Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Resumo

Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos.

Resumo

Difusão lateral e compartimentalização de proteínas da membrana plasmática são fortemente regulados em células e, assim, estudar esses processos irão revelar novas perspectivas para a função da proteína da membrana plasmática e regulação. Recentemente, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) ¹ foi desenvolvido para permitir medições de rotina de coeficientes de difusão diretamente a partir de imagens de proteínas da membrana plasmática marcados fluorescente, que evitaram desvios sistemáticos introduzidos pelo fotofísica sonda. Embora a base teórica para a análise é complexo, o método pode ser implementado por não-especialistas, utilizando um código livremente disponível para medir os coeficientes de difusão de proteínas. CCI calcula uma função de correlação de tempo a partir de uma imagem Pilha de microscopia de fluorescência após a transformação de Fourier de cada imagem para (k-) espaço recíproco. Subsequentemente, transformar média circular, logaritmo natural e linear encaixa para a função de correlação obtém-se o coeficiente de difusão. Estedocumento fornece um guia passo-a-passo para a análise de imagem e medição de coeficientes de difusão via CCI.

Primeiro, uma sequência de imagens de alta taxa de quadros de uma proteína da membrana plasmática fluorescente etiquetado é adquirido através de um microscópio de fluorescência. Em seguida, uma região de interesse (ROI) evitando organelas intracelulares, vesículas em movimento ou salientes regiões da membrana é selecionado. A pilha de ROI é importado para um código disponível gratuitamente e vários parâmetros definidos (ver secção Method) são definidos para análise CCI. O programa então gera uma "inclinação das encostas" complô das funções de correlação tempo k-espaço, eo coeficiente de difusão é calculado a partir da inclinação da trama. Abaixo está um procedimento passo-a-passo CCI para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana usando o canal de água aquaporina renal-3 marcado com EGFP como um exemplo canônico.

Introdução

A organização espaço-temporal quadridimensional e mobilidade lateral de proteínas da membrana plasmática estão fortemente regulada e pode desempenhar um papel na função da proteína, actividade e interacções proteína-proteína. Difusão lateral de proteínas da membrana plasmática, tradicionalmente tem sido estudada pelo cálculo de coeficientes de difusão para partículas individuais de lapso de tempo de imagem de ponto quântico ou tingir proteínas da membrana plasmática rotulados ^2-4. Esta abordagem requer a inserção de uma etiqueta extracelular da proteína de membrana de plasma para quantum dot ou marcação com corante, o que pode comprometer a dobragem e função da proteína e, assim, não pode ser alcançada por algumas proteínas. O volume estérico de um quantum dot tem mostrado retardar a difusão da proteína de ⁵ e, além disso, apenas uma pequena fracção das proteínas na população são marcadas com pontos de quantum, e não se sabe se esta fracção é representativo para o total associação de proteínas de membrana de plasma. Tra única partículacking (SPT) medições de coeficientes de difusão da série de imagens de proteínas marcadas ponto quântico envolve o mapeamento das posições de pico fotografada das partículas com bidimensional Gaussian encaixa seguido por extensos algoritmos de análise. A análise é computacionalmente muito intensivo, exigindo extensa curva não-linear adequado em cada quadro da imagem de uma seqüência de lapso de tempo para aproximações da função microscópio ponto spread (tipicamente bidimensional Gaussians espacial) e vinculação posterior de posições de partículas em trajetórias de partículas descrevendo o movimento de moléculas individuais ^6,7.

A técnica de correlação de imagem recentemente desenvolvido, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) permite medições simples relativos dos coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática. A possibilidade de calcular rotineiramente coeficientes de difusão de proteínas da membrana marcados com proteínas fluorescentes por CCI é uma ferramenta única que detémvárias vantagens sobre quantum dot análise tradicional SPT: Sem inserção de marcas e consumindo tempo extracelulares rotulagem extracelular é necessária (linhas de células que expressam proteínas fluorescentes podem ser usados); coeficientes de difusão são extraídos a partir do conjunto total de proteínas fluorescentes em relação a um subconjunto marcado com pontos quânticos; A análise é simples, sem a necessidade de controlar as proteínas individuais e a análise pode ser realizada utilizando um código existente sem a necessidade de programação de utilizador adicionais. O método é rápido, porque é uma técnica de cálculo da média, que permite o cálculo rápido e cálculo dos coeficientes de difusão. Estas medições rápida difusão para a população de proteína complementar as informações de transporte molecular mais detalhada obtida para um subconjunto da população pelos métodos SPT meticuloso.

tempo CCI correlaciona sequências de imagens de microscopia de fluorescência, que tenham sido previamente transformadas com o espaço de Fourier, e assim separa flflutuações uorescência devido a fotofísica daqueles devido ao transporte molecular ^1. Como resultado, a CCI pode determinar o número de densidade, velocidade de fluxo e difusão de moléculas fluorescente etiquetado sendo imparcial por fotodegradação complexo ou intermitente dos fluoróforos. Isso faz com que CCI uma ferramenta útil para determinar rapidamente a dinâmica de difusão de proteínas de membrana de células marcadas com fluorescência, sem a necessidade de algoritmos de gravação personalizados. Além de proteínas marcadas com fluorescência, CCI também pode ser aplicado a proteínas de membrana marcado com quantum dot ^8.

