Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Resumen

Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos.

Resumen

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) ¹ fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI.

En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una "pendiente de las laderas" complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.

Introducción

La organización espacio-temporal de cuatro dimensiones y la movilidad lateral de proteínas de membrana de plasma están fuertemente regulados y pueden desempeñar un papel en la función de la proteína, la actividad y de las interacciones proteína-proteína. Difusión lateral de las proteínas de la membrana plasmática, que tradicionalmente se ha estudiado mediante el cálculo de los coeficientes de difusión de las partículas individuales de time-lapse de punto cuántico o teñir las proteínas de membrana plasmática etiquetados ^2-4. Este enfoque requiere la inserción de una etiqueta extracelular en la proteína de la membrana de plasma de punto cuántico o tinte de etiquetado, lo que puede comprometer plegado y función de las proteínas y, por tanto, no pueden ser alcanzados para algunas proteínas. El volumen estérico de un punto cuántico se ha demostrado que reducir la velocidad de difusión de la proteína ⁵ y por otra parte, sólo una pequeña fracción de las proteínas de la población está marcada con puntos cuánticos, y no se sabe si esta fracción es representativa para el total grupo de proteínas de la membrana de plasma. Tra de partículas individualescking (SPT) mediciones de los coeficientes de difusión de imagen de serie de proteínas marcadas puntos cuánticos implica el mapeo de las posiciones de los picos fotografiados de las partículas con dos gaussiana bidimensional encaja seguido de algoritmos de análisis extensos. El análisis es computacionalmente muy intensivo, que requiere extensa de curva no lineal apropiado en cada cuadro de imagen de una secuencia de lapso de tiempo a las aproximaciones de la función de dispersión de punto microscopio (típicamente de dos dimensiones gaussianas espacial) y la posterior unión de las posiciones de partículas en trayectorias de las partículas que describe el movimiento de las moléculas individuales ^6,7.

Una técnica de correlación de imágenes recientemente desarrollada, k-espacio Correlación Imagen Espectroscopía (CCI) permite mediciones sencillas relativas de los coeficientes de difusión de los etiquetados con fluorescencia proteínas de la membrana de plasma. La posibilidad de calcular de forma rutinaria coeficientes de difusión de las proteínas de membrana marcadas con proteínas fluorescentes por las CCI es una herramienta única que mantienevarias ventajas sobre cuántica tradicional salpican análisis SPT: No se requiere la inserción de etiquetas y tiempo extracelulares que consumen etiquetado extracelular (líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes se pueden utilizar); los coeficientes de difusión se extraen de la piscina total de proteínas fluorescentes en comparación con un subconjunto marcado con puntos cuánticos; análisis es simple sin la necesidad de realizar un seguimiento de las proteínas individuales y el análisis se puede realizar utilizando un código existente con ningún requisito para la programación de usuario adicional. El método es rápido, ya que es una técnica de promedio que permite el cálculo rápido y cálculo de los coeficientes de difusión. Estas mediciones de difusión rápida para la población de proteínas se complementan la información de transporte molecular más detallada obtenida de un subconjunto de la población por los métodos SPT esmerados.

tiempo CCI correlaciona secuencias de imágenes de microscopía de fluorescencia que primero han sido transformadas para el espacio de Fourier, y por lo tanto separa flfluctuaciones uorescencia debido a fotofísica de las debidas al transporte molecular ^1. Como resultado, las CCI pueden determinar la densidad del número, la velocidad de flujo, y la difusión de moléculas, mientras que la etiqueta fluorescente ser imparcial por fotoblanqueo complejo o parpadeo de los fluoróforos. Esto hace que las CCI una herramienta útil para determinar rápidamente la dinámica de difusión de proteínas de membrana de células con fluorescencia marcado con y sin la necesidad de algoritmos de escritura personalizados. Además de las proteínas marcadas fluorescentemente, CCI también se pueden aplicar a proteínas de membrana de punto marcado cuánticos ^8.

Este documento ofrece una introducción paso a paso de cómo utilizar las CCI para extraer los coeficientes de difusión de las proteínas de la membrana plasmática de etiquetado EGFP mediante la demostración de cómo colocar la cosecha, cómo utilizar el código y cómo evaluar las parcelas generadas, de las cuales la difusión coeficientes se extraen. A modo de ejemplo, los datos obtenidos por hilado conjunto de discos-microscopía en semi-reflexión interna total fluorescenciaModo nce (TIRF), de un canal de agua renal de proteínas acuaporina-3 (AQP3) etiquetados con EGFP se presenta.

