Début d'insertion de technologie métamorphique des insectes Vol surveillance des comportements

Résumé

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Résumé

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Introduction

Insérant des électrodes, même avec des systèmes électroniques attachés aux insectes pour les applications d'enregistrement télémétrique, a été une des principales méthodes pour comprendre le fonctionnement des systèmes neuronaux pendant le vol naturel ^1. Fixation ou l'implantation des systèmes artificiels chez les insectes a posé de nombreux défis concernant le potentiel de perturber le vol naturel de l'insecte. Attachement superficiel ou l'insertion chirurgicale de plates-formes artificielles sur l'insecte adulte ne sont pas fiables en raison de possible déplacement des dispositifs insérés causés par inertie et le stress induit par les forces du corps. Superficiellement attachés ou électrodes chirurgicalement insérés sont également sujettes à être rejeté par les insectes comme un corps étranger. En outre, l'opération d'implantation nécessite le retrait d'échelles et des piles autour de l'exosquelette. La couche de cuticule épaisse doit également être pénétré pour innervation chirurgicaux qui pourraient causer des dommages tissulaires collatéraux, interférant ainsi avec le vol naturel de l'insecte. Tous les tfacteurs es peuvent faire une opération chirurgicale d'implantation ou superficielle une tâche difficile et délicate. Afin de pallier ces problèmes impliqués dans la fixation à l'extérieur des systèmes de contrôle et de détection pour les insectes, une nouvelle méthodologie impliquant une croissance métamorphique sera décrit dans cet article.

Le développement métamorphique des insectes holométaboles commence par la transformation de la larve (ou nymphe) dans un adulte avec un stade de pupe intermédiaire (Figure 1). Le processus de métamorphose implique une reprogrammation étendue des tissus, y compris la dégénérescence suivie par remodelage. Cette transformation transforme une larve terrestre à un insecte adulte démontrant plusieurs comportements complexes ^2,3.

La survie des insectes après les chirurgies parabiotic extrêmes a été démontré où les opérations ont été réalisées au cours des phases précoces métamorphiques ^4,5. Dans ces chirurgies, les caus de histogénèse développementplaies chirurgicales ed à être réparés dans des durées plus courtes. Suite à ces observations, une nouvelle technique a été développée où l'implantation d'électrodes conductrices de l'électricité a été réalisée au cours des premiers stades de la croissance métamorphique (figure 1). Cela permet une fixation sécurisée biomécanique sur l'insecte ^6. Une interface très fiable est également fixé avec de neurones de l'insecte et systèmes neuromusculaires ^7. Cette technique est connue comme "Early Métamorphose Technology Insertion" (EMIT) ^8.

Après la reconstruction du système de tissu ensemble, les structures insérées dans la pupe émergent à l'insecte adulte. groupes de muscles de vol font jusqu'à 65% de la masse totale du corps thoracique et, par conséquent, est une cible relativement commode pour la procédure EMIT ^9. Au cours de la battement d'ailes de base, les changements dans la morphologie du vol alimenter dorsolongitudinal (dl) et la dorso-ventral (DV) muscles provoquent la Articulat de l'ailela géométrie d'ions pour générer une portance ^10. Par conséquent, la coordination fonctionnelle de dl et dv muscles a été un sujet de recherche actif sous vol neurophysiologie. insectes attachés dans des environnements visuels programmés électroniquement a été la méthode la plus courante pour l'étude de la neurophysiologie des comportements locomoteurs complexes ^11,12. Arènes cylindrique composé de panneaux émettant de diode ont été utilisés pour ces environnements de réalité virtuelle, où les insectes volants sont attaché dans le milieu et le mouvement est simulé par la mise à jour dynamiquement l'affichage visuel panoramique environnante. Dans le cas de petits insectes, tels que la mouche des fruits Drosophila, l'attache est réalisée par fixation d'une tige de métal sur le thorax dorsal des insectes et en plaçant la tige sous un aimant permanent ^13,14. Cette méthode ne permet que la quantification des réponses motrices grâce à des observations visuelles avec des caméras à haute vitesse sans analyse électrophysiologique. De plus, cette méthod a été inefficace de suspendre le corps grand et plus lourd de Manduca sexta. Pour résoudre ce problème, nous avons bénéficié de cadres magnétique lévitation où léger frames avec des aimants attachés à leur fond sont en lévitation par des forces électromagnétiques. Lorsqu'il est combiné avec des amplificateurs de neurones disponibles dans le commerce et les réseaux de DEL, cela fournit une plate-forme à la sortie de contrôle en vol moteur et enregistrer l'électrophysiologie liés de Manduca sexta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

NOTE: La source des matériaux et des réactifs nécessaires pour suivre le protocole est fourni dans le tableau «Réactifs» ci-dessous.

