama sistemlerinin bağlanması ile ilgili endişeleri bu hafifletmek amacıyla, metamorfik büyümesi içeren yeni bir metodoloji bu makalede tarif edilecektir.

Holometabolic böceklerin metamorfik gelişimi bir ara pupa evresinde (Şekil 1) ile bir yetişkin haline larva (veya perisi) dönüşümü ile başlar. Başkalaşım süreci yeniden izledi dejenerasyonu dahil geniş bir doku yeniden programlama gerektirir. Bu dönüşüm çok karmaşık davranışlarını ^2,3 gösteren böcek bir yetişkin için bir karasal larva döner.

Ameliyatları erken aşamalarında metamorfik ^4,5 sırasında gerçekleştirilen nerede aşırı Parabiyotik ameliyat sonrası böceklerin sağkalım gösterilmiştir. Bu ameliyatlarda, gelişimsel histogenezi Caused cerrahi yaralar daha kısa süre içinde tamir edilecek. Elektriksel olarak iletken elektrot implantasyon metamorfik büyümenin erken dönemlerinde (Şekil 1) sırasında gerçekleştirilen nerede Bu gözlemler sonra, yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu böcek ^6, biyomekanik güvenli bir şekilde takılmasını mümkün kılar. Son derece güvenilir bir arabirim de böceğin nöral ve nöromüsküler sistemleri ⁷ ile sabitlenir. Bu teknik, "Early metamorfoz Insertion of Technology" (EMIT) ⁸ olarak da bilinir.

Tüm doku sisteminin yeniden inşası sonra, pupa takılı yapılar yetişkin böcek ile ortaya. Uçuş kas grupları, toplam göğüs vücut kütlesinin% 65 oluşturan ve böylece, EMIT prosedür ⁹ için nispeten uygun bir hedeftir. Temel kanat vuruşu sırasında, dorsolongitudinal dl () güç uçuş morfolojisi ve dorsoventral değişiklikler (dv) kaslar kanat articulat nedenkaldırma ¹⁰ oluşturmak için iyonu geometri. Bu nedenle dl ve dv kasların fonksiyonel koordinasyon uçuş nörofizyolojinin altında aktif bir araştırma konusu olmuştur. Elektronik programlı görsel ortamlarda Bağ böcekler karmaşık ettirici davranışları ^11,12 nörofizyolojisi çalışmak için en yaygın yöntem olmuştur. Işık yayan diyot panellerden oluşan silindirik arenalarda uçan böcekler ortada gergin ve hareketli dinamik çevreleyen panoramik görsel ekran güncelleyerek simüle edilir, bu sanal-gerçeklik ortamları için kullanılmıştır. Bu tür meyve sineği Drosophila gibi küçük böcekler, durumunda, bağlama böceğin dorsal toraksa bir metal pim ekleme ve bir sürekli mıknatıs ^13,14 altında pimin yerleştirilmesiyle elde edilir. Bu yöntem, yalnızca herhangi bir elektrofizyolojik analizi olmadan yüksek hızlı kameralar ile görsel gözlemler yoluyla motor yanıtların ölçümü sağlar. Ayrıca, bu method Manduca sexta daha büyük ve daha ağır vücut askıya verimsiz olmuştur. Bu sorunu çözmek için, biz onların tabanına bağlı mıknatıslar elektromanyetik güçleri aracılığıyla kaldırılan ile hafif çerçeveleri manyetik levitating kare yararlandı. Piyasada mevcut nöral amplifikatör ve LED dizileri ile kombine edildiğinde, bu uçuşu-motor çıkışını kontrol ve Manduca sexta'nın ilgili elektrofizyolojiyi kaydetmek için bir platform sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: protokolü takip için gerekli maddeleri ve kaynağı aşağıda "Reaktifler" Tablo verilmiştir.

1.. Kayıt elektrot bağlantı için Baskılı Devre Kartları (PCB) hazırlanması

NOT: pratik bir deneysel prosedür sağlamak amacıyla, tel elektrotlar bir FFC (esnek düz kablo) konektörüne bu elektrotlar eklemek için bir PCB lehimli.

