곤충 비행 동작 모니터링에 대한 초기 변성 삽입 기술

요약

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

초록

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

서문

전극을 삽입, 심지어 원격 측정 기록 애플리케이션을위한 곤충에 부착 된 전자 시스템으로, 자연 항공 ¹ 동안 얼마나 신경 시스템의 기능을 이해하는 중요한 방법이다. 곤충에 인공 시스템을 연결하거나 이식하는 것은 곤충의 자연 비행을 방해 할 가능성을 포함하는 많은 도전을 제기하고있다. 표면 부착 또는 성인 곤충에 인공 플랫폼의 수술 삽입으로 인해 몸에 의한 관성과 스트레스의 힘에 의해 발생하는 삽입 장치의 가능한 이동에 신뢰할 수없는 것입니다. 표면적으로 부착 또는 외과 적 삽입 전극은 이물질과 곤충에 의해 거부하는 경향이 있습니다. 또한, 주입 작업이 외골격 주위 비늘 및 더미의 제거를 필요로한다. 두꺼운 표피 층은 또한하여 곤충의 자연 비행을 방해하는, 부수적 인 조직 손상을 일으킬 수 외과 신경 분포에 침투해야합니다. 모든 THESE 요인은 수술 또는 피상적 인 주입 작업 도전하고 섬세한 작업을 할 수 있습니다. 외부에서 곤충을 제어 및 감지 시스템을 부착에 관련된 이러한 문제를 완화하기 위해, 변성 성장을 포함하는 새로운 방법이 문서에서 설명한다.

holometabolic 곤충의 변성 개발 중간 번데기 (그림 1)를 가진 성인으로 유충 (또는 님프)의 변화에서 시작한다. 변태 과정은 리모델링 다음에 변성을 포함하는 광범위한 조직의 프로그래밍을 포함한다. 이 변환은 여러 가지 복잡한 행동에게 ^2,3을 보여주는 곤충 어른까지 지상파 유충을집니다.

수술이 초기 변성 단계 ^4,5 중에 수행 된 위치를 극단적 parabiotic 수술 후 곤충의 생존이 입증되었습니다. 이 수술에서 개발 histogenesis의 caus에드 수술 상처가 짧은 기간에 복구 할 수 있습니다. 도전성 전극의 매입이 변성 성장의 초기 단계 (도 1) 동안 수행 된 위치 이러한 관찰에 이어, 새로운 기법이 개발되었다. 이 곤충 ⁶ 생체 역학적 보안 첨부 할 수 있습니다. 신뢰성이 높은 인터페이스는 곤충의 신경 및 신경 근육 시스템 ^7로 고정됩니다. 이 기술은 "초기 변성 삽입 기술"(EMIT) ^8로 알려져있다.

전체 조직 시스템의 재 구축 후, 번데기에 삽입 구조는 성충으로 등장. 비행 근육 그룹은 전체 흉부 신체 질량의 65 %를 구성하고, 따라서, EMIT 절차 ⁹ 상대적으로 편리 대상입니다. 기본 날개 비트 동안 dorsolongitudinal (DL)을 강화하는 비행의 형태와 dorsoventral의 변화는 (DV) 근육 날개 articulat 원인리프트 ^10을 생성하는 이온 형상. 따라서 DL 및 DV 근육의 기능 조정 비행 신경 생리학에서 활발한 연구 주제이다. 전자 프로그램 비주얼 환경에서 테 더링 곤충 복잡한 locomotory 행동 ^{11, 12의} 신경 생리학을 공부하는 가장 일반적인 방법이다. 발광 다이오드의 패널로 구성된 원통형 경기장은 비행 곤충이 중간에 닿는하고 움직임이 동적으로 주변의 탁 트인 시각적 표시를 업데이트하여 시뮬레이션이 가상 현실 환경에서 사용되어왔다. 이러한 초파리 초파리 작아 곤충의 경우, 테 더링은 곤충의 등쪽 흉부에 금속 핀을 부착하고, 영구 자석 ^{(13, 14)} 아래에 핀을 배치함으로써 달성된다. 이 방법은 모든 전기 생리학 분석없이 고속 카메라와 시각적 인 관찰을 통해 모터 응답을 정량화 할 수 있습니다. 또한,이 메타OD는 만두 카의 sexta의 크고 무거운 몸을 중단하는 것은 비효율적이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 바닥에 부착 된 자석은 전자기력을 통해 공중에 뜨게됩니다와 경량 프레임 자석으로 공중에 뜨게 프레임에서 혜택을. 상업적으로 이용 가능한 신경 증폭기 및 LED 어레이와 함께 사용하면,이 비행 모터 출력을 제어하고 만두 카의 sexta의 관련 전기 생리학을 기록 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

참고 : 프로토콜을 수행하는 데 필요한 재료 및 시약의 출처는 아래의 "시약"표에 나와 있습니다.

