K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Özet

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

Özet

Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) ¹ doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar.

İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir "yamaçlarında yamaç" oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.

Giriş

Plazma zar proteinlerinin dört boyutlu uzaysal Organizasyon ve yanal hareket sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve protein fonksiyonu, aktivite ve protein-protein etkileşimleri, bir rol oynayabilir. Plazma zarı proteinlerinin yanal difüzyon, geleneksel kuantum nokta time-lapse görüntüleme gelen tek parçacıklar için difüzyon katsayılarını hesaplayarak veya etiketli plazma zarı proteinleri ^2-4 boya tarafından incelenmiştir. Bu yaklaşım, protein katlanmasına ve işlevini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, bazı proteinler için elde edilemez kuantum nokta ya da boya etiketleme için plazma zar proteini, bir hücre dışı etiketi sokulmasını gerektirir. Kuantum nokta sterik hacmi, proteinin ⁵ difüzyonunu yavaşlatmak için ve ayrıca, popülasyondaki proteinlerin sadece çok küçük bir bölümü kuantum noktaları ile etiketlenir gösterilmiştir, ve bu fraksiyon toplam temsili ise bilinmemektedir plazma zarı proteinlerinin havuzu. Tek parçacık trakuantum dot etiketli proteinlerin görüntü dizisinden difüzyon katsayıları cking (SPT) ölçümleri haritalayan iki boyutlu Gauss olan parçacıkların görüntülenmiş zirve pozisyonları kapsamlı analizi algoritmaları ardından uyar içerir. Analiz açıklayan parçacık yörüngeleri içine mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (genellikle iki boyutlu uzamsal Gauss) ve partikül pozisyonları sonraki bağlayan yaklaşımları bir time-lapse dizisi her resim çerçevesi uydurma geniş doğrusal olmayan eğri gerektiren hesaplama çok yoğun tek moleküllerin ^6,7 hareketi.

Yakın zamanda geliştirilen görüntü korelasyonu tekniği, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) floresan plazma zarı etiketli proteinlerin difüzyon katsayılarının göreceli basit ölçümler sağlar. Rutin kICS tarafından floresan proteinleri ile etiketlenmiş membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını hesaplamak için olasılık tutan benzersiz bir araçtırGeleneksel kuantum üzerinde çeşitli avantajları SPT analizi dot: hücre dışı etiketleme alıcı dışı etiketleri ve zaman hiçbir ekleme (floresan proteinleri ifade hücre hatları kullanılabilir) gereklidir; difüzyon katsayıları kuantum noktaları ile etiketlenmiş bir alt ile karşılaştırıldığında floresan proteinlerin toplam miktarından çıkarılır; Analiz tek proteinler izlemek için gerek olmadan basit ve analiz ek kullanıcı programlanması için bir şartı ile olan bir kodu kullanarak gerçekleştirilebilir. Difüzyon katsayılarının hızlı hesaplama ve hesaplamayı sağlayan bir ortalama tekniktir çünkü yöntem hızlıdır. Protein nüfusun bu hızlı difüzyon ölçümleri özenli SPT yöntemlerle nüfusun bir alt kümesi için elde daha ayrıntılı moleküler taşıma bilgileri tamamlar.

kICS sefer ilk Fourier uzayında dönüştürülmüştür floresan mikroskobu görüntü dizileri ilişkilidir ve böylece fl ayırırMoleküler ulaşım ¹ dolayı olanlardan fotofizikten nedeniyle uorescence dalgalanmalar. Sonuç olarak, kICS, sayı yoğunluğu belirlemek akış hızı ve kompleks ışıkla ağartma ile ilgili olan ya da florofor yanıp sönen difüzyon floresan etiketli moleküller olabilir. Bu, hızlı bir şekilde özel kICS yazma algoritmalar için gerek kalmadan floresan etiketli hücre zarı proteinlerinin difüzyon dinamiklerinin belirlenmesi için uygun bir araç sağlar. Bunun yanı sıra floresan etiketli proteinler, kICS da kuantum dot-işaretli zar proteinleri ⁸ uygulanabilir.

Bu kağıt kodu ve nasıl oluşturulan araziler, değerlendirmek için nasıl kullanılacağını, kırpma yerleştirmek için nasıl göstererek EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayıları ayıklamak için kICS kullanmak için nasıl bir adım-adım giriş sağlayan difüzyon itibaren katsayıları ayıklanır. Bir örnek olarak, yarı toplam iç yansıma disk mikroskopi dizi eğirme ile elde edilen veriler floresanEGFP'nin ile etiketlenmiş bir böbrek su kanalı proteini aquaporin-3 (AQP3) ve nce (TIRF) modu, sunulmuştur.

