Легко Измерение коэффициентов диффузии в EGFP-меченых белков плазматической мембраны Использование К-пространство изображения корреляционной спектроскопии

Резюме

Эта статья предоставляет пошаговое руководство к технике анализа колебания к-пространственной корреляции изображения спектроскопии (Kics) для измерения коэффициентов диффузии из флуоресцентно меченных плазмы мембранных белков в живых клетках млекопитающих.

Аннотация

Боковая диффузия и компартментализация плазменных мембранных белков жестко регулируется в клетках и, таким образом, изучая эти процессы покажет новое понимание плазмы функции белка мембраны и регулирования. Недавно, к-пространственной корреляции изображения спектроскопия (Kics) ¹ был разработан для того, чтобы обычные измерения коэффициентов диффузии непосредственно из образов флуоресцентно меченых белков плазматической мембраны, что избежать систематических ошибок, вносимых зонда фотофизики. Хотя теоретической основой для анализа является сложным, способ может быть реализован с использованием неспециалистов свободном доступе код для измерения коэффициентов диффузии белков. Kics вычисляет время корреляционной функции из стека изображений флуоресцентной микроскопии после преобразования Фурье каждого изображения на обратной (к-) пространстве. Впоследствии, круговая усреднение, натуральный логарифм преобразования и линейная подходит для корреляционной функции дает коэффициент диффузии. Этодокумент содержит шаг за шагом руководство по анализу изображений и измерения коэффициентов диффузии через Kics.

Во-первых, высокая частота кадров последовательность образ дневно с надписью плазмы мембранного белка приобретается с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем выбирается область интереса (ROI) избегая внутриклеточных органелл, двигаясь пузырьки или выступающие мембранные регионы. Стек ROI импортируется в свободном доступе кода и несколько определенных параметров (см. раздел Method) установлены для анализа Kics. Затем программа создает "крутизны склонов" заговора от К-пространстве времени корреляционных функций, а коэффициент диффузии рассчитывается по наклону участка. Ниже шаг за шагом Kics процедура измерения коэффициента диффузии мембранных белков с помощью почечной воды канала аквапорин-3 с меткой EGFP как канонический пример.

Введение

Четырехмерной пространственно-временной организации и боковая подвижность плазмы мембранных белков жестко регулируется и может играть роль в функции белка, активности и белок-белковых взаимодействий. Боковая диффузия плазмы мембранных белков, традиционно изучались путем расчета коэффициентов диффузии для одиночных частиц от покадровой визуализации квантовой точки или красителя меченых белков плазматической мембраны ^2-4. Этот подход требует вставку внеклеточного тега в плазматической мембране белка для квантовой точки или маркировки красителем, который может поставить под угрозу складывание и функции белков и, таким образом, не может быть достигнуто в течение нескольких белков. Стерическое объем квантовой точки, как было показано замедлить диффузию белка ⁵ и более того, лишь малая часть из белков в популяции помечены с квантовыми точками, и это не известно, если эта доля является репрезентативной для общей бассейн плазменных мембранных белков. Холост тра частицCking (СПТ) измерения коэффициентов диффузии из серии изображений на квантовых точках меченых белков включает в себя отображение отображаемого пиковые положения частиц с двумерной гауссовой подходит с последующим обильным алгоритмов анализа. Анализ вычислительно очень интенсивно, требуются обширные нелинейную кривую установки в каждом изображении кадра последовательности покадровой для приближений функции рассеяния точки микроскоп (обычно Двухмерный пространственный гауссианов) и последующего сшивания позиций частиц в траекторий частиц, описывающая движение отдельных молекул ^6,7.

Недавно был разработан корреляция техника изображения, к-пространственной корреляции изображения спектроскопия (Kics) позволяет относительные простые измерения коэффициентов диффузии флюоресцентно тегом плазменные мембранные белки. Возможность регулярно расчета коэффициентов диффузии мембранных белков, меченных флуоресцентными белками на Kics является уникальным инструментом, который держитнесколько преимуществ по сравнению с традиционными квантовой точки анализ SPT: Нет вставки внеклеточных тегов и трудоемким внеклеточный маркировки не требуется (можно использовать клеточные линии, экспрессирующие флуоресцентные белки); Коэффициенты диффузии извлекаются из общего пула флуоресцирующих белков по сравнению с подмножеством меченного с квантовыми точками; анализ просто без необходимости отслеживания одиночные белки и анализ может быть проведен с использованием существующего кода без каких-либо необходимых дополнительных пользовательского программирования. Метод быстрый, потому что это техника усреднения, который позволяет быстро вычисление и расчет коэффициентов диффузии. Эти быстрые измерения диффузии для населения белка дополнить более подробную информацию молекулярную транспортного полученное для подмножества населения по кропотливых методов ППП.