1. 기록 전극의 연결을 위해 인쇄 회로 기판 (PCB)을 준비

주 : 실제 실험 절차를 제공하기 위해, 와이어 전극은 FFC (유연한 플랫 케이블) 커넥터에이 전극을 삽입하는 PCB에 납땜되어 있습니다.

1. 동박 적층 필름의 0.5x5의 cm ² 조각을 잘라.
2. 좋은 팁 마커를 사용하여 마스크 패턴을 에칭으로 세 0.1x5cm ² 사각형 패드를 그립니다.
3. 통풍 또는 흄 후드 내부의 PCB 에칭 제를 사용하여 노출 된 라미네이트 에칭. 비 반응성 테이프로 라미네이트 컷 아웃의 길이 약 1 ㎝를 커버. PCB 에칭 및 테이프 스카치 테이프로 졸업 비커 내부에 구리 라미네이트 컷 아웃의 최소 100 ㎖로 졸업 비커를 입력합니다. 구리 라미네이트 cutou의 절반t는 PCB 에칭에 빠져들해야합니다.
4. 20 분 동안 회전 플랫폼에서 비커를 놓습니다.
5. 에칭에서 컷 아웃을 제거하고 10 분 동안 물이 가득 비커에 넣습니다.
6. 티슈 페이퍼를 사용하여, 이소 프로필 알코올을 적용하고 비 에칭 된 구리 패드를 노출하는 표시를 제거한다.
7. 약 1cm 긴 작은 사각형으로 인쇄 회로 기판을 잘라.
8. 3cm 각각의 길이에 날카로운 칼날을 사용하여 코팅, 어닐링, 스테인레스 스틸 와이어의 두 조각 (베어 0.11 "0.008, 코팅")를 잘라. 스테인레스 스틸 와이어의이 조각은 곤충의 흉부에 삽입됩니다 활성 전극이다.
9. 블레이드를 사용하여 각 와이어의 양쪽 끝에서 플라스틱 코팅 4 ~ 5 밀리미터를 제거합니다. 현미경의 사용을 권장합니다.
10. 접지 전극을위한 팁 확장을 만들 절연 스테인레스 스틸 와이어의 한 0.7 cm의 조각을 잘라. 부드럽게 블레이드 코팅을 제거하거나 납땜 적외선의 열로 녹여같은 단계 1.9에서 수행에.
11. 접지 연결의 경우, 4.5 cm의 길이로 유연한 (리츠 또는 인덕터) 와이어의 한 조각을 잘라.
12. 단계 1.11에서 제조 된 접지 와이어에 단계 1.10에서 제조 된 스테인레스 스틸의 0.7 cm 조각을 납땜. 노출 스텐레스 팁은 접지 연결의 끝에 있어야한다.
13. 단단히 비 반응성 테이프를 사용하여 납땜 작업 영역에 준비된 전극 기판을 테이프입니다. 전극은 납땜됩니다위원회에 패드를 제외한 모든 1-2mm을 마스크 테이프를 사용합니다. 패드의이 마스크, 솔더없는 최종 단계 4.1에 설명 된 FFC 커넥터에 삽입됩니다.
14. 각각의 일단이 전극 기판상의 대응하는 패드들에 납땜 될 수 있도록 세 개의 전극 와이어를 정렬. 쉽게 납땜 전극 패드를 통해 스테인리스 플럭스를 적용합니다.
15. 패드에 노출 된 전극의 각 납땜.
16. 10 분 동안 아세톤, 이소 프로필 알코올에 전극을 담가각 솔더 잔류 물을 청소합니다. 초음파 욕의 사용은 청소 성능을 향상시킨다.