1. Bakır kaplı laminat bir 0.5x5 cm ² parça kesin.
2. Bir ince uçlu bir kalem kullanarak, maske desenleri yakma gibi üç 0.1x5cm ² dikdörtgen pedleri çizin.
3. Havalandırılmış bir alanda veya çeker ocak içinde bir PCB pürüzlendirici kullanarak maruz laminat etch. Reaktif olmayan bant ile laminat izole uzunluğunun yaklaşık 1 cm örtün. PCB asitlenmesi ve bant kapaklar ile mezun beherin içine bakır kesme laminat en az 100 ml dereceli bir beher doldurun. Bakır laminat cutou yarısıt PCB etchant batık olmalıdır.
4. 20 dakika için bir döner platform üzerinde beher yerleştirin.
5. Asitlenmesi gelen kesme çıkarın ve 10 dakika boyunca su dolu bir kaba yerleştirin.
6. Bir kağıt mendil kullanarak, izopropil alkol uygulamak ve oyulmayan bakır pedleri maruz işaretleri kaldırın.
7. Yaklaşık 1 cm uzunluğunda küçük kareler halinde baskılı devre kartını kesti.
8. 3 cm her uzunlukları keskin bir bıçak kullanılarak kaplanmış, tavlı, paslanmaz çelik tel iki adet (çıplak 0.11 "0.008, kaplanmış") kesin. Paslanmaz çelik tel Bu parçalar böceğin toraks içine eklenir aktif elektrotlardır.
9. Bir bıçak kullanarak, her bir telin her bir ucundan plastik kaplama 4-5 mm çıkarın. Bir mikroskop kullanılması önerilmektedir.
10. Toprak elektrot için bir ipucu uzantısı oluşturmak için yalıtımlı paslanmaz çelik tel biri 0.7 cm parça kesin. Hafifçe bir bıçak ile kaplama kaldırmak veya bir lehim ir ısı ile eritingibi adım 1.9 gerçekleştirilen üzerinde.
11. Toprak bağlantısı için, 4.5 cm uzunluğunda esnek (fıls veya bobin) tel tek parça kesti.
12. Adımda 1.11 hazırlanan topraklama bağlantı teli adım 1.10 hazırlanan paslanmaz çelik 0.7 cm lehim parçası. Bir maruz paslanmaz çelik ucu zemin bağlantısının sonunda olmalıdır.
13. Sıkıca reaktif olmayan bir bant ile lehim çalışma alanına hazırlanan elektrot kurulu bantlayın. Elektrotlar lehimli olacak gemide yastıkları tüm ama 1-2 mm maske bandı kullanın. Pedleri Bu maskeli, lehim-serbest uç adım 4.1 'de açıklanan FFC konnektörüne eklenecektir.
14. Her birinin bir ucu elektrot kartındaki gelen yastıkları lehimlenmiş olabilir, öyle ki üç elektrot telleri hizalayın. Kolay lehim için elektrot pedleri genelinde paslanmaz çelik akı uygulayın.
15. Pedleri maruz elektrotların her lehimleyin.
16. 10 dakika boyunca, aseton ve izopropil alkol içinde elektrotlar daldırınHer bir lehim kalıntılarını temizlemek için. Ultrasonik banyosunun kullanılması temizleme performansını artırır.

, Manduca sexta Pupa 2.. Cerrahi Ekleme

NOT: böcekler gece ve gündüz arasındaki geçişler sırasında en aktif olacaktır. Bu nedenle, yapay bir gündüz / gece döngüsü otomatik çıkış sürelerini kullanarak bir böcek bölme içinde tesis edilmelidir. Bunlar 7 saat karanlık ve 17 saat ışık döngüsü taklit ayarlanmış olmalıdır.