Kics время коррелирует флуоресцентной микроскопии последовательности изображений, которые сначала были трансформированы в космос Фурье, и тем самым отделяет этколебания uorescence из-за фотофизики от тех, из-за молекулярного транспорта ^1. В результате Kics может определить плотность номер, скорость потока и диффузии флуоресцентно меченных молекул, будучи беспристрастным комплексным фотообесцвечивания или мерцание флуорофоров. Это делает Kics полезный инструмент для быстрого определения динамики диффузии флуоресцентно меченных белков клеточной мембраны без необходимости пользовательских алгоритмов записи. Кроме того флуоресцентно меченых белков, Kics также может быть применен к квантовых точек меченных белков мембраны ^8.

Эта статья предоставляет шаг за шагом введение, как использовать Kics извлечь коэффициентов диффузии EGFP-меченых белков плазматической мембраны, демонстрируя, как поместить урожай, как использовать код и как оценить сформированные участки, из которых диффузия коэффициенты извлекаются. В качестве примера, данные, полученные спиннинг диск-микроскопии набор в полу-полного внутреннего отражения светитьсяРежим сть (TIRF), из почек белка вода канала аквапорин-3 (AQP3) помеченным EGFP представлена.

протокол

Приобретение EGFP с метками белков в мембране для анализа Kics может быть сделано на эпифлуоресцентной микроскопом, установке TIRF или на вращающемся диске микроскопом, установленного для получения изображений мембраны интересов. Размер пикселя камера, а также время между кадрами изображения необходим для анализа. Последовательности изображений из 100-1,200 кадров с частотой кадров 4-30 Гц могут быть использованы для анализа. В ходе сбора, важно, чтобы держать мембрану в фокусе в течение всего срока визуализации и сосредоточить внимание на долю от плоской мембраны, в котором флуоресценция равномерно распределенной. Перемещение пузырьки, выступающие мембранные регионы и клеточные органеллы могут быть обрезаны позже в процессе анализа. Время сбора должны быть выбраны таким образом, что нет дрейф или движение клетки.

Чтобы получить код скрипты Kics для MATLAB, контакт Пол Уайзман (Paul.Wiseman @ McGill.ca). В первый раз код Kics используется, откройте коврикLAB и нажмите файл, а затем установите путь, а затем нажмите добавить с подпапками и найти папку на компьютере, в котором код Kics находится. Нажмите кнопку ОК, сохранить и закрыть. Теперь переходите к анализу культур, описанных в следующих пунктах.

1. Импорт последовательности изображений о заинтересованности в программе обработки изображений анализ как TIFF Stack

Сохраните файл с именем: stack1.tif.

1. Выберите прямоугольную область интереса (ROI) в равнинной части мембраны учета движущихся органеллы клеток и выступающей мембранные регионы. Размер урожая выбрана так, что достаточно Статистика генерируется для хорошего K ² участков.
2. Обрезать область и сохранить урожай в виде файла TIFF в соответствующую папку. Если есть несколько культур от одноименного фильма, используйте номер приращение, например, "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Поместите папку, содержащую культур локальнона компьютере, а не на сервере, делая анализ Kics.