Protokol

KICS analiz için plazma membranında EGFP-etiketli proteinlerinin kazanılması Epifloresans mikroskop, bir TIRF kurulum veya ilgi membran görüntüler elde etmek için ayarlanmış bir dönen disk mikroskop üzerinde yapılabilir. Görüntü kareleri arasında Kamera piksel boyutu hem de zaman analiz için gereklidir. 4-30 Hz çerçeve hızında 100-1,200 kare görüntü dizileri analizi için kullanılabilir. Edinimi sırasında, görüntüleme süresince odak membran tutmak ve floresans düzgün bir şekilde dağılmış olduğu düz bir zarın bir kısmı üzerinde odaklanmak için önemlidir. Kabarcıklara hareketli membran bölgeleri ve hücre organellerini çıkıntılı sonra analiz sürecinde dışarı kırpılmış olabilir. Hücrenin herhangi bir kayma ya da hareket olmadığı, böylece zaman alıcı seçilmelidir.

MATLAB için kICS kod komut almak için, Paul Wiseman başvurun (Paul.Wiseman @ McGill.ca). İlk kez kICS kod, açık MAT kullanılırLAB ve dosyayı tıklatın, sonra da set yol, alt klasörler ile ekleyebilir tıklayın ve kICS kod bulunduğu bilgisayarda klasörü bulmak. Ardından ok tıklayın kaydedin ve kapatın. Şimdi önümüzdeki puan açıklanan ürünlerin analizi ile devam ediyor.

1.. TIFF Stack olarak Görüntüleme Analiz Programı içine İlgi görüntü sırası alma

Stack1.tif: adı ile dosyayı kaydedin.

1. Membran hareketli hücre organelleri hariç ve membran bölgeleri çıkıntılı düz kısmında ilgi alanları (ROI) dikdörtgen bir bölge seçin. Yeterli istatistik iyi k ² araziler için oluşturulan böylece ekin boyutu seçilir.
2. Bölgeyi kırpın ve uygun bir klasörde TIFF dosyası olarak kırpma kaydedin. Aynı film çeşitli bitkiler varsa, örneğin "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif" bir sayı artışı kullanın.
3. Yerel bitkileri içeren klasörü yerleştirinbilgisayarda değil, bir sunucu üzerinde, kICS analiz yaparken.