1. Préparation cartes de circuits imprimés (PCB) pour l'enregistrement de l'électrode de connexion

NOTE: Afin de fournir une procédure expérimentale pratique, fils-électrodes sont soudées à une carte à insérer ces électrodes dans un connecteur FFC (câble plat flexible).

1. Coupez un 0.5x5 cm ² morceau de stratifié recouvert de cuivre.
2. L'utilisation d'un marqueur à pointe fine, tirer trois plaquettes 0.1x5cm ² rectangle que la gravure des motifs de masques.
3. Graver le stratifié exposé en utilisant un agent de gravure de PCB dans un endroit bien ventilé ou hotte. Couvrir d'environ 1 cm de la longueur de la découpe du stratifié avec du ruban adhésif non réactif. Remplir un gobelet gradué avec au moins 100 ml de gravure de circuits imprimés et la bande de la découpe du stratifié de cuivre à l'intérieur du gobelet gradué avec du scotch. La moitié de la cutou stratifié de cuivret doit être immergé dans la solution de gravure de circuits imprimés.
4. Placer le bêcher sur une plateforme rotative pendant 20 minutes.
5. Retirez la découpe de la gravure et le placer dans un bécher rempli d'eau pendant 10 min.
6. L'utilisation d'un papier de soie, appliquer de l'alcool isopropylique et enlever les marques d'exposer les plaquettes de cuivre non gravées.
7. Couper la carte de circuit imprimé en petits carrés d'environ 1 cm de long.
8. Coupez deux morceaux de fil enduit, recuit, acier inoxydable (0,11 "revêtus, 0.008" nus) à l'aide d'une lame tranchante à des longueurs de 3 cm chaque. Ces morceaux de fils en acier inoxydable sont des électrodes actives qui seront insérés dans le thorax de l'insecte.
9. En utilisant une lame, enlever 4-5 mm de la couche de matière plastique à partir de chaque extrémité de chaque fil. Utilisation d'un microscope est recommandée.
10. Coupez un morceau de 0,7 cm de fil d'acier inoxydable isolé pour créer une extension de pointe pour l'électrode de masse. Retirez délicatement le revêtement avec une lame ou faire fondre avec la chaleur d'un ir à soudersur comme réalisé à l'étape 1.9.
11. Pour la connexion à la terre, couper un morceau de flexible (Litz ou inducteur) fil à une longueur de 4,5 cm.
12. Soudez le 0,7 cm pièce d'acier inoxydable préparé à l'étape 1.10 au fil de mise à la terre préparée à l'étape 1.11. Une pointe en acier inoxydable exposé doit être à la fin de la connexion à la terre.
13. Tape le panneau d'électrode préparée fermement à l'espace de travail de soudure en utilisant une bande non-réactive. Utilisez le ruban à masquer tout mais 1-2 mm des plots sur la carte où les électrodes seront soudés. Cette extrémité masqué, sans soudure des plots sera inséré dans le connecteur FFC décrit à l'étape 4.1.
14. Aligner les trois fils d'électrode de telle sorte que l'une des extrémités de chaque peut être soudé aux plots correspondants sur le panneau d'électrode. Appliquer le flux d'acier inoxydable pour les plots d'électrodes pour faciliter la soudure.
15. Soudez chacune des électrodes exposées sur les plaquettes.
16. Plonger les électrodes dans de l'acétone et de l'alcool isopropylique pendant 10 minchacun de nettoyer les résidus de soudure. Utilisation d'un bain à ultrasons permet d'améliorer la performance de nettoyage.