Protocolo

Adquisición de proteínas EGFP-etiquetados en la membrana de plasma para el análisis de CCI se puede hacer en un microscopio de epifluorescencia, una configuración de TIRF o en un microscopio de disco giratorio fijado para adquirir imágenes de la membrana de interés. El tamaño de los píxeles de la cámara, así como el tiempo entre cuadros de imagen es necesaria para el análisis. Las secuencias de imágenes de 100-1,200 fotogramas a una velocidad de 4-30 Hz se pueden utilizar para el análisis. Durante la adquisición, es importante para mantener la membrana en el foco a lo largo de la duración de la formación de imágenes y centrarse en una fracción de la membrana plana en la que la fluorescencia se distribuye de manera uniforme. Mover vesículas, que sobresale regiones de membrana y orgánulos celulares se pueden recortar más tarde en el proceso de análisis. El tiempo de adquisición debe ser elegido de modo que no hay deriva o el movimiento de la célula.

Para obtener las secuencias de comandos de código de las CCI para MATLAB, póngase en contacto con Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La primera vez que el código de las CCI se utiliza, MAT abiertaLAB y haga clic en archivo, la ruta a continuación, establecer, a continuación, haga clic en añadir a las subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código CCI. Haga clic en Aceptar, guardar y cerrar. Ahora hay que continuar con el análisis de los cultivos que se describen en los siguientes puntos.

1. Importe la secuencia de imágenes de interés en un programa de análisis de imagen como TIFF Stack

Guarde el archivo con el nombre: stack1.tif.

1. Seleccione una región rectangular de interés (ROI) en la parte plana de la membrana de exclusión de orgánulos celulares móviles y sobresaliendo regiones de membrana. El tamaño de la cosecha se seleccionará de forma que suficientes estadísticas se generan para el bien k ² parcelas.
2. Recortar la región y salvar el cultivo como un archivo TIFF en una carpeta adecuada. Si hay varios cultivos de la misma película, use un incremento de número, por ejemplo, "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Coloque la carpeta que contiene los cultivos a nivel localen el equipo, no en el servidor, mientras que hace un análisis de las CCI.

