k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

要約

本論文では、生きた哺乳動物細胞内で蛍光標識した細胞膜タンパク質の拡散係数を測定するための変動解析手法のk空間画像相関分光法（KICS）のステップバイステップガイドを提供しています。

要約

横方向の拡散および原形質膜タンパク質の区画化は、細胞内で緊密に調節され、従って、これらのプロセスを研究することは、原形質膜タンパク質の機能および調節への新しい洞察を明らかにする。最近ではk空間イメージ相関分光法^{（KICS）1は、}プローブ光物理学によって導入系統的な偏りを回避し、蛍光タグ付き原形質膜タンパク質の画像から直接拡散係数のルーチン測定を可能にするために開発された。分析のための理論的基礎は複雑であるが、この方法は、タンパク質の拡散係数を測定するために自由に利用可能なコードを用いてnonexpertsによって実現することができる。 KICSは逆数（のk）空間に、各画像をフーリエ変換した後に蛍光顕微鏡画像スタックから時間相関関数を計算する。続いて、平均円形、自然対数変換及び線形相関関数にフィットする拡散係数が得られる。この論文は、KICS介して画像解析し、拡散係数の測定にステップバイステップのガイドを提供しています。

まず、蛍光標識された原形質膜タンパク質の高フレームレート画像シーケンスは、蛍光顕微鏡を用いて取得される。次いで、関心領域（ROI）、細胞内小器官を避け小胞の移動やメンブレン領域の突出が選択される。 ROIのスタックは、自由に利用可能なコードにインポートされ、いくつかの定義されたパラメータ（方法の項を参照）がKICS解析のために設定されている。次に、プログラムは、k空間時間相関関数からのプロット "斜面の傾き」を生成し、拡散係数はプロットの勾配から計算される。以下腎水路アクアポリン3標準的な例として、EGFPでタグを用いて、膜タンパク質の拡散係数を測定するためのステップバイステップKICS手順である。

概要

原形質膜タンパク質の4次元空間時間的組織及び横移動度が厳密に調節され、タンパク質の機能、活性およびタンパク質 - タンパク質相互作用において役割を果たし得る。原形質膜タンパク質の側方拡散は、伝統的に、量子ドットのタイムラプス撮影から単一の粒子のための拡散係数を計算するか、標識された細胞膜タンパク質^2-4を染色することによって研究されている。このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能が損なわれる可能性があり、したがって、いくつかのタンパク質のために達成することができない量子ドットまたは染料標識のための原形質膜タンパク質、細胞外のタグの挿入を必要とする。量子ドットの立体容積が⁵タンパク質の拡散を遅くすることが示されており、また、集団内のタンパク質の小さな部分だけが量子ドットで標識され、そしてこの画分は合計で表す場合、それは知られていない原形質膜タンパク質のプール。単一粒子TRAcking量子ドット標識されたタンパク質の画像シリーズからの拡散係数の（SPT）の測定は、大規模な解析アルゴリズムに続く2次元ガウスフィットの粒子の画像化されたピーク位置をマッピングが含まれます。分析は、顕微鏡点広がり関数（典型的には2次元空間ガウシアン）と記述する粒子軌道にパーティクル位置のその後の架橋の近似値に経時系列の画像フレームごとに大規模な非線形曲線フィッティングを必要とする、計算上非常に集約的である単一分子^6,7の動き。

最近開発された画像相関法はk空間イメージ相関分光法（KICS）は、蛍光原形質膜タンパク質をタグ化拡散係数の相対的な単純な測定を可能にする。日常的にKICSによって蛍光タンパク質で標識された膜タンパク質の拡散係数を計算する可能性が成立するユニークなツールである従来の量子井戸に比べていくつかの利点がSPT分析ドット：細胞外標識を消費し、細胞外のタグと時間の無挿入が必要とされない（蛍光タンパク質を発現する細胞株が使用されてもよい）;拡散係数は、量子ドットで標識されたサブセットと比較して、蛍光タンパク質のプール全体から抽出され;分析は、単一のタンパク質を追跡する必要なく、簡単であり、分析は、追加のユーザプログラミングのための要件なしで既存のコードを使用して行うことができる。これは拡散係数の高速計算及び計算を可能に平均化技術であるため、この方法は迅速である。タンパク質の人口のためにこれらの急速な普及の測定は、骨の折れるSPT法による人口のサブ​​セットに対して得、より詳細な分子の輸送情報を補完します。