2. L'insertion chirurgicale au Manduca sexta pupes

NOTE: Les insectes seront plus actifs pendant les transitions entre le jour et la nuit. Par conséquent, un cycle jour / nuit artificielle doit être établie dans une chambre d'insectes en utilisant des minuteries automatiques de sortie. Ceux-ci devraient être définis pour simuler un sombre 7 h et 17 cycle de la lumière h.

1. Examinez la sexta pupes Manduca quotidienne pour déterminer un temps d'insertion approprié. Les nymphes sont prêts pour l'insertion d'environ un jour après les ailes présentent des taches sombres.
2. Pour anesthésier les nymphes, les placer dans le réfrigérateur (4C) pour environ 6 heures.
3. Préparer l'espace de travail d'insertion. L'espace de travail doit inclure l'alcool isopropylique, des pincettes tranchants, lames, et une aiguille hypodermique G 30. En option, un adhésif à base de cyanoacrylate peut être utilisée pour améliorer la fixation de l'électrode.
4. Stériliser l'aiguille, une pince à épiler, et les électrodes en les trempant dans ou essuyage avec de l'alcool isopropylique.
5. Retirer la nymphe du réfrigérateur et de le transférer à l'espace de travail.
6. Déterminer l'emplacement sur le thorax qui correspond au groupe de muscles de l'intérêt. L'objectif du travail dans cet exemple est les muscles dorso-ventral responsables de mouvement de course vers le haut de l'aile.
7. En utilisant une lame tranchante, grattez doucement un 1x1 cm ² rectangle à travers la couche exocutical. Utilisation de la pince à épiler, retirez lentement ces pièces.
8. (Facultatif) Utilisez un aspirateur pour enlever les poils de l'aile de la région exposée du thorax.
9. Insérer l'aiguille lentement, environ 5 mm dans le mesothorax où les ailes attachent au thorax de créer deux points d'insertion visant le groupe de muscles.
10. En utilisant des pinces, de guider les deux électrodes d'enregistrement dans les deux points d'insertion.
11. (Facultatif) Pour améliorer la durabilité mécanique, nettoyer les poils autour des électrodeset appliquer généreusement adhésif cyanoacrylate autour de chaque point d'insertion sur le thorax avec un applicateur de fil.
12. Préparer une cage pour l'émergence d'un matériau approprié (rugueux et texturé) couvrant les murs et le plafond de sorte que l'insecte peut monter sur l'émergence. Des boîtes de carton ou de papier perforées d'emballage peuvent être utilisés.
13. Préparer une fixation rigide avec bâton longueur d'environ 6 cm et d'un diamètre de 2 mm. Palettines, un tampon de coton ou des fils de métal peuvent être utilisées pour cette étape.
14. Faites glisser délicatement ce bâton dans le trou sous la trompe en saillie.
15. Fixer les deux côtés de la baguette sur la surface de la cage de telle sorte que la chrysalide ne peut pas rouler. Placez la pupe à l'intérieur de la cage de telle sorte que la mesothorax est orientée vers le haut. Vaste mouvement peut causer des dommages à l'électrode, la perte d'hémolymphe, ou de rendre l'insertion inutile.

3. Insertion de la électrode de masse en Manduca sexta

NOTE: Le rez-de (voirrence), l'électrode doit être inséré dans les parties de l'abdomen ou du thorax distales pour éviter le couplage de signal. Cette insertion peut se faire soit au cours des étapes ultérieures du développement nymphal ou après l'insecte émerge. La fenêtre de l'électrode de masse doit être préparé au stade de pupe, soit pour une pupe ou insertion d'électrode de masse stade adulte.

