All'inizio metamorfica Tecnologia Inserzione per Insect Volo monitoraggio del comportamento

Riepilogo

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Abstract

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Introduzione

Inserimento di elettrodi, anche con sistemi elettronici collegati a insetti per applicazioni di registrazione telemetrici, è stato un metodo importante per capire come funzionano i sistemi neurali durante il volo naturale ^1. Collegamento o impiantare sistemi artificiali in insetti ha posto molte sfide che coinvolgono il potenziale per disturbare il volo naturale dell'insetto. Attaccamento superficiale o inserimento chirurgico di piattaforme artificiali sulla insetto adulto è inaffidabile a causa della possibile spostamento dei dispositivi inseriti causati da inerziali e lo stress le forze indotte corpo. Superficialmente attaccati o elettrodi inseriti chirurgicamente sono anche soggetti a essere riprovato dagli insetti come un corpo estraneo. Inoltre l'operazione di impianto richiede la rimozione di scale e pali intorno l'esoscheletro. Lo strato spessa cuticola ha anche bisogno di essere penetrato per innervazioni chirurgiche che potrebbero causare danni ai tessuti collaterali, interferendo così con il volo naturale dell'insetto. Tutte le tfattori ueste possono fare un chirurgico o superficiale operazione di impianto un compito impegnativo e delicato. Al fine di alleviare tali preoccupazioni coinvolti nel fissare esternamente sistemi di controllo e rilevazione per gli insetti, una nuova metodologia che coinvolge la crescita metamorfica sarà descritto in questo articolo.

Lo sviluppo metamorfico di insetti holometabolic inizia con la trasformazione della larva (o ninfa) in un adulto con uno stadio di pupa intermedia (Figura 1). Il processo di metamorfosi coinvolge una vasta riprogrammazione dei tessuti tra cui la degenerazione seguita da rimodellamento. Questa trasformazione trasforma una larva terrestre ad un adulto insetto dimostrando diversi comportamenti complessi ^2,3.

La sopravvivenza degli insetti dopo interventi chirurgici parabiotic estreme è stata dimostrata, dove sono stati eseguiti interventi chirurgici durante le prime fasi metamorfiche ^4,5. In questi interventi, i Caus istogenesi di sviluppoferite chirurgiche ED per essere riparati in durate più brevi. A seguito di queste osservazioni, una nuova tecnica è stata sviluppata in cui è stata eseguita l'impianto di elettrodi elettricamente conduttivi durante i primi stadi di crescita metamorfica (Figura 1). Ciò consente un fissaggio sicuro biomeccanicamente sulla insetto ^6. Un'interfaccia estremamente affidabile è inoltre assicurata con neurale dell'insetto e sistemi neuromuscolari ^7. Questa tecnica è conosciuta come "Early Metamorphosis inserimento Technology" (EMIT) ^8.

Dopo la ricostruzione dell'intero sistema tessuto, strutture inserite nel pupa emergono con l'insetto adulto. Gruppi muscolari ponti rendono fino al 65% della massa totale del corpo toracica e, quindi, è un bersaglio relativamente conveniente per la procedura EMIT ^9. Durante il battito delle ali di base, i cambiamenti nella morfologia del volo alimentare dorsolongitudinal (dl) e il dorsoventral (dv) muscoli causano il articulat alageometria ione per generare cremagliera ^10. Pertanto, il coordinamento funzionale del dl e dv muscoli è stato un argomento di ricerca attiva in neurofisiologia volo. Insetti tethering in ambienti visivi programmati elettronicamente è stato il metodo più comune per lo studio della neurofisiologia di complessi comportamenti locomotore ^11,12. Arene cilindrici composti da pannelli di diodi emettitori di luce sono stati utilizzati per questi ambienti di realtà virtuale, in cui gli insetti volanti sono legati al centro e il movimento è simulato attraverso l'aggiornamento dinamico la visualizzazione panoramica circostante. Nel caso di piccoli insetti, come frutta Drosophila, tethering sono ottenute applicando un perno metallico al torace dorsale dell'insetto e posizionando il perno sotto un magnete permanente ^13,14. Questo metodo consente la quantificazione delle risposte motorie solo attraverso osservazioni visive con telecamere ad alta velocità, senza alcuna analisi elettrofisiologiche. Inoltre, questo metod è stata inefficiente a sospendere il corpo più grande e pesante di Manduca Sexta. Per risolvere questo problema, abbiamo beneficiato cornici magneticamente levitazione dove il peso leggero Cornici con i magneti attaccati al loro fondo rimangono sospesi attraverso le forze elettromagnetiche. Se combinato con disponibili in commercio amplificatori neurali e array di LED, questo fornisce una piattaforma per controllare l'output di volo a motore e registrare il relativo elettrofisiologia di Manduca Sexta.