1. Uygun bir ekleme zamanı belirlemek için günlük Manduca sexîa pupa inceleyin. Pupa kanatları koyu lekeler sergilemek sonra yaklaşık bir gün yerleştirilmesi için hazırız.
2. Pupa uyutmak için, yaklaşık 6 saat boyunca buzdolabında (4C) koyun.
3. Ekleme alanını hazırlayın. Çalışma alanı izopropil alkol, keskin cımbız, bıçaklar, ve 30 G derialtı iğne içermelidir. Bir seçenek olarak, siyanoakrilat yapıştırıcı elektrot tespiti arttırmak için kullanılabilmektedir.
4. Içine daldırma ya da izopropil alkol ile silinerek iğne, cımbız ve elektrotlar sterilize edin.
5. Buzdolabından pupa çıkarın ve çalışma alanına transfer.
6. Ilgi kas grubuna karşılık Toraks konumunu belirleyin. Bu örnekte çalışmalarının odak noktası kanat yukarı doğru vuruş hareketinden sorumlu dorsoventral kasları.
7. Keskin bir bıçak kullanarak, yavaşça exocutical tabakası bir 1x1 cm ² dikdörtgen çizebilir. Cımbız kullanarak, yavaş yavaş bu parçaları soyulabilir.
8. (İsteğe bağlı) toraks maruz bölgesinden kanat saç kaldırmak için bir vakum kullanın.
9. Yavaşça kanatlar kas grubunu hedefleyen iki ekleme noktaları oluşturmak için toraks eklemek mesothorax içine 5mm hakkında iğne takın.
10. Cımbız kullanarak, iki ekleme noktalarını içine iki kayıt elektrotları kılavuz.
11. (İsteğe bağlı) elektrotların etrafında saçı temizlemek, mekanik dayanıklılığı artırmak içinve cömertçe bir tel aplikatör ile toraks her ekleme noktasının çevresinde cyanoacrylate yapıştırıcı uygulanır.
12. Böcek çıkması üzerine tırmanmaya böylece duvarlar ve tavan kaplaması uygun malzeme (kaba ve dokulu) ile ortaya çıkması için bir kafes hazırlayın. Delikli karton kutular veya ambalaj kağıt kullanılabilir.
13. Yaklaşık 6 cm uzunluğunda ve 2 mm çapı olan bir sert çubuk tespit hazırlayın. Plastik karıştırıcı, bir pamuklu çubuk veya metal teller bu aşama için kullanılabilir.
14. Dikkatle çıkıntılı burnumun altındaki delikten bu sopa kaydırın.
15. Pupa etrafında rulo olamaz böyle kafes yüzeyinde sopa iki tarafını düzeltmek. Mesothorax yukarı baktığından böyle bir kafesin içinde pupa yerleştirin. Geniş hareket hemolimfin elektrot, kayıp zarar veya ekleme işe yaramaz hale gelebilir.

3.. Manduca Sexta içine toprak elektrot takılması

NOT: Zemin (bakınızence) elektrot sinyallerin bağlanmasını önlemek için toraks karın veya distal parçalar takılmalıdır. Bu ekleme pupa gelişme daha sonraki aşamalarında veya böcek çıktıktan sonra da yapılabilir. Toprak elektrotu için bir pencere Pupa ya da yetişkin safha toprak elektrotu sokulması için ya da pupa aşamasında hazırlanmalıdır.

1. Pupa aşama yerleştirilmesi için: aktif elektrot etrafında mesothoracic manikür soyma sonra (adım 2.7), exocutical katmanı aracılığıyla başka bir dikdörtgen çizebilir 30 G hipodermik kullanarak yakın toraks dorsal karın (0.5x0.5 cm civarında ²⁾ iğne. Bölüm 2'de tarif edilen tekniği kullanarak, bu penceresine toprak elektrotu yerleştirin.
2. Yetişkin safha toprak elektrotu ekleme için: böcek ortaya sonra, hareketsiz hale getirmek için 6-24 saat boyunca 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
   Geri kalan aşamalar pupa ve yetişkin safha eklemeler her ikisi için de aynıdır.
3. Inser hazırlayın izopropil alkol, keskin cımbız, bir 30 G hipodermik iğne, siyanoakrilat yapıştırıcı, tutkal uygulama için bir tel parçasından, bir termal cauterizer (isteğe bağlı) ve bir diş balmumu çubuk (isteğe bağlı) de dahil olmak üzere tion çalışma alanı.
4. Yaklaşık 1-2 cm uzakta arka karın boyunca kayıt elektrotlar bir ekleme noktasını bulun.
5. Yavaş yavaş karın delinme ve ekleme sitesi sunmak için iğne takın.
6. Cımbız kullanarak dikkatlice insersiyona içine toprak elektrodu takın ve derin 3-4 mm kadar basınç uygulayın. Yerinde elektrot tutun ve ekleme sitenin etrafında yapıştırıcı uygulamak için bir tel kullanabilirsiniz.
7. (İsteğe bağlı), mekanik gücünü artırmak termal cauterizer kullanın ve ucunda mum küçük (2-3 mm) boncuk toplamak. Insersiyona yakın ucu yerleştirin ve balmumu elektrodu çevreleyen ve yerine sıkıca tuttuğu gibi ısı uygulayın.