KICS時間は、第1のフーリエ空間に変換されている蛍光顕微鏡画像シーケンスを相関し、それによってオンスを分離する分子輸送¹によるものと光物理のためuorescence変動。その結果、KICSは数密度、流速、および複雑な光退色によって、公正なあるかまたはフルオロフォアの点滅しながら、蛍光標識された分子の拡散を決定することができる。これは、KICSすばやくカスタム書き込みアルゴリズムの必要なしに蛍光標識された細胞膜タンパク質の拡散動力学を決定するための有用なツールとなる。他に蛍光標識されたタンパク質は、KICSはまた、量子ドットで標識された膜タンパク質⁸に適用することができる。

本稿では、コ​​ードとどのように生成されたプロットを、評価するための使用方法を、作物を配置する方法を示すことにより、EGFPタグ化細胞膜タンパク質の拡散係数を抽出するためにKICSを使用する方法のステップバイステップの概要を説明した拡散から係数が抽出される。一例として、半全反射顕微鏡において、ディスクセットを紡糸して得られたデータは、蛍光を発するEGFPでタグ付けされた腎臓の水チャネルタンパク質アクアポリン3（AQP3）のNCE（TIRF）モードでは、提示されている。

プロトコル

KICS分析のための原形質膜におけるEGFPタグ化タンパク質の獲得は、落射蛍光顕微鏡、TIRFセットアップまたは目的の膜の画像を取得するように設定スピニングディスク顕微鏡で行うことができる。カメラの画素サイズ、並びに画像フレーム間の時間は、分析のために必要とされる。 4-30 60Hzのフレームレートで100-1,200フレームの画像シーケンスを分析のために使用することができる。取得の間、撮像期間を通して焦点で膜を維持し、蛍光が均一に分布された平膜の画分に集中することが重要である。小胞の移動、突出膜領域および細胞小器官は、後の分析の過程で行うトリミングすることができます。セルのドリフトや動きがないように、収集時間が選択されるべきである。

MATLAB用KICSコードスクリプトを取得するには、ポール·ワイズマンにお問い合わせください（Paul.Wiseman @ McGill.ca）。 KICSコードが初めて使用されるとき、オープンMATラボと、ファイルをクリックし、設定されたパスは、サブフォルダで[追加]をクリックし、KICSコードが置かれているコンピュータ上のフォルダを探します。その後、[OK]をクリックし、保存して閉じ。今、次のポイントで説明する作物の分析に進みます。

1。TIFFスタックとしてイメージング解析プログラムに目的のイメージシーケンスをインポート

stack1.tif：名前でファイルを保存します。

1. 移動細胞小器官を除いた、膜領域を突出膜の平坦部に関心領域（ROI）の矩形領域を選択します。十分な統計が良好なk ^2をプロットするために生成されるようにトリミングサイズが選択される。
2. 地域をクロップして、適切なフォルダにTIFFファイルとして作物を保存します。同じ映画からいくつかの作物がある場合は、 例えば 、「stack1crop.tif "、" stack1crop2.tif "、" stack1crop3.tifを「数の増分を使用しています。
3. ローカルで作物を含むフォルダを配置コンピュータ上ではなくサーバー上で、KICS分析をしている間。