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Protocollo

NOTA: L'origine dei materiali e reagenti necessari per seguire il protocollo è previsto nella tabella "reagenti" qui sotto.

1. Preparazione di circuiti stampati (PCB) per la registrazione elettrodo Connection

NOTA: Al fine di fornire una procedura pratica sperimentale, elettrodi a filo sono saldati ad un PCB di inserire questi elettrodi in un connettore FFC (cavo piatto flessibile).

1. Tagliare una 0.5x5 cm ² pezzo di rame rivestito in laminato.
2. Con un pennarello a punta fine, disegnare tre pastiglie 0.1x5cm ² rettangolo come acquaforte modelli di maschera.
3. Etch il laminato esposto utilizzando un etchant PCB all'interno di una zona ventilata o cappa. Coprire circa 1 cm di lunghezza del ritaglio laminato con del nastro non reattivo. Riempire un bicchiere graduato con almeno 100 ml di PCB mordenzante e il nastro il ritaglio laminato di rame all'interno del bicchiere graduato con lo scotch. Metà del cutou laminato di ramet deve essere immerso nel mordenzante PCB.
4. Porre il bicchiere su una piattaforma rotante per 20 min.
5. Togliere il ritaglio dal mordenzante e metterlo in un bicchiere pieno d'acqua per 10 minuti.
6. Utilizzando una carta velina, applicare alcool isopropilico e rimuovere i marcatori per esporre le piazzole di rame non inciso.
7. Tagliare il circuito stampato in piccoli quadrati lungo circa 1 cm.
8. Tagliate due pezzi di filo rivestito, ricotto, acciaio inox (0,11 "rivestiti, 0.008" nudi) con una lama affilata di lunghezza di 3 cm ciascuno. Questi pezzi di filo di acciaio inossidabile sono gli elettrodi attivi che verranno inseriti nel torace dell'insetto.
9. Utilizzando una lama, rimuovere 4-5 mm del rivestimento di plastica da ciascuna estremità di ciascun filo. Si raccomanda l'uso di un microscopio.
10. Tagliare un 0,7 centimetri pezzo di filo in acciaio inox coibentato per creare un'estensione di punta per l'elettrodo di massa. Rimuovere delicatamente il rivestimento con una lama o fondere con il calore di una ir saldaturacome previsto al passaggio 1.9.
11. Per il collegamento di terra, tagliare un pezzo di flessibile (Litz o induttore) filo ad una lunghezza di 4,5 cm.
12. Saldare il 0,7 centimetri pezzo di acciaio inossidabile preparato in fase 1.10 al filo di collegamento a terra preparato al punto 1.11. Una punta acciai inossidabili esposti dovrebbe essere alla fine del collegamento a terra.
13. Nastro il consiglio elettrodo preparato saldamente al lavoro di saldatura utilizzando un nastro non reattivo. Utilizzare il nastro per mascherare tutti, ma 1-2 mm delle pastiglie sul tabellone in cui verranno saldati gli elettrodi. Questo, estremità mascherato senza saldatura dei pad verrà inserito nel connettore FFC descritto al punto 4.1.
14. Allineare i tre fili elettrodi in modo tale che una estremità di ciascun possono essere saldati ai pad corrispondenti sulla scheda elettrodo. Applicare flusso in acciaio inox attraverso gli elettrodi per facilitare la saldatura.
15. Saldare ciascuno degli elettrodi esposti sui pad.
16. Immergere gli elettrodi in acetone e alcool isopropilico per 10 minciascuno per pulire i residui di saldatura. Uso di un bagno ad ultrasuoni di migliorare il rendimento di pulizia.