Adaptör Kurulu 4. Hazırlanması

"ontent> NOT:. bir adaptör kurulu bir FFC (Düz Esnek Kablo) konektörü üzerinden kablosuz kayıt Headstage elektrot kurulu bağlamak için gereklidir Bunun için, elektrot kuruluna benzer bir kurul izleyerek hazırlıklı olmak gerekiyor 1,1-1,7 adımları .

1. Hazırlanmış kurulu bir ucuna bir FFC konektörü lehim.
2. Diğer ucunda üç yastıkları kanca telleri kadar üç 30 AWG (Amerikan Wire Gauge) lehimleyin.
3. Bir sonraki aşamada tarif edildiği gibi osiloskop okumaları için adaptör kartındaki üç yastıkları için üç küçük bağlayıcıları Lehim.
4. Headstage konektöre bu üç tellerin diğer ucunu Lehim.
5. Levitation çerçevenin üstüne headstage devre kartını sabitleyin.

5. Osiloskop (Opsiyonel) ile Prerecording

Not: elektrotların güvenilirliğini değerlendirmek ve gürültü oranı sinyal gözlemlemek için, gergin osiloskop kayıtları kab dağıtmadan önce elde edilebiliress kayıt sistemi. Adaptör kartındaki mini kablolu bağlantı, bu için kullanılmalıdır.

1. Dışı bir nöral kayıt amplifikatör osiloskop bağlayın. 1 Hz, 20 kHz'lik bir düşük-geçiş kesme frekansı ve 100 bir kazancı bir yüksek geçirgen bir kesme frekansına amplifikatör parametreleri ayarlayın.
2. Amplifikatör giriş kanalı için adaptör gemide kadın, mini tel konnektörleri her bağlayın.
3. (Ve buna şafak süre boyunca) aktif halde olduğunda kafesten implante elektrot kurulu ile böcek çıkarın. Ölçümler alınır önce dinlenmek için böceğin altında doku bir parça kağıt yerleştirin.
4. Cımbız kullanarak, adaptör gemide FFC reseptörün içine elektrot kartını kaydırın. Böcek dururken düz ve alçak gerilim temel gözlemlemek ve böcek kanat çırpıyor gibi elektromiyogramın (EMG) nesil ani.
   NOT: representat için Kablosuz Kayıt Sistemi ile izlenmesi böcek uçuş: Bölüm 6'ya bakınosiloskop sonuçları ive.
5. Gerektiği gibi osiloskop izleme parametrelerini ayarlayın. Osiloskop veri yakalama ve verileri kaydetmek.

Kablosuz Kayıt Sistemi ile 6.. Gözlem Böcek Uçuş

NOT: Bir elektromanyetik kaldırma platformu gergin Manduca sexîa uçuş sırasında EMG sinyallerinin kablosuz kayıt için inşa edilebilir. Levitation platformu bir bağlama mekanizmasını dengelemek için tasarlanmış bir çerçeve oluşur. Kaldırma çerçevesi ve bu yüzden böcek, bağlama tellerinin kısıtlama olmadan test sırasında yaw sağlar. Çerçeve erimiş birikimi modelleme (FDM) makine kullanılarak hızlı örneklenmekte olabilir. Bir mıknatıs baz platformu mıknatıslar bir dizi levitated bu çerçevenin alt kısmına monte edilmesi gerekmektedir. Böcek çerçevenin üstten asılı FFC konektöre bağlanmıştır. Bu levitating platformu usin inşa edilmiş LED Arena içinde yer almaktadır5x7 bireysel LED'ler bir dizi oluşan 60 gr panelleri. Bu sistem ^{15, 16, 17,} uçan meyve görsel uyarılması için bir ortam geliştirmek için bilinen yöntemlere göre oldu. Arena saat yönünde ve saat yönünün tersine dönüş hem de dönme hızının kontrol hem de bir mikro izin simülasyonu ile kontrol edilir.