만두 카 Sexta 번데기 2. 외과 삽입

주 : 곤충은 낮과 밤 사이의 전환시 가장 활성화됩니다. 따라서 인공 주 / 야 사이클은 자동 배출 타이머를 사용하여 곤충 챔버 내에 설치되어야한다. 이들은 7 시간의 어두운 17 시간 조명주기를 시뮬레이션하도록 설정해야합니다.

1. 적절한 삽입 시간을 결정하기 위해 매일 만두 카의 sexta 번데기를 검사합니다. 번데기가 날개는 어두운 점이 전시 후 약 1 일 삽입을위한 준비가되어 있습니다.
2. 번데기를 마취하기 위해 약 6 시간 동안 냉장고 (4C)에 배치합니다.
3. 삽입 작업 공간을 준비합니다. 작업 공간은 이소 프로필 알코올, 날카로운 핀셋, 블레이드 및 30 G 피하 주사 바늘을 포함해야합니다. 옵션으로, 시아 노 아크릴 레이트 접착제는 전극 고정을 보강하기 위해 사용될 수있다.
4. 으로 그들을 찍기 또는 이소 프로필 알코올로 닦아 바늘, 핀셋, 그리고 전극을 소독.
5. 냉장고에서 번데기를 제거하고 작업 영역에 전송할 수 있습니다.
6. 관심의 근육 그룹에 해당하는 가슴의 위치를​​ 결정합니다. 이 예에서 작업의 초점은 날개 업 스트로크 운동을 담당하는 dorsoventral 근육이다.
7. 날카로운 칼날을 사용하여 부드럽게 exocutical 층을 1 × 1 cm ² 사각형에 상처. 핀셋을 사용하여, 천천히이 조각을 벗긴다.
8. (선택 사항) 가슴의 노출 된 지역에서 날개 머리를 제거하기 위해 진공을 사용합니다.
9. 천천히 날개 근육 그룹을 대상으로 두 삽입 지점을 생성하기 위해 가슴에 부착를 mesothorax에 약 5mm 바늘을 삽입합니다.
10. 핀셋을 사용하여,이 삽입 점에 개의 기록 전극을 안내.
11. (선택 사항) 전극 주위에 머리를 청소, 기계적인 내구성을 향상시키기 위해아낌없이 와이어 도포와 흉부에 각각 삽입 지점 주변에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다.
12. 곤충 출현에 오를 수 있도록 벽과 천장을 덮고 적절한 재료 (거친 질감)와 함께 출현 케이지를 준비합니다. 천공 된 골판지 상자 또는 포장지를 사용할 수있다.
13. 약 6 cm 길이 2 ㎜의 단단한 고정 스틱을 준비합니다. 성형 교반기, 면봉 또는 금속선이 단계에 사용될 수있다.
14. 조심스럽게 튀어 나온 코 아래에있는 구멍을 통해이 막대기를 밀어 넣습니다.
15. 번데기가 굴러 할 수 있도록 케이지의 표면에 스틱의 양쪽을 고정합니다. 를 mesothorax이 위를 향하도록 케이지 내부의 번데기를 배치합니다. 광범위한 운동은 체액의 전극에 손상을 야기하거나 삽입 쓸모 없게있다.

3. 만두 카 Sexta에 접지 전극을 삽입

참고 : 접지 (참조줬어) 전극은, 신호 결합을 방지하기 위해 흉부 나 복부 원위 부분에 삽입되어야한다. 이 삽입 번데기 개발의 나중 단계에서 또는 곤충이 출현 한 후 하나를 수행 할 수 있습니다. 접지 전극 용 창 번데기 또는 성인 스테이지 접지 전극 삽입을 위해 어느 번데기 단계에서 제조되어야한다.