Este documento oferece uma introdução passo-a-passo de como usar o CCI para extrair coeficientes de difusão de proteínas da membrana plasmática EGFP-marcadas, demonstrando como colocar a cultura, como usar o código e como avaliar as parcelas geradas, a partir do qual a difusão coeficientes são extraídos. Como exemplo, os dados obtidos por fiação conjunto disk-microscopia em reflexão interna semi-total de fluorescênciamodo nce (TIRF), de um renal proteína canal de água aquaporina-3 (AQP3) etiquetadas com EGFP é apresentado.

Protocolo

Aquisição de proteínas marcadas com EGFP da membrana do plasma para análise CCI pode ser feito num microscópio de epifluorescência, uma configuração TIRF ou num microscópio de disco giratório definido para adquirir imagens da membrana de interesse. O tamanho do pixel de câmara, assim como o tempo entre os quadros de imagem é necessária para a análise. Sequências de imagens de 100-1,200 quadros em uma taxa de quadros de 4-30 Hz pode ser usado para a análise. Durante a aquisição, é importante para manter a membrana no foco durante toda a duração da imagem e o foco sobre uma fracção de membrana plana, em que a fluorescência é uniformemente distribuída. Movendo-se vesículas, projetando-se regiões de membrana e organelas celulares podem ser cortadas para fora no final do processo de análise. O tempo de aquisição deve ser escolhido de modo que não há nenhuma deriva ou movimento da célula.

Para obter os scripts de código CCI para MATLAB, entre em contato com Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). A primeira vez que o código CCI é usado, MAT abertoLAB e clique arquivo, caminho, em seguida, definir, em seguida, clique em adicionar com subpastas e localize a pasta no computador em que o código CCI está localizado. Em seguida, clique em OK, salvar e fechar. Agora continue com a análise de culturas descritos nos próximos pontos.

1. Importe a sequência de imagens de interesse em um programa de análise de imagem como TIFF Stack

Salve o arquivo com o nome: stack1.tif.

1. Selecione uma região retangular de interesse (ROI) na parte plana da membrana excluindo organelas celulares móveis e salientes regiões de membrana. O tamanho do corte é escolhido de forma que as estatísticas suficientes são gerados para o bem k ² parcelas.
2. Cortar a região e salvar a cultura como um arquivo TIFF em uma pasta apropriada. Se existem várias culturas a partir do mesmo filme, usar um incremento de número, por exemplo "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Coloque a pasta que contém as culturas locaisno computador, e não em um servidor, ao fazer a análise CCI.