1. Levitation platformda adaptör kartı konnektörüne headstage bağlayarak kablosuz kayıt sistemi kurun.
2. Onun şafak süre boyunca, tercihen aktif halde olduğunda kafesten böcek çıkarın.
3. Cımbız kullanarak dikkatli bir şekilde böcek kurulum içinde sıkı bir şekilde süspansiyon haline getirilir, öyle ki levitating çerçeve üzerinde FFC reseptörü içine elektrot kartını yerleştirin.
4. Kablosuz veri iletimini etkinleştirmek için headstage manyetik anahtarı yanında manyetik çubuk yerleştirin. Mavi ışık headstage aktif olduğunu gösteren gelecektir.
5. Işıkları kapatıntam karanlık oda. Kırmızı lamba odaya ışık eklemek için kullanılabilir. Bir bilgisayarda telemetri veri toplama yazılımı açın ve eğer varsa uygun önceden yüklenmiş yapılandırma dosyasını seçin. Izleme sinyalleri başlamak için veri toplama başlatın.
6. Güvenilir kablosuz bağlantı ve elektrot çalışmasını sağlamak için kablosuz kayıt sistemi üzerinde EMG sinyallerinin gözlem için ilgili kullanıcı arabirimi seçin.
7. Düzenlenmiş DC güç kaynağı ve mikro: tüm LED Arena bileşenleri açın. Mikro-kontrol birimi, siklik ışık deseninin dakikada dönüşleri ayarlayabilir ve ayrıca, hafif dönme yönünü kontrol edebilir.
8. Yavaşça arenada kaldırma platformu dengelemek. Dikkatli bir şekilde asma tabanın merkezine üzerinde çerçeve, aksi halde çerçeve muhtemelen böcek zarar toprağa hızlı bir şekilde çekilmiş olacak hizalayın.
9. Video kayıt sistemini başlatın.
10. Yazılımın ilgili kayıt sekmesini seçinarayüzü. Kayıt süresini tayin ve hedefe kaydetmek dosya. Verileri kaydetmek için uygun çıkış ayarlarını seçin. Yazılım içinde bir kayıt oturumu başlatmak için start düğmesine tıklayın. Bu sayısal bilgisayar ortamları içine alınabilir veri dosyasını kaydeder.
11. Böcek LED'lerin hareketine karşılık yönünde uçan olarak dikkate alınmalıdır. LED'lerin yönünü tersine çevirmek ve böcek yönünü tersine onaylayın. Istediğiniz gibi bu kadar çok kez gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

EMIT genel prosedürün şematik hawkmoth metamorfik döngüsü ve karşılık gelen elektrot yerleştirme adımda ana aşamaları gösteren, Şekil 1 'de sunulmuştur. Elektrot ekleme 4-7 gün önce, son eclosion pupa aşamasında yapılmalıdır. Bu, kas lifleri elektrotların etrafında yer geliştirmek ve böcek implantı güvenliğini sağlar.

İki aktif elektrotlar ve topraklama elektrotları sokulduktan tamamlanmış bir pupa geç evre sokulma tipik sonucu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protokol sonraki adımda verileri kaydetmek yeteneğini etkileyebilir kayıt elektrotların cerrahi yerleştirilmesi sırasında birkaç önemli adım vardır. Kayıt elektrotları, sırt tarafında kanat noktalar sergileyen sonra pupa bir gün içine sokulmalıdır. Ekleme iki ya da daha fazla gün, bu saatten sonra yapılırsa, böceğin doku takılan elektrotlar etrafında geliştirmek ve dengelemek için yeterli zaman olmayacaktır. Bu da yetişkin safhasında implante elektrotlar ve güvenilmez kayıtları hareketi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.