Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Riepilogo

Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine ​​di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.

Abstract

Diffusione laterale e la compartimentalizzazione delle proteine ​​di membrana del plasma sono strettamente regolati nelle cellule e, quindi, lo studio di questi processi saranno rivelare nuovi spunti per la funzione delle proteine ​​di membrana plasmatica e la regolamentazione. Recentemente, k-spazio correlazione Immagine Spectroscopy (CCI) ¹ è stato sviluppato per consentire misurazioni di routine di coefficienti di diffusione direttamente dalle immagini delle proteine ​​di membrana plasmatica con targhetta modo fluorescente, che evitate distorsioni sistematiche introdotte dal fotofisica sonda. Sebbene la base teorica per l'analisi è complessa, il metodo può essere implementato da non esperti utilizzando un codice liberamente disponibile per misurare coefficienti di diffusione di proteine. CCI calcola una funzione di correlazione tempo da una pila di microscopia a fluorescenza dopo trasformazione di Fourier di ogni immagine reciproca spazio (k-). Successivamente, media circolare, logaritmo naturale trasformare e lineare adatta per la funzione di correlazione produce il coefficiente di diffusione. Questodocumento fornisce una guida step-by-step per l'analisi delle immagini e la misurazione dei coefficienti di diffusione via CCI.

In primo luogo, un frame rate elevato sequenza di immagini di una proteina di membrana plasmatica fluorescente viene eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza. Poi, è selezionata una regione di interesse (ROI) evitando organelli intracellulari, vescicole mobili o sporgenti regioni di membrana. Lo stack ROI viene importato in un codice liberamente disponibile e diversi parametri definiti (vedi sezione Method) sono impostati per l'analisi CCI. Il programma genera quindi un "pendio di piste" complotto dalle funzioni di tempo di correlazione k-spazio, e il coefficiente di diffusione è calcolato dalla pendenza del grafico. Qui di seguito è una procedura step-by-step CCI per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana utilizzando l'renale canale di acqua aquaporin-3 con etichetta EGFP come un esempio canonico.

Introduzione

L'organizzazione spazio-temporale quadridimensionale e mobilità laterale delle proteine ​​di membrana di plasma sono strettamente regolati e possono svolgere un ruolo nella funzione della proteina, l'attività e le interazioni proteina-proteina. Diffusione laterale delle proteine ​​di membrana del plasma, è tradizionalmente stata studiata calcolando i coefficienti di diffusione per singole particelle di time-lapse imaging di quantum dot o tingere etichettati proteine ​​della membrana plasmatica ^2-4. Questo approccio richiede l'inserimento di un tag extracellulare della proteina di membrana plasmatica per quantum dot o etichettatura colorante, che può compromettere folding e la funzione e, quindi, non può essere raggiunto per alcune proteine. Il volume sterico di un punto quantico ha dimostrato di rallentare la diffusione della proteina ⁵ ed inoltre, solo una piccola frazione delle proteine ​​nella popolazione rechino punti quantici, e non è noto se la frazione è rappresentativa del totale pool di proteine ​​di membrana plasmatica. TRA singola particellacking (SPT) misurazioni dei coefficienti di diffusione di immagine serie di proteine ​​marcate quantum dot coinvolge la mappatura delle posizioni di punta impressi delle particelle con bidimensionale gaussiano si adatta seguiti da ampie algoritmi di analisi. L'analisi è computazionalmente molto intenso, che richiede un'ampia curva non lineare adatta in ogni fotogramma l'immagine di una sequenza di time-lapse per approssimazioni della funzione microscopio punto di spread (tipicamente bidimensionale gaussiane spaziale) e il successivo collegamento delle posizioni delle particelle in traiettorie delle particelle descrive l' moto delle singole molecole ^6,7.

Un'immagine tecnica di correlazione sviluppata di recente, k-spazio Image Correlation Spectroscopy (CCI) permette semplici misurazioni relative di coefficienti di diffusione di fluorescenza tagged proteine ​​di membrana del plasma. La possibilità di calcolare regolarmente coefficienti di diffusione delle proteine ​​di membrana marcate con proteine ​​fluorescenti da CCI è uno strumento unico che tienediversi vantaggi rispetto quantum dot tradizionale analisi SPT: Non è richiesto alcun inserimento di tag extracellulari e richiede tempo etichettatura extracellulare (linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati); coefficienti di diffusione sono estratti dal pool totale di proteine ​​fluorescenti rispetto a un sottoinsieme etichettato con punti quantici; analisi è semplice, senza la necessità di monitorare singole proteine ​​e l'analisi può essere eseguita utilizzando un codice esistente senza necessità di programmazione utente aggiuntivo. Il metodo è veloce perché è una tecnica che permette il calcolo della media veloce e calcolo dei coefficienti di diffusione. Queste misure diffusione rapidi per la popolazione proteina completano le informazioni più dettagliate trasporto molecolare ottenuto per un sottoinsieme della popolazione dai metodi SPT scrupoloso.

tempo CCI correla microscopia a fluorescenza sequenze di immagini che sono stati prima trasformati in spazio di Fourier, e quindi separa flfluttuazioni uorescence dovute a fotofisica da quelli dovuti al trasporto molecolare ^1. Come risultato, CCI possono determinare la densità numerica, velocità di flusso, e la diffusione di fluorescente molecole marcate pur essendo distorti da fotoscolorimento complesso o lampeggiante dei fluorofori. Questo rende CCI uno strumento utile per determinare rapidamente la dinamica di diffusione di proteine ​​della membrana cellulare fluorescenza marcata senza la necessità di algoritmi di scrittura personalizzati. Proteine ​​Oltre fluorescente, CCI possono essere applicate anche a Quantum Dot-marcato proteine ​​di membrana ^8.