2。分析を実行する一つ解析ソフトウェアの一つに作物をインポート

1. コマンドウィンドウでMATLABやタイプ "icsgui」を開いて、ENTERを押します。 ICS GUIは、画像相関分光法グラフィカル·ユーザー·インターフェース·プログラムのための実行可能ファイルの名前である。
2. ICSのGUIで「KICS」タブをクリックします。分析ウィンドウのスクリーンショットを図1に示す。
3. フォルダ名「MATLABコード」とフォルダを検索し、ファイル名のファイルまでスクロールし、「スクリプト」とダブルクリックして、これを開きます。または、ファイルを右クリックし、 "MATLABで開く"やファイルへ移動、MATLABでのオープンとスクリプトファイルを開く]を選択します。このファイルは、エディタと呼ばれています。
4. エディタのスクロールの「ロードKICSデータセット」と、それから始まるコマンドラインにファイル名とフォルダの場所をコピーまたは入力してIMG = 例えば "：ユーザードキュメント AQP3dynamics stack1crop.tif C」と。 例えば、[1:500] -フォルダの場所を以下のコマンドラインでは、分析されるフレーム数を設定します。データ系列内のすべての連続した​​映画のために同じ設定を使用します。後のフレームの焦点ドリフトが存在する場合、これらは分析から除外されるべきである。
5. エディタで「保存」してから「セルを評価する」をクリックします。データセットは、現在分析中にソフトウェアにロードされる。
6. GUIのKICS分析]ウィンドウでは、解析のための設定を入力します。
   1. 「T細胞」のボックスをUnclick。
   2. 入力した時間数を分析することが遅れる。タイムラグ（τ）の数は、拡散プロットに影響しますし、拡散プロットが直線的になるように選択しなければならない。 25を入力して起動し、拡散プロットは線形であるところにまで減少。 τはKICS分析を比較し、時間差が時間bが-遅れ時間の数であるetween 1フレームと次。線形プロットを与える最小の値を選択する必要があります。線形適合が得られるように時間の最大数は、より高い値がライン嵌合できないデータを生成する選択し、選択されたラグ。
   3. 最大K ²の値を入力します（ 図1の円1を参照）、それは通常、20から50です。良好なk ^2をプロットラインに沿って分布している多数のデータポイントが存在するプロットである。 70を入力し始めて、K ²と拡散プロットを評価し、データが直線のまわりのクラスタを指す最も低い値を選択した後に減少する。 kは²値はフーリエ空間における空間kベクトルの二乗の大きさである。
      最初に、解析は最高の値が決定されるまで、データ系列のすべての連続した映画のために同じ設定を使用し、繰り返したが、常に選択した設定は、データへの良好なフィット感を与えていることを確認する必要があります。良いKを²プロットと線形拡散プロット。
   4. 「ストアの設定をして続行」をクリックします。
   5. すべてのグラフを表示するには「はい」ボタンをクリックします。
   6. 「ロード·イメージシリーズ」（ 図1の円2参照）をクリックして、「ワークスペース」をクリックしてください。
   7. 「imgSerCrop」を選択して、「ワークスペースからインポート」をクリックしてください。
   8. イメージング·システム収集の設定を入力します。ボックスに「画素サイズ」は、画像スタックが取得される撮像システムのための投影されたピクセルサイズを入力する。 AQP3-EGFPについては、0.111を用いた。ボックス」フレーム間の時間（秒）を入力 "は、0.1150はAQP3-EGFPのために使用した。
   9. 「関心領域を選択」をクリックし、「1」を入力し、[OK]をクリックし、「画像全体を使用する」。
   10. 「ドゥKICS分析」をクリックして、「不動のフィルタリング」を行うには、[はい]をクリックします。結果は画像として自動的に開きます。
   11. 設定ウィンドウを最小化し、セル情報WINDOを最小限に抑えるW、および光物理ウィンドウを最小化します。ダイナミクスウィンドウで、ダイナミクスのプロットは、データ点を相関させ、自由拡散を想定することができることを意味し、負の傾きを持つラインにデータの線形近似を示していることを確認します。特定のタイムラグのための拡散係数を記録し^、2の設定を（それがフィットの標準偏差を注意することは必要ありません）K。 K ²のプロットのデータポイントは、遅れている所定の時間線の周りのクラスタ化されなければならない。
   12. チェックボックス "イメージとしてオープン数値を保存」、結果ファイルを保存する」イメージとしてオープン数値を保存」をクリックしてください。 Cの下に新しいフォルダに保存：ユーザードキュメントはAQP3diffusionを。 「明確な現在のデータを "クリックして次の作物の分析に進みます。

計算された拡散係数3。平均は、分析したデータの概​​要を把握するために計算されている

1. SPREに各ROIから個々の拡散係数を入力してくださいadsheet（τに注意し^、2の値をkとを確認してください）、以上のように作物の名前を使用します。
2. 表計算プログラムを使用して、平均拡散係数と標準偏差を計算する。
3. 5％の有意水準を使用して統計的差異を評価するために、コルモゴロフ - スミルノフ検定や学生のt検定を実行します。細胞（例えば、未処理対処理された）との間のQuantitaveの比較を行うことができる。
4. それぞれの作物のための解析ソフトウェアによって生成され、各時間遅れのために、各条件についてのデータを平均化した拡散プロットのスプレッドシートのバージョンを開く。論文やプレゼンテーションで提示するための新たな平均を拡散プロットを生成します。

結果

KICSと、分析されるべき適切な画像スタックを取得するために、異なる顕微鏡システムを使用することができる。なお、落射蛍光顕微鏡ならびにTIRFまたはスピニングディスクセットアップから画像シーケンスを分析することが可能である。膜は、任意の大規模な移動、細胞小器官なしで、または小胞/オブジェクトを移動平面である必要があります。本稿では、9.2ヘルツのフレームレートで原...

ディスカッション

本論文では、蛍光タンパク質で標識されたタンパク質の顕微鏡画像から拡散係数を決定するために、KICS解析法を適用する方法の詳細なステップバイステップの概要を発表した。分析は、標識密度の非常に広いダイナミックレンジを有するプローブの選択とは無関係であり、従って、量子ドットならびにEGFPのような色素および蛍光タンパク質で標識されたタンパク質に適用することができる?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+