1. Pour l'insertion de pupe: après l'épluchage de la cuticule mésothoracique autour de l'électrode active (voir l'étape 2.7), rayer un autre rectangle à travers la couche exocutical (environ 0.5x0.5 cm ²⁾ sur l'abdomen dorsal proche du thorax à l'aide du G 30 hypodermique aiguille. Insérez l'électrode de masse dans cette fenêtre en utilisant la technique décrite dans l'article 2.
2. Pour adultes insertion d'électrode de terre de stade: une fois l'insecte a émergé, le placer dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 6 à 24 heures pour immobiliser.
   Les étapes restantes sont les mêmes pour les deux pupe et insertions en scène des adultes.
3. Préparer l'insertion espace de travail tion, y compris l'alcool isopropylique, pinces acérées, un G aiguille hypodermique 30, colle cyanoacrylate, un morceau de fil pour l'application de la colle, une cauterizer thermique (en option), et un bâton de cire dentaire (facultatif).
4. Localiser un point d'insertion d'environ 1-2 cm des électrodes d'enregistrement le long de l'abdomen postérieur.
5. Introduire lentement l'aiguille pour perforer l'abdomen et de fournir un site d'insertion.
6. En utilisant des pinces insérer soigneusement l'électrode de masse dans le site d'insertion et appliquer une pression jusqu'à ce qu'il soit 3-4 mm de profondeur. Tenir l'électrode en place et utiliser un fil à appliquer de la colle autour du site d'insertion.
7. (Facultatif) Pour améliorer la résistance mécanique, utilisez le cauterizer thermique et de recueillir un petit (2-3 mm) cordon de cire à l'extrémité. Placez la pointe à proximité du site d'insertion et appliquer de la chaleur tels que la cire entoure l'électrode et le maintient fermement en place.

4. Préparation du Conseil Adaptateur

ontenu "> NOTE:. Une carte adaptateur est nécessaire pour connecter le panneau d'électrode à la headstage d'enregistrement sans fil via un FFC (Flat Flexible Cable) connecteur Pour cela, un conseil similaire à la carte de l'électrode doit être préparé en suivant les étapes 1.1 à 1.7 .

1. Soudez un connecteur FFC à une extrémité de la planche préparé.
2. Soudez les trois 30 AWG (de American Wire Gauge) brancher les fils à trois plots sur l'autre extrémité.
3. Soudez trois connecteurs mini pour les trois plots sur la carte de l'adaptateur pour des lectures de l'oscilloscope comme décrit dans l'étape suivante.
4. Souder l'autre extrémité de ces trois fils au connecteur headstage.
5. Fixez le circuit de headstage sur le dessus du cadre de lévitation.

5. Préenregistrement avec l'oscilloscope (Facultatif)

NOTE: Afin d'évaluer la fiabilité des électrodes et observer le signal par rapport au bruit, les enregistrements de l'oscilloscope captifs peuvent être obtenues avant de déployer le Wirelsystème d'enregistrement ess. Les mini-connecteurs de fils sur la carte de l'adaptateur doivent être utilisés pour cela.

1. Connectez l'oscilloscope à un amplificateur d'enregistrement neuronal extracellulaire. Réglez les paramètres de l'amplificateur à un passe-haut de fréquence de coupure de 1 Hz, un passe-bas de fréquence de coupure de 20 kHz, et un gain de 100.
2. Connectez chacun des mini connecteurs de fils femelles sur la carte adaptateur à des canaux d'entrée de l'amplificateur.
3. Retirer l'insecte avec le conseil de l'électrode implantée dans la cage quand il est dans un état actif (pendant son temps de l'aube). Placez un morceau de papier de soie sous l'insecte pour qu'il repose sur avant les mesures sont prises.
4. L'aide de pinces, faites glisser le bord de l'électrode dans le récepteur FFC sur la carte adaptateur. Observer une référence de tension plat et bas lorsque l'insecte est au repos et à la génération de l'électromyogramme (EMG) des pointes comme l'insecte bat des ailes.
   REMARQUE: Reportez-vous à la section 6: Observer vol d'insecte avec le système d'enregistrement sans fil pour représentative résultats de l'oscilloscope.
5. Ajuster les paramètres d'affichage de l'oscilloscope en fonction des besoins. Capturez les données sur l'oscilloscope et sauvegarder les données.