1. 번데기를 삽입하는 경우 : 활성 전극 주위에 mesothoracic 표피의 박리 후 (단계 2.7 참조), exocutical 층을 통해 또 다른 사각형을 긁지 30 G의 피하 주사를 사용하여 가까운 가슴의 등쪽 복부에 (0.5x0.5 약 cm ²⁾ 바늘. 섹션 2에 기재된 기술을 이용하여이 윈도우에 접지 전극을 삽입한다.
2. 성인 무대 접지 전극 삽입 : 곤충이 등장했다하면 0108 6-24 시간 동안 4 ° C의 냉장고에 넣습니다.
   나머지 단계는 번데기 성인 스테이지 삽입 모두 동일하다.
3. inser 준비 이소 프로필 알코올, 날카로운 핀셋, 30 G 피하 주사 바늘, 시아 노 아크릴 레이트 접착제, 접착제의 응용 프로그램에 대한 와이어의 조각, 열 cauterizer (선택), 그리고 치과 왁스 스틱 (선택 사양) 등의 기의 작업 공간.
4. 약 1-2cm 멀리 뒤 복부를 따라 기록 전극에서 삽입 지점을 찾습니다.
5. 천천히 복부를 찔린 삽입 사이트를 제공하기 위해 바늘을 삽입합니다.
6. 핀셋을 사용하여주의 깊게 삽입 부위에 접지 전극을 삽입하고 깊은 3-4mm 때까지 압력을 적용한다. 장소에 전극을 잡고 삽입 부위 주변에 접착제를 적용하기 위해 와이어를 사용합니다.
7. (선택 사항), 기계적 강도를 향상 cauterizer 열을 사용하고 끝 부분에 왁스의 작은 (2-3 ㎜) 비드를 수집한다. 삽입 부위에 가까운 팁을 놓고 왁스 전극을 둘러싸고 자리에 단단하게 보유하고 있음을 열는 적용됩니다.

어댑터 보드의 4. 준비

"ontent> NOTE :. 어댑터 보드는 FFC (평면 연성 케이블) 커넥터를 통해 무선 기록 headstage으로 전극 기판을 연결하는 데 필요한이 경우, 전극 기판과 유사한 판 다음에 의해 제조 될 필요가 1.7 1.1 단계 .

1. 제조 된 기판의 일단에 FFC 커넥터 납땜.
2. 다른 쪽 끝에서 세 패드에 와이어를 연결 세 30 AWG (미국 전선 게이지) 납땜.
3. 다음 단계에 설명 된대로 오실로스코프 판독 용 어댑터 보드에있는 세 개의 패드에 세 미니 커넥터를 납땜한다.
4. headstage 커넥터에 이들 3 개의 와이어의 다른 쪽 끝을 납땜한다.
5. 부상 프레임의 상단에 headstage 회로 기판을 고정합니다.

5. 오실로스코프 (선택 사항)와 패스트 촬영

NOTE : 전극의 신뢰성을 평가하고, 신호 대 잡음비를 관찰하기 위해, 테더 오실로스코프 녹음 wirel를 배포하기 전에 획득 될 수있다ESS 기록 시스템. 어댑터 보드의 미니 와이어 커넥터이 사용되어야합니다.

1. 세포 신경 기록 앰프 오실로스코프를 연결합니다. 1 Hz에서 20 kHz의 저역 통과 차단 주파수, 및 (100)의 이득의 고역 통과 차단 주파수 증폭기 매개 변수를 설정.
2. 증폭기 입력 채널 어댑터 보드 여성 소형 와이어 커넥터의 각각을 연결한다.
3. 그것은 (그 새벽 시간 동안) 활성 상태에있을 때 케이지에서 주입 전극 판으로 곤충을 제거한다. 측정을 수행하기 이전에 휴식을 위해 곤충에서 조직 종이를 놓습니다.
4. 핀셋을 사용하여, 어댑터 보드에 FFC 수용체에 전극 판을 밀어. 곤충은 휴식 때 평평하고 낮은 전압 기준을 관찰하고 곤충이 날개를 펄럭로 근전도 (EMG)의 생성 스파이크.
   참고 : representat의 무선 녹음 시스템을 관찰 곤충 비행 : 6 절오실로스코프 결과를 필자.
5. 필요한 오실로스코프의 뷰잉 파라미터를 조정한다. 오실로스코프의 데이터를 캡처하고 데이터를 저장합니다.

무선 녹음 시스템 6. 관측 곤충 비행

참고 : 전자 공중 부양 플랫폼이 닿는 만두 카의 sexta 비행하는 동안 EMG 신호의 무선 기록에 구축 할 수 있습니다. 공중 부양 플랫폼은 테 더링 메커니즘의 균형을 위해 설계된 프레임으로 구성되어 있습니다. 부상은 프레임, 따라서 곤충, 테 더링 와이어의 제약없이 테스트 기간 동안 침로 할 수 있습니다. 프레임은 융착 모델링 (FDM) 시스템을 사용하여 신속한 프로토 타입이 될 수 있습니다. 자석베이스 플랫폼 마그넷 일련 부양 될 수이 프레임의 바닥에 부착 될 필요가있다. 곤충은 프레임의 상부에서 중단 FFC 커넥터에 접속된다. 이 공중에 뜨게하는 플랫폼은저기서 건설 된 LED 경기장의 내부에 위치5X7 개개의 LED의 어레이로 구성된 60 g 패널. 이 시스템은 ^{15, 16, 17} 파리 과일의 시각적 자극을위한 환경을 개발하기위한 설정 방법을 기반으로했다. 아레나는 시계 방향과 반 시계 방향의 회전뿐만 아니라, 회전 속도의 제어의 양쪽 마이크로 있도록 시뮬레이션에 의해 제어된다.