2. Importam as culturas para a Análise de Software One by One para executar a análise de

1. Abrir MATLAB e digite "icsgui" na janela de comando e pressione ENTER. ICS GUI é o nome do executável para o programa de interface gráfica do usuário espectroscopia de correlação de imagem.
2. Na GUI do ICS, clique na guia "CCI". Uma captura de tela da janela de análise é mostrado na Figura 1.
3. Encontre a pasta com o nome da pasta "código MATLAB" e vá até o arquivo com o nome do arquivo "Scripts" e abrir este clicando duas vezes nele. Como alternativa, clique o botão direito no arquivo e selecione "abrir com MATLAB" ou ir para o arquivo, aberto em MATLAB e abra o arquivo scripts. Este arquivo é chamado de Editor.
4. No rolo Editor para "CCI carregar dados conjuntos", em seguida, copiar ou nome do arquivo tipo e localização da pasta na linha de comando, que começacom img = por exemplo, "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". Na linha de comando abaixo a localização da pasta definir o número de quadros a serem analisados ​​- por exemplo, [1:500]. Use as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados. Se houver desvio de foco em quadros posteriores, estes devem ser excluídos da análise.
5. No editor clique em "salvar" e depois clique em "avaliar célula." O conjunto de dados está agora carregado no no software de análise.
6. Na janela Análise CCI no GUI, introduzir as definições para a análise:
   1. Desmarque as caixas "de células T".
   2. Digite o número de defasagens a ser analisado. O número de defasagens de tempo (τ) terão efeito sobre o enredo de difusão e deve ser escolhido de modo que o enredo de difusão é linear. Comece com a entrada de 25 e depois diminuir para onde a trama difusão é linear. τ é o número de intervalos de tempo da análise compara CCI e um intervalo de tempo é o tempo bntre um quadro e outro. O menor valor que dá um enredo linear deve ser selecionada. O número máximo de lapsos de tempo é escolhida de modo a que um ajuste linear é obtido, a escolha de um valor mais elevado irá produzir dados que não podem ser montados linha.
   3. Digite o valor máximo k ² (ver círculo 1 da Figura 1), é geralmente 20-50. Um bom k ² enredo é uma trama em que há muitos pontos de dados que são distribuídos ao longo de uma linha. Comece com a entrada de 70 e, em seguida, diminuir depois de ter avaliado os k ² e difusão parcelas e selecionar o menor valor em que o cluster pontos de dados em torno de uma linha reta. O valor k é ² a magnitude ao quadrado do k-vector espacial no espaço de Fourier.
      Inicialmente, a análise deve ser repetida até que os melhores valores são determinados, em seguida, usar as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados, mas sempre verifique se as configurações selecionadas dar um bom ajuste para os dados: bom k ² parcelase um enredo difusão linear.
   4. Clique em "Ajustes da Loja e avançar".
   5. Clique em "sim" para mostrar todos os gráficos.
   6. Clique em "Load série de imagens" (ver círculo 2 na Figura 1), em seguida, clique em "área de trabalho".
   7. Selecione "imgSerCrop", clique em "Importar do Workspace".
   8. Digite as configurações de coleta de sistema de imagem. No "tamanho do pixel" caixa digite o tamanho do pixel projetado para o sistema de imagens em que as pilhas de imagens são adquiridas. Para AQP3-EGFP, 0.111 foi usada. Na caixa "Digite o tempo (s) entre os quadros", 0,1150 foi usado para AQP3-EGFP.
   9. Clique em "selecionar ROIs", digite "1", clique em ok e "usar a imagem inteira".
   10. Clique em "análise Do CCI" e clique em sim para fazer "filtragem imóvel". Os resultados irão abrir automaticamente como imagens.
   11. Minimizar a janela de configurações, minimizar a informação da célula window, e minimizar a janela fotofísica. Na janela dinâmica, verifique se a trama dinâmica mostra um ajuste linear dos dados para uma linha com uma inclinação negativa o que significa que os pontos de dados correlacionar e difusão livre pode ser assumida. Registre o coeficiente de difusão para o intervalo de tempo específico e K ² configurações (não é necessário notar o desvio padrão do ajuste). Os pontos de dados nas k ² lotes devem ser agrupados em torno da linha do tempo dado lags.
   12. Caixa Tick "Salvar figuras abertas como imagens", clique em "Salvar dados abertos como imagens" para salvar resultar arquivos. Salve em uma nova pasta em C: Users Documents AQP3diffusion. Clique em "dados atuais clara" e continuar com a análise da próxima safra.

3. Média do coeficiente de difusão calculado é calculado para obter uma visão geral dos dados analisados

1. Digite os coeficientes de difusão individuais de cada ROI em um spreadsheet (certifique-se de anotar o τ e K ² valores), use os nomes das culturas, tal como definidos acima.
2. Calcule o coeficiente de difusão média e desvio padrão, utilizando um programa de planilha.
3. Realizar um teste de Kolmogorov-Smirnov ou estudantes t-teste para avaliar diferenças estatísticas usando um nível de significância de 5%. Quantitativo, as comparações entre as células (por exemplo, tratado vs não tratado) possa ser feita.
4. Abra a versão planilha das parcelas de difusão que foi gerado pelo software de análise para cada cultura, ea média dos dados para cada condição para cada intervalo de tempo. Gerar um novo enredo difusão média para apresentar em documentos ou apresentações.

Resultados

Para adquirir pilhas de imagens adequadas a serem analisados ​​com CCI, podem ser utilizados diferentes sistemas de microscópio. É possível analisar sequências de imagens de um microscópio de epi-fluorescência, bem como uma configuração de disco TIRF ou spinning. A membrana deve ser plana, sem grandes organelas celulares em movimento ou em movimento vesículas / objetos. Este trabalho apresenta uma seqüência de imagens de lapso de tempo de AQP3 marcadas com GFP em células MDCK ao vivo de imagens em um mic...

Discussão

Este artigo apresentou um panorama detalhado passo-a-passo de como aplicar o método de análise de CCI para determinar coeficientes de difusão de imagens de microscopia de proteínas marcadas com proteínas fluorescentes. A análise é independente da escolha da sonda com uma gama dinâmica muito ampla na densidade rotulagem e pode assim ser também aplicado a proteínas marcadas com pontos quânticos, bem como corantes e proteínas fluorescentes, tais como a EGFP.

Para calcular os coefici...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+