2. Importe los Cultivos en el software de análisis de uno en uno para realizar el análisis de

1. Abrir MATLAB y tipo "icsgui" en la ventana de comandos y presione ENTRAR. ICS GUI es el nombre del ejecutable para el programa de interfaz gráfica de usuario de la espectroscopia de correlación de imágenes.
2. En la interfaz gráfica de usuario de ICS, haga clic en la pestaña "CCI". Una captura de pantalla de la ventana de análisis se muestra en la Figura 1.
3. Encuentre la carpeta con el nombre de la carpeta "código MATLAB" y desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo "Scripts" y abra esta haciendo doble clic en él. Alternativamente, haga clic derecho en el archivo y seleccione "abrir con MATLAB" o ir a un archivo, se abre en MATLAB y abra el archivo scripts. Este archivo se llama Editor.
4. En el libro del editor de «CCI Cargar conjuntos de datos" y, a continuación, copie o nombre de archivo tipo y ubicación de la carpeta en la línea de comandos que comienzacon img = por ejemplo, "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". En la línea de comandos debajo de la ubicación de la carpeta ajustar el número de fotogramas que se van a analizar - por ejemplo, [1:500]. Utilice los mismos ajustes para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación foco en cuadros posteriores, éstos deben ser excluidos del análisis.
5. En el editor, haga clic en "Guardar" y luego haga clic en "evaluar la celda". El conjunto de datos ya está cargado en en el software de análisis.
6. En la ventana de Análisis de las CCI en los GUI, introduzca los valores para el análisis:
   1. Desmarca casillas "células T".
   2. Introduzca el número de retardos a analizar. El número de retardos de tiempo (τ) tendrá efecto en la trama de difusión y debe ser elegido de modo que la trama de difusión es lineal. Comience con la participación en el 25 y después disminuir hasta donde la trama de difusión es lineal. τ es el número de desfases el análisis compara las CCI y un lapso de tiempo es el tiempo de bntre una trama y la siguiente. El valor más pequeño que da una representación lineal debe ser seleccionado. El número máximo de retrasos de tiempo se elige de manera que se obtiene un ajuste lineal, la elección de un valor más alto producirá datos que no pueden ser línea ajustada.
   3. Introduzca el valor máximo k ² (ver Círculo 1 de la figura 1), por lo general es de 20-50. Un buen k ² parcela es un trazado en el que hay muchos puntos de datos que se distribuyen a lo largo de una línea. Comience con la participación en el 70 y luego disminuir después de haber evaluado los k ² y difusión parcelas y seleccione el valor más bajo en el que el grupo de puntos de datos en torno a una línea recta. El valor de k ² es la magnitud al cuadrado de la k-vector espacial en el espacio de Fourier.
      Inicialmente, el análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, a continuación, utilizar la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos, pero siempre asegúrese de que los ajustes seleccionados dan un buen ajuste a los datos: bien k ² parcelasy una trama de difusión lineal.
   4. Haga clic en "Configuración de las tiendas y proceder".
   5. Haz clic en "Sí" para mostrar todos los gráficos.
   6. Haga clic en "imagen de la serie de carga" (véase el círculo 2 de la Figura 1), a continuación, haga clic en "espacio de trabajo".
   7. Seleccione "imgSerCrop", a continuación, haga clic en "Importar de espacio de trabajo".
   8. Introduzca los valores de recogida de sistema de imágenes. En el "tamaño del píxel" cuadro de introducir el tamaño del pixel proyectado para el sistema de imágenes en la que las pilas de imágenes son adquiridas. Para AQP3-EGFP, se utilizó 0.111. En el cuadro "Especifique el tiempo (s) entre bastidores", 0.1150 se utilizó para AQP3-EGFP.
   9. Haga clic en "seleccionar ROI", introduzca "1", haga clic en Aceptar y "utilizar toda la imagen".
   10. Haga clic en "análisis Do CCI" y haga clic en Sí para hacer "filtrado inmóvil". Resultados se abrirán automáticamente como imágenes.
   11. Minimizar la ventana de ajustes, minimizar la información de célula window, y minimizar la ventana fotofísica. En la ventana de la dinámica, compruebe que la trama dinámica muestra un ajuste lineal de los datos a una línea con una pendiente negativa lo que significa que los puntos de datos se correlacionan y difusión libre se puede suponer. Registre el coeficiente de difusión para el lapso de tiempo específico y k ² ajustes (no es necesario tener en cuenta la desviación estándar del ajuste). Los puntos de datos en los k ² parcelas deben ser agrupados en torno a la línea para el momento dado se queda.
   12. Marque la casilla "Guardar figuras abiertas como imágenes", a continuación, haga clic en "Guardar figuras abiertas como imágenes" para guardar los archivos de resultado. Guarda en una nueva carpeta en C: Users Documentos AQP3diffusion. Haga clic en "claro de datos actual" y continuar con el análisis de la próxima cosecha.

3. Promedio del Coeficiente de Difusión Calculado está calculado para obtener una visión general de los datos analizados

1. Introduzca los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en un spreadsheet (asegúrese de tomar nota de la τ y k ² valores), utilice los nombres de los cultivos establecidos anteriormente.
2. Calcule el promedio de coeficiente de difusión y la desviación estándar utilizando un programa de hoja de cálculo.
3. Realice una prueba de Kolmogorov-Smirnov o estudiantes t-test para evaluar diferencias estadísticas con un nivel de significación del 5%. Comparaciones Quantitave entre las células (por ejemplo, tratados vs no tratado) se pueden hacer.
4. Abra la versión de hoja de cálculo de las parcelas de difusión que se generan por el software de análisis para cada cultivo, y un promedio de los datos de cada estado para cada intervalo de tiempo. Generar una nueva trama de difusión promedio de presentación de documentos o las presentaciones.

Resultados

Para adquirir pilas de imágenes adecuadas para ser analizadas con las CCI, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopio. Es posible analizar secuencias de imágenes de un microscopio de epi-fluorescencia, así como una configuración de disco TIRF o girando. La membrana debe ser plana sin grandes orgánulos celulares móviles o en movimiento vesículas / objetos. En este trabajo se presenta una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de AQP3 etiquetados con EGFP en células MDCK en vivo fotografiados en un m...

Discusión

En este trabajo se presenta una descripción detallada paso a paso de cómo aplicar el método de análisis de las CCI para determinar los coeficientes de difusión de imágenes de microscopía de proteínas marcadas con proteínas fluorescentes. El análisis es independiente de la elección de la sonda con un muy amplio rango dinámico en la densidad de etiquetado y puede por lo tanto también se puede aplicar a proteínas marcadas con puntos cuánticos, así como colorantes y proteínas fluorescentes tales como EGFP. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+