1. 공중 부양 플랫폼에서 어댑터 보드 커넥터에 headstage를 연결하여 무선 녹음 시스템을 설정합니다.
2. 그것 새벽 시간 동안 바람직하게는 활성 상태에있을 때 케이지에서 곤충을 제거한다.
3. 핀셋을 사용하여 조심스럽게 곤충이 설정 내에서 확실하게 정지되도록 공중에 뜨게 프레임 FFC 수용체에 전극 판을 삽입합니다.
4. 무선 데이터 전송을 활성화 headstage에 자석 스위치 근처에 자기 지팡이를 놓습니다. 푸른 빛이 headstage가 활성화되었다는 것을 의미에 올 것이다.
5. 의 불을 끄고완전한 어둠에 대 한 방입니다. 적색 램프 방에 조명을 추가하는데 사용될 수있다. 컴퓨터에서 원격 측정 데이터 수집 소프트웨어를 열고 제공되는 경우 적절한 사전로드 된 구성 파일을 선택합니다. 시각 신호를 시작하기 위하여 데이터 수집을 시작합니다.
6. 신뢰할 수있는 무선 연결 및 전극 작동을 보장하기 위해 무선 녹음 시스템에 EMG 신호의 관찰에 대한 관련 사용자 인터페이스를 선택합니다.
7. 규제 DC 전원 공급 장치 및 마이크로 컨트롤러 : 모든 LED 아레나 구성 요소의 전원을 켭니다. 마이크로 컨트롤러는 환상 빛 패턴의 분당 회전 수를 조절할 수 있고, 또한 광 회전 방향을 제어 할 수있다.
8. 천천히 경기장 내에서 공중 부양 플랫폼을 균형. 주의 부상베이스의 중심 위의 프레임, 그렇지 않으면 프레임이 가능 곤충을 손상 땅에 신속하게 뽑아됩니다 맞 춥니 다.
9. 비디오 레코딩 시스템을 시작합니다.
10. 소프트웨어의 관련 기록 탭을 선택합니다인터페이스를 제공합니다. 녹화 시간을 지정하고 대상 저장 파일. 데이터를 저장하기 위해 적절한 출력 설정을 선택합니다. 소프트웨어 내에서 기록 세션을 시작하려면 시작 버튼을 클릭합니다. 이 수치 컴퓨팅 환경으로 가져올 수있는 데이터 파일을 저장합니다.
11. 곤충 LED의 움직임에 대응하는 방향으로 날아간로 관찰한다. LED의 방향을 반대로하고 벌레가 방향을 반대로 확인합니다. 원하는대로이에게 여러 번 수행합니다.

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결과

전체적인 EMIT 절차의 개략은 hawkmoth의 변성 사이클 및 대응 전극 삽입 단계에서 주요 단계를 보여주는,도 1에 제시된다. 전극 삽입 4~7일 우화하기 전에 후반 번데기 단계에서 수행해야합니다. 이 근육 섬유 전극 주위에 개발하고 곤충에 임플란트를 고정 할 수 있습니다.

이 활성 전극과 접지 전극이 삽입 된 완성 늦은 번데기 삽입의 전형적인 결과는도 2에

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토론

프로토콜의 나중 단계에서 데이터를 기록 할 수있는 능력에 영향을주는 기록 전극 외과 삽입하는 동안 몇개의 중요한 단계가있다. 기록 전극은 등쪽에 날개 반점을 나타내는 후 번데기 일일에 삽입해야합니다. 삽입이 두 개 이상의 일이 시간 이후에 수행하면, 곤충의 조직에 삽입 된 전극의 주위에 개발하고 안정화 할 수있는 충분한 시간이 없습니다. 이는 성인 무대에 전극을 이식하고 신뢰할 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.