2. Inserimento chirurgica per la Manduca Sexta Pupae

NOTA: Gli insetti saranno più attive durante le transizioni tra giorno e notte. Pertanto, un ciclo giorno / notte artificiale dovrebbe essere istituito all'interno di una camera di insetto con timer di uscita automatici. Questi dovrebbero essere impostati per simulare un oscuro 7 ore e 17 ciclo di luce hr.

1. Esaminare la Sesta pupe Manduca giornaliero per determinare un tempo di inserimento appropriato. Le pupe sono pronti per l'inserimento di circa un giorno dopo le ali presentano macchie scure.
2. Per anestetizzare le pupe, metterli in frigorifero (4C) per circa 6 ore.
3. Preparare l'area di lavoro di inserimento. L'area di lavoro dovrebbe includere alcool isopropilico, pinzette taglienti, lame e un ago ipodermico G 30. Come opzione, cianoacrilato può essere utilizzato per migliorare la fissazione elettrodo.
4. Sterilizzare l'ago, pinzette, e gli elettrodi immergendoli in o pulire con alcol isopropilico.
5. Rimuovere la pupa dal frigorifero e trasferirlo al lavoro.
6. Determinare la posizione sul torace che corrisponde al gruppo muscolare di interesse. Il focus del lavoro in questo esempio è i muscoli dorsoventrale responsabili per il movimento dell'ala salita.
7. Utilizzando una lama affilata, graffiare delicatamente un 1x1 cm ² rettangolo attraverso lo strato exocutical. Usando le pinzette, lentamente staccare questi pezzi.
8. (Facoltativo) Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere i capelli ala dalla regione esposta del torace.
9. Lentamente inserire l'ago circa 5mm in mesothorax dove le ali si attaccano al torace per creare due punti di inserimento rivolti al gruppo muscolare.
10. Usando le pinzette, guidare i due elettrodi di registrazione nei due punti di inserimento.
11. (Facoltativo) Per migliorare la durabilità meccanica, pulire il pelo intorno agli elettrodie generosamente applicare l'adesivo cianoacrilato attorno a ciascun punto di inserimento sul torace con un applicatore filo.
12. Preparare una gabbia per emergere con materiale adeguato (ruvida e strutturato) che coprono le pareti e il soffitto in modo che l'insetto può salire su di emergere. Possono essere utilizzate scatole di cartone perforate o carta da imballaggio.
13. Preparare un bastone fissaggio rigido con lunghezza di circa 6 cm, diametro di 2 mm. Agitatori in plastica, un bastoncino di cotone o fili metallici possono essere usati per questo passo.
14. Far scorrere delicatamente questo bastone attraverso il foro sotto la proboscide sporgente.
15. Fissare entrambi i lati del bastone sulla superficie gabbia tale che la pupa non può rotolare intorno. Posizionare la pupa all'interno della gabbia in modo che il mesothorax sia rivolto verso l'alto. Ampio movimento potrebbe danneggiare l'elettrodo, perdita di emolinfa, o rendere inutile l'inserimento.

3. Inserimento della terra elettrodo in Manduca Sexta

NOTA: Il terreno (vediza) elettrodo deve essere inserito nelle parti addome o distali del torace per evitare l'accoppiamento del segnale. Questo inserimento può essere fatto sia durante le fasi successive di sviluppo pupa o dopo l'insetto emerge. La finestra per l'elettrodo di massa deve essere preparato in fase di pupa sia per una pupa o la fase adulta inserimento elettrodo di massa.