6. D'observation des insectes de vol avec le système d'enregistrement sans fil

REMARQUE: Une plate-forme de lévitation électromagnétique peut être construit pour l'enregistrement sans fil de signaux EMG pendant captif vol sexta Manduca. La plate-forme de lévitation est constitué d'un châssis conçu pour équilibrer un mécanisme d'attache. La lévitation permet à l'image, et par conséquent l'insecte, à lacet lors des essais sans la contrainte des fils d'attache. Le cadre peut être rapide-prototype utilisant une modélisation par dépôt en fusion (FDM) de la machine. Un aimant a besoin d'être fixée à la partie inférieure de ce châssis à sustentation par une série d'aimants dans la plate-forme de base. L'insecte est connecté au connecteur FFC suspendu à la partie supérieure du cadre. Cette plate-forme de lévitation est situé à l'intérieur de l'arène LED qui a été construit using 60 panneaux composés d'un réseau de 5x7 LED individuelles. Ce système était basé sur des méthodes établies pour l'élaboration d'un environnement pour la stimulation visuelle de mouches des fruits ^{15, 16, 17.} L'arène est commandé par un microcontrôleur de simulation permettant à la fois dans le sens horaire et la rotation dans le sens antihoraire ainsi que le contrôle de la vitesse de rotation.

1. Mettre en place le système d'enregistrement sans fil en connectant le headstage au connecteur de la carte de l'adaptateur sur la plate-forme de lévitation.
2. Retirer l'insecte de la cage quand elle est dans un état actif, de préférence au cours de son temps de l'aube.
3. Aide de pincettes, insérez avec précaution le panneau d'électrode dans le récepteur FFC sur le cadre de lévitation tels que l'insecte est suspendu fermement dans la configuration.
4. Placez la baguette magnétique près de l'interrupteur magnétique sur le headstage pour activer la transmission de données sans fil. Une lumière bleue s'allume indiquant que le headstage est actif.
5. Éteignez les lumières dans lasalle de l'obscurité complète. Une lampe rouge peut être utilisé pour ajouter de l'éclairage de la pièce. Ouvrez le logiciel de collecte des données de télémétrie sur un ordinateur et sélectionnez le fichier de configuration préchargés appropriée le cas échéant. Lancement de l'acquisition de données pour commencer signaux de visualisation.
6. Sélectionnez l'interface utilisateur concerné pour l'observation des signaux EMG sur le système d'enregistrement sans fil pour assurer une opération de connexion et l'électrode sans fil fiable.
7. Mettez tous les composants LED Arena: alimentation régulée et microcontrôleurs DC. Le microcontrôleur peut ajuster les rotations par minute du motif de lumière cyclique et peut aussi contrôler la direction de la rotation de la lumière.
8. Équilibrer lentement la plate-forme de lévitation dans l'arène. Alignez le cadre au-dessus du centre de la base de sustentation soin, sinon le cadre est tirée brusquement au sol peut nuire à l'insecte.
9. Amorcer le système d'enregistrement vidéo.
10. Sélectionnez l'onglet d'enregistrement pertinente du logicielinterface. Désigner le temps d'enregistrement et fichier de sauvegarde destination. Choisissez les paramètres de sortie appropriées pour sauvegarder les données. Cliquez sur le bouton de démarrage pour lancer une session d'enregistrement dans le logiciel. Cela permettra d'économiser du fichier de données qui peut être importé dans un environnement de calcul numérique.
11. Observer que l'insecte vole dans la direction qui correspond au mouvement des LED. Inverser le sens de la LED et de confirmer que l'insecte change de direction. Effectuez cette autant de fois que souhaité.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Un schéma de la procédure globale d'EMIT est présenté dans la figure 1, montrant les principales étapes du cycle métamorphique du sphinx et les étapes d'insertion d'électrode correspondantes. L'insertion de l'électrode doit être effectuée au stade de chrysalide fin 4 à 7 jours avant l'éclosion. Ceci permet aux fibres musculaires à développer autour des électrodes et de fixer l'implant dans l'insecte.

Le résultat typique d'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Il existe plusieurs étapes critiques au cours de l'insertion chirurgicale d'électrodes d'enregistrement qui affectent la capacité d'enregistrer des données dans les étapes ultérieures du protocole. Les électrodes d'enregistrement doivent être insérés dans la pupe un jour après présentant des taches d'aile sur sa face dorsale. Si l'insertion est effectuée deux jours ou plus après cette heure, les tissus de l'insecte n'aura pas assez de temps pour se développer autour et ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.