2.. Analizi gerçekleştirin One tarafından Analizi Yazılım One'a Bitkileri alma

1. Komut penceresi ve basın açık MATLAB ve tip "icsgui" ENTER. ICS GUI görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programı için yürütülebilir adıdır.
2. ICS GUI "kICS" sekmesine tıklayın. Analiz penceresinin bir ekran görüntüsü, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
3. Klasör adı "MATLAB kod" ile klasörünü bulun ve dosya adı "Scripts" ile dosyaya ilerleyin ve çift tıklayarak bu açın. Alternatif olarak, dosyaya sağ tıklayın ve "MATLAB ile açmak" veya dosyaya gidin, MATLAB açık ve komut dosyasını açın seçin. Bu dosya Editör denir.
4. Editör kaydırma "Load kICS veri setleri", daha sonra komut satırına kopyalamak veya tipi dosya adı ve klasör konumu başlar içindeimg = örneğin ": Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif C" ile. Örneğin [1:500] - klasör konumu altında komut satırında analiz edilecek kare sayısını ayarlayın. Veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullan. Odak kayması sonraki kare varsa, bu analize dahil edilmelidir.
5. Editör tıklatın "kurtarmak" ve ardından "hücre değerlendirmek" tıklayın. Veri kümesi şimdi analiz yazılımı yüklenir.
6. GUI kICS Analizi penceresinde, analiz için ayarları girin:
   1. "T-hücresi" kutuları unclick.
   2. Giriş zaman sayısı analiz edilecek kalmaktadır. Gecikme süresi (τ) sayısı difüzyon arsa üzerinde etkisi olacaktır ve difüzyon arsa doğrusal şekilde seçilmelidir. 25 ile girerek başlayın ve daha sonra difüzyon arsa doğrusal olduğu için azalır. τ sayısı kICS analiz karşılaştırır zaman-gecikme ve bir gecikme zamanı between bir kare ve bir sonraki. Lineer bir çizgi veren küçük değer seçilmelidir. Süresi en fazla doğrusal uygun daha yüksek bir değer hat takılamaz bilgi verir seçimi, elde edilir, böylece seçilir kalmaktadır.
   3. Maksimum k ² değerini girin (Şekil 1 daire 1 bakınız), genellikle 20-50 olduğunu. İyi bir k ² arsa bir hat boyunca dağıtılmış olan birçok veri noktası olduğu bir grafiğidir. 70 ile girerek başlayın ve daha sonra k ² ve difüzyon araziler değerlendirilerek sonra azalma ve düşük değerini seçmek nerede düz bir çizgi etrafında veri noktaları küme. K ² değeri Fourier uzayında mekansal k-vektörünün kare büyüklüğü.
      Iyi K ² araziler: Başlangıçta, analiz iyi değerler belirleninceye kadar, daha sonra seçilmiş ayarları verilere iyi bir uyum vermesi kontrol her zaman veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullanabilirsiniz ama tekrar edilmelidirve lineer difüzyon arsa.
   4. "Store ayarları ve devam" tıklayın.
   5. Tüm grafikleri göstermek için "evet" tıklayın.
   6. "Load görüntü serilerini" (Şekil 1 daire 2 bakınız) tıklayın, ardından "çalışma alanı" tıklayın.
   7. "ImgSerCrop" seçeneğini seçin, ardından "Workspace al" seçeneğini tıklatın.
   8. Görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Kutu "piksel boyutuna" in görüntü yığınlarının satın alınan hangi görüntüleme sistemi için öngörülen piksel boyutunu girin. AQP3-EGFP'nin için, 0.111 kullanılmıştır. Kutusuna "çerçeveler arasındaki süreyi (ler) gir", 0,1150 AQP3-EGFP'nin için kullanıldı.
   9. "1", ok tıklayın ve "bütün görüntüyü kullanmak" girin "İB'leri seçin" seçeneğini tıklayın.
   10. "Do kICS analizi" ni tıklayın ve "hareketsiz filtreleme" yapmak için tıklayın evet. Sonuçlar görüntüleri otomatik olarak açılacaktır.
   11. Ayarlar penceresini minimize, hücre bilgi windo en aza indirmekw ve PHOTOPHYSICS penceresini minimize. Dinamikleri penceresinde, dinamik arsa veri noktaları korelasyon ve ücretsiz difüzyon kabul edilebilir, yani bir negatif eğimli bir çizgiye veri doğrusal bir uyum gösterdiğini kontrol edin. Belirli bir zaman gecikme için difüzyon katsayısı kaydedin ve ² ayarları (bu uyum standart sapması dikkat etmek gerekli değildir) k. K ² parsellerde veri noktaları gecikme belirli bir süre için hat etrafında kümelenmiş gerekir.
   12. Tick ​​box "görüntüler olarak açık rakamları kaydet", daha sonra neden dosyaları kaydetmek için "görüntü olarak açık rakamları kaydet" seçeneğini tıklayın. C altında yeni bir klasöre kaydet: Users Documents AQP3diffusion. "Net güncel veri" tıklayın ve bir sonraki ürün analizi ile devam ediyor.

Hesaplanan Difüzyon Katsayısının 3.. Ortalama Analiz Verilerin bir bakış Get Hesaplanır

1. Bir spre her ROI bireysel difüzyon katsayıları girinadsheet (τ not ve ² değerlerini k emin olun), yukarıda belirtilen ürünlerin adları kullanın.
2. Bir elektronik tablo programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısı ve standart sapma hesaplayın.
3. Kolmogorov-Smirnov testi veya öğrencilerin% 5 anlamlılık düzeyi kullanılarak istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için t-testi gerçekleştirin. Hücreler (örneğin, tedavi edilmeyen genel muamele edilmiş) arasında Niceliksel karşılaştırmalar yapılabilir.
4. Her ürün için analiz yazılımı tarafından üretilen ve her zaman lag için her durum için verileri ortalama difüzyon parsellerin elektronik tablo sürümünü açın. Gazetelerde veya sunumlarda sunmak için yeni bir ortalama difüzyon arsa üretmek.

Sonuçlar

KICS ile analiz edilmesi için uygun resim yığınları elde etmek için, farklı bir mikroskop sistemleri kullanılabilir. Bu bir epi-floresan mikroskop gibi bir TIRF veya dönen bir disk kurulumu görüntü dizileri analiz etmek mümkündür. Membran herhangi bir büyük hareketli hücre organelleri olmayan veya kesecikleri / hareketli nesneleri düz olmalıdır. Bu kağıt 9.2 Hz'lik bir kare hızında plazma zarı ayarlanmış bir odaklanma ile dönen disk mikroskop görüntülü canlı MDCK hücrelerinde EGFP&...

Tartışmalar

Bu kağıt floresan proteinleri ile etiketli proteinlerin mikroskopi görüntüleri difüzyon katsayıları belirlemek için kICS analiz yöntemi uygulamak için nasıl ayrıntılı adım-adım bir bakış sundu. Analiz etiketleme yoğunluğunda çok geniş bir dinamik aralık ile prob seçimi bağımsızdır ve bu yüzden aynı zamanda Kuantum noktalarının yanısıra boyalar ve EGFP gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri uygulanabilir.

Proteinler için geçerli difüzyon ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+