1. Per l'inserimento stadio di pupa: dopo la pelatura della cuticola mesothoracic intorno l'elettrodo attivo (vedi punto 2.7), graffiare un altro rettangolo attraverso lo strato exocutical (circa 0.5x0.5 cm ²⁾ sull'addome dorsale vicino al torace utilizzando il 30 G ipodermica ago. Inserire l'elettrodo di massa in questa finestra usando la tecnica descritta nella sezione 2.
2. Per l'adulto inserimento elettrodo di massa tappa: una volta che l'insetto è emerso, metterlo in frigorifero a 4 ° C per 6-24 ore per immobilizzare.
   Le fasi successive sono le stesse per entrambi pupa e inserimenti stadio adulto.
3. Preparare il inseri zione di lavoro compreso l'alcool isopropilico, pinzette taglienti, un ago ipodermico G 30, cianoacrilato, un pezzo di filo per l'applicazione di colla, un cauterizer termica (opzionale), e un bastone di cera dentale (opzionale).
4. Individuare il punto di inserimento di circa 1-2 cm di distanza dagli elettrodi di registrazione lungo l'addome posteriore.
5. Lentamente inserire l'ago per perforare l'addome e fornire un sito di inserimento.
6. Con una pinzetta inserire con cautela l'elettrodo di terra nel sito di inserimento ed applicare la pressione fino a quando è di 3-4 mm di profondità. Tenere l'elettrodo in posizione e usare un filo per applicare colla intorno al sito di inserzione.
7. (Facoltativo) Per migliorare la resistenza meccanica, utilizzare il cauterizer termico e raccogliere un piccolo (2-3 mm) di cera sulla punta. Posizionare la punta vicino al sito di inserzione e applicare tale calore che la cera circonda l'elettrodo e lo tiene saldamente in posizione.

4. Preparazione della scheda adattatore

ONTENUTO ">. NOTA: Una scheda adattatore è necessario per collegare la scheda elettrodo headstage di registrazione wireless attraverso un connettore FFC (Flat Flexible Cable) Per questo, una tavola simile alla scheda elettrodo deve essere preparato seguendo i passi da 1.1 a 1.7 .

1. Saldare un connettore FFC ad una estremità della tavola preparata.
2. Saldare tre 30 AWG (American Wire Gauge) collegare i fili a tre pastiglie all'altra estremità.
3. Saldare tre mini connettori ai tre rilievi sulla scheda adattatore per le letture oscilloscopio come descritto nella fase successiva.
4. Saldare l'altra estremità di questi tre fili al connettore headstage.
5. Fissare il circuito headstage sulla parte superiore del telaio levitazione.

5. Preregistrazione con oscilloscopio (opzionale)

NOTA: Al fine di valutare l'affidabilità degli elettrodi e osservare il rapporto segnale-rumore, registrazioni frenati dell'oscilloscopio possono essere ottenuti prima di distribuire il wirelsistema di registrazione ess. I mini cavi di collegamento sulla scheda adattatore deve essere usato per questo.

1. Collegare l'oscilloscopio ad un amplificatore di registrazione neurale extracellulare. Impostare i parametri di amplificazione ad un passa-alto frequenza di cut-off di 1 Hz, un passa-basso frequenza di taglio di 20 kHz, e un guadagno di 100.
2. Collegare ciascuno dei connettori femmina a filo mini sulla scheda adattatore per i canali di ingresso dell'amplificatore.
3. Rimuovere l'insetto con il bordo elettrodo impiantato dalla gabbia quando è in uno stato attivo (durante il suo tempo alba). Posizionare un pezzo di carta velina sotto l'insetto per riposare prima di effettuare le misurazioni.
4. Usando le pinzette, far scorrere la scheda elettrodo nel recettore FFC sulla scheda adattatore. Osservare una linea di base piatta e bassa tensione quando l'insetto è a riposo e la generazione di elettromiografia (EMG) punte come l'insetto sbatte le ali.
   NOTA: fare riferimento alla Sezione 6: Osservare volo degli insetti con il sistema di registrazione senza fili per representative risultati oscilloscopio.
5. Regolare i parametri di visualizzazione dell'oscilloscopio come necessario. Catturare i dati sull'oscilloscopio e salvare i dati.