2. Импорт культур в Analysis Software по одному, чтобы выполнить анализ

1. Открыть MATLAB и тип "icsgui" в окне командной строки и нажмите клавишу ВВОД. ICS GUI является имя исполняемого на изображение корреляционной спектроскопии графический интерфейс программы.
2. В ICS GUI перейдите на вкладку "Kics". Снимок экрана окна анализа показано на рисунке 1.
3. Найдите папку с именем папки "MATLAB кода" и выделите файл с именем файла "Scripts" и открыть в этом, дважды щелкнув его. Кроме того, щелкните правой кнопкой мыши на файл и выберите "открыть с MATLAB" или пойти в файл, открытый в MATLAB и откройте файл скрипты. Этот файл называется редактор.
4. В редакторе перейдите к пункту "Load Kics наборы данных", а затем скопировать или имя типа файла и пути папки в командную строку, которая начинаетсяс Попадания = например "C: Users Документы AQP3dynamics stack1crop.tif". В командной строке ниже папке установить количество кадров, которые будут проанализированы - например [1:500]. Используйте те же настройки для всех последовательных фильмов в серии данных. Если есть фокус дрейф в последующих кадрах, они должны быть исключены из анализа.
5. В редакторе нажмите "сохранить" и нажмите кнопку "оценить ячейку". Набор данных в настоящее время загружены в в программное обеспечение анализа.
6. В окне Kics анализа в графическом интерфейсе, введите параметры для анализа:
   1. Отключив функцию «Т-клеточные" коробки.
   2. Введите число временных лагов, которые будут проанализированы. Количество временных лагов (τ) будет иметь влияние на диффузию участка и должны быть выбраны таким образом, что диффузия участок является линейной. Начните с ввода 25, а затем снизится до где диффузия участок является линейной. τ является количество времени лаги анализ Kics сравнивает и временной лаг время бetween один кадр и на следующий. Наименьшее значение, которое дает линейную участок должен быть выбран. Максимальное количество временных задержек выбрана так, что линейная аппроксимация получается, выбирая более высокое значение будет производить данные, которые не могут быть установлены линии.
   3. Введите максимальное K ² значение (см. круг 1 на рисунке 1), то, как правило 20-50. Хороший к. ² Сюжет сюжет, в котором есть много точек данных, которые распределены вдоль линии. Начните с ввода 70, а затем уменьшается после Оценив K ² и диффузии участков и выберите наименьшее значение, где кластер точек данных вокруг прямой линии. Значение K ² является квадратом величины пространственно-к-вектора в пространстве Фурье.
      Первоначально, анализ должен быть повторен до лучшие значения не определяются, а затем использовать те же настройки для всех последовательных фильмов в серии данных, но всегда убедитесь, что выбранные настройки дают хорошую подгонку к данным: Добрый K ² участкови линейной диффузии участок.
   4. Нажмите "хранения настроек и продолжить".
   5. Нажмите кнопку "да" на все графики.
   6. Нажмите кнопку "Load серию изображений" (см. круг 2 на рисунке 1), затем нажмите кнопку "рабочее пространство".
   7. Выберите "imgSerCrop", затем нажмите кнопку "Импорт из Workspace".
   8. Введите параметры сбора система визуализации. В "размером пикселя" окно введите размер проецируемого пикселя для системы формирования изображения, при котором изображение стеки приобретенной. Для AQP3-EGFP, 0,111 использовался. В поле "Введите время (ы) между кадрами", 0.1150 был использован для AQP3-EGFP.
   9. Нажмите "выберите трансформирования", введите "1", нажмите ОК и "использовать все изображение".
   10. Нажмите кнопку "Do Kics анализ" и нажмите да делать "неподвижный фильтрацию". Результаты автоматически откроется в виде изображений.
   11. Свернуть окно настроек, минимизировать информации базовой Windoж, и свернуть окно Фотофизика. В окне динамики, проверьте, что сюжет динамика показывает линейную подгонку данных на линии с отрицательным наклоном, означающего, что точки данных коррелируют и свободная диффузия можно предположить. Запишите коэффициент диффузии для конкретного временного лага и K ² настройки (это не необходимо отметить стандартное отклонение подгонки). Точки данных в K ² участков должны быть в районе черты для данного времени отстает.
   12. Сделать отметку "Сохранить открытые фигуры, как образов", затем нажмите кнопку "Сохранить открытые цифры как изображения", чтобы сохранить результат файлов. Сохранить в новой папке под C: Users Documents AQP3diffusion. Нажмите кнопку "Очистить текущий данные" и продолжить с анализом следующего урожая.

3. Среднее из рассчитанных коэффициента диффузии рассчитывается, чтобы получить обзор анализируемых данных

1. Ввести отдельные коэффициенты диффузии от каждого ROI в SPREadsheet (убедитесь отметить τ и K ² значения), используйте имена культур, как устанавливается выше.
2. Рассчитайте среднее коэффициент диффузии и стандартное отклонение, используя программу электронных таблиц.
3. Выполните проверку Колмогорова-Смирнова или студентов т-тест для оценки статистических различий с использованием 5% уровень значимости. Количественная сравнения между клетками (например лечение против необработанный) могут быть сделаны.
4. Откройте таблицу версию диффузии участков, которые были порожденных программного обеспечения для анализа для каждой культуры, и усреднять данные для каждого условия для каждого временного лага. Создайте новый усредненный диффузии участок для представления в докладах или презентациях.

Результаты

Для приобретения подходящих стеки проанализировать изображение с Kics, различные системы микроскоп может быть использован. Можно проанализировать последовательности изображений из эпи-флуоресцентного микроскопа, а также TIRF или спиннинг установки диска. Мембрана должна быть ровной бе...

Обсуждение

Эта статья представила подробную шаг за шагом обзор того, как применять метод анализа Kics определить коэффициенты диффузии от микроскопии изображений белков отмеченных флуоресцентных белков. Анализ не зависит от выбора зонда с очень широким динамическим диапазоном плотности маркиро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+