6. Observing Insetto volo con il sistema di registrazione Wireless

NOTA: Una piattaforma levitazione elettromagnetica può essere costruito per la registrazione wireless di segnali EMG durante tethered volo sexta Manduca. La piattaforma levitazione costituita da un telaio progettato per bilanciare un meccanismo tethering. La levitazione consente al frame, e quindi l'insetto, di imbardata durante la prova senza la costrizione di fili di legatura. Il telaio può essere rapido prototipo utilizzando un Fused Deposition Modeling (FDM) macchina. Un magnete deve essere fissato alla base di questo telaio da sollevare da una serie di magneti nella piattaforma di base. L'insetto è collegato al connettore FFC sospeso dalla parte superiore del telaio. Questa piattaforma levitante si trova all'interno dell'Arena LED che è stato costruito using 60 pannelli composti da una serie di singoli LED 5x7. Questo sistema era basato su metodi stabiliti per lo sviluppo di un ambiente per la stimolazione visiva di frutta mosche ^{15, 16, 17.} L'arena è controllato da un microcontrollore che permette di simulazione sia in senso orario che antiorario di rotazione e il controllo della velocità di rotazione.

1. Impostare il sistema di registrazione wireless collegando il headstage al connettore della scheda adattatore sulla piattaforma levitazione.
2. Rimuovere l'insetto dalla gabbia quando è in uno stato attivo preferibilmente durante il suo tempo di Alba.
3. Usando le pinzette, inserire con attenzione la scheda elettrodo nel recettore FFC sul telaio levitare in modo tale che l'insetto è sospesa saldamente all'interno del setup.
4. Posizionare la bacchetta magnetici vicino l'interruttore magnetico sul headstage per attivare la trasmissione dati senza fili. Una luce blu si accende per indicare che il headstage è attivo.
5. Spegnere le luci inspazio per completa oscurità. Una luce rossa può essere utilizzata per aggiungere illuminazione per la stanza. Aprire il software di raccolta dati di telemetria su un computer e selezionare il file di configurazione precaricata appropriato, se disponibile. Avviare l'acquisizione dati per iniziare segnali di visualizzazione.
6. Selezionare l'interfaccia utente rilevante per l'osservazione dei segnali EMG dal sistema di registrazione wireless per garantire un collegamento ed elettrodo funzionamento wireless affidabile.
7. Accendere tutti i componenti LED Arena: regolamentata alimentazione e microcontrollori DC. Il microcontrollore può regolare i giri al minuto del modello di luce ciclico e può anche controllare la direzione di rotazione della luce.
8. Lentamente bilanciare la piattaforma levitazione all'interno dell'arena. Allineare la cornice di sopra del centro della base levitazione attenzione, altrimenti il ​​frame verrà tirato rapidamente a terra possibilmente ferire l'insetto.
9. Avviare il sistema di registrazione video.
10. Selezionare la scheda di registrazione dedicata del softwareinterfaccia. Designare il tempo di registrazione e file di salvataggio di destinazione. Scegliere le impostazioni di output appropriate per salvare i dati. Fare clic sul pulsante Start per avviare una sessione di registrazione all'interno del software. Ciò salverà il file di dati che può essere importato in ambienti di calcolo numerico.
11. Osservare come l'insetto vola nella direzione che corrisponde con il movimento dei LED. Invertire la direzione dei LED e confermare che l'insetto inverte la direzione. Eseguire questo tutte le volte che lo desideri.

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Risultati

Uno schema della procedura complessiva EMIT è presentato nella figura 1, che mostra le fasi principali del ciclo metamorfico del hawkmoth e le fasi di inserimento dell'elettrodo corrispondenti. L'inserimento dell'elettrodo deve essere eseguita in fase avanzata di pupa 4 a 7 giorni prima della eclosion. Questo permette alle fibre muscolari di sviluppare attorno agli elettrodi e assicurare l'impianto in dell'insetto.

Il risultato tipico di una fase di inse...

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Discussione

Ci sono diversi passaggi critici durante l'inserimento chirurgico degli elettrodi di registrazione che influenzano la capacità di registrare dati nelle fasi successive del protocollo. Gli elettrodi di registrazione devono essere inseriti pupa un giorno dopo esibendo macchie ala sul lato dorsale. Se l'inserimento viene effettuato due o più giorni dopo questo periodo, tessuto dell'insetto non avrà abbastanza tempo per sviluppare intorno e stabilizzare gli elettrodi inseriti. Questo potrebbe portare a movime...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.