Questo documento fornisce un'introduzione step-by-step di come usare CCI per estrarre i coefficienti di diffusione delle proteine ​​di membrana plasmatica EGFP-taggate dimostrando come posizionare il raccolto, come utilizzare il codice e come valutare le trame generate, da cui diffusione coefficienti vengono estratti. Come esempio, i dati ottenuti facendo girare insieme di dischi-microscopia a riflessione interna totale semi-fluorescenzaModalità nce (TIRF), di una proteina renale canale di acqua aquaporin-3 (AQP3) con etichetta EGFP è presentato.

Protocollo

Acquisizione di proteine ​​EGFP-tag nella membrana plasmatica di analisi CCI può essere fatto su un microscopio a epifluorescenza, una configurazione TIRF o su un microscopio disco rotante impostato per acquisire immagini della membrana di interesse. La dimensione pixel fotocamera così come il tempo tra i fotogrammi immagine è necessario per l'analisi. Sequenze di immagini di 100-1,200 fotogrammi a una frequenza di 4-30 Hz possono essere utilizzate per l'analisi. Durante l'acquisizione, è importante mantenere la membrana a fuoco per tutta la durata della rappresentazione e concentrarsi su una frazione della membrana piatta in cui la fluorescenza è distribuita uniformemente. Spostamento di vescicole, sporgenti regioni di membrana e organelli cellulari può essere tagliata fuori più avanti nel processo di analisi. Il tempo di acquisizione dovrebbe essere scelta in modo che non vi è nessuna deriva o movimento della cellula.

Per ottenere gli script di codice CCI per MATLAB, contattare Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La prima volta che il codice CCI viene utilizzato, MAT apertoLAB e fare clic su File, quindi impostare il percorso, quindi aggiungere con sottocartelle e trovare la cartella nel computer in cui si trova il codice CCI. Quindi fare clic su ok, salvare e chiudere. Continuare ora con l'analisi di colture descritte nei punti successivi.

1. Importare la sequenza di immagini d'interesse in un programma di analisi di imaging come TIFF Stack

Salvare il file con il nome: stack1.tif.

1. Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) in corrispondenza della parte piatta della membrana escluse organelli cellulari mobili e sporgente regioni di membrana. La dimensione raccolto è scelto in modo che un numero sufficiente di statistiche vengono generati per il bene k ² terreni.
2. Ritagliare la regione e salvare il raccolto come file TIFF in una cartella appropriata. Se ci sono più colture dal film stesso, utilizzare un numero minimo, per esempio "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
3. Posizionare la cartella contenente i raccolti a livello localesul computer, non su un server, mentre si fa l'analisi CCI.

2. Importare le colture nel software di analisi One by One per eseguire l'analisi

1. Aprire MATLAB e digitare "icsgui" nella finestra di comando e premere INVIO. ICS GUI è il nome del file eseguibile del programma di grafica dell'interfaccia utente spettroscopia di correlazione di immagine.
2. Nella GUI ICS fare clic sulla scheda "CCI". Una schermata della finestra di analisi è illustrata nella Figura 1.
3. Trovare la cartella con il nome della cartella "codice MATLAB" e scorrere fino al file con il nome del file "Script" e aprire con un doppio clic su di esso. In alternativa, fate clic destro sul file e selezionare "Apri con MATLAB" o vai su File, Apri in MATLAB e aprire il file script. Questo file si chiama Editor.
4. Sul rotolo Editor per "CCI carico set di dati", quindi copiare o nome file tipo e la posizione della cartella nella linea di comando che iniziacon img = ad esempio "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". Nella riga di comando sotto il percorso della cartella impostare il numero di fotogrammi da analizzare - per esempio [1:500]. Utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati. Se c'è deriva fuoco in frame successivi, questi dovrebbero essere esclusi dall'analisi.
5. Nell'editor fare clic su "salva" e poi cliccare su "valutare cella". Il set di dati viene caricato in nel software di analisi.
6. Nella finestra Analisi CCI nella GUI, immettere le impostazioni per l'analisi:
   1. Deselezionare le caselle "cellule T".
   2. Inserisci il numero di scarti temporali da analizzare. Il numero di intervalli di tempo (τ) avrà effetto sulla trama di diffusione e deve essere scelta in modo che la trama diffusione è lineare. Inizia con l'immissione di 25 per poi diminuire al punto in cui la trama diffusione è lineare. τ è il numero di Tempi di attesa dell'analisi CCI confronta e un tempo di ritardo è il tempo bra un fotogramma e il successivo. Dovrebbe essere selezionato il valore più piccolo che dà una trama lineare. Il numero massimo di sfasamenti temporali è scelto in modo da ottenere una misura lineare, scegliendo un valore elevato produce dati che non possono essere montati linea.
   3. Inserire il valore massimo k ² (vedi cerchio 1 in figura 1), è di solito 20-50. Un buon k ² trama è una trama in cui ci sono molti punti di dati che sono distribuiti lungo una linea. Inizia all'entrata 70 e poi diminuire dopo aver valutato le k ² e diffusione trame e selezionare il valore più basso in cui il cluster punti dati attorno ad una linea retta. Il valore k ² è la grandezza quadrata della k-vettore spaziale nello spazio di Fourier.
      Inizialmente, l'analisi deve essere ripetuta fino a quando vengono determinati i valori migliori, quindi utilizzare le stesse impostazioni per tutti i film consecutivi nella serie di dati, ma sempre verificare che le impostazioni selezionate danno una buona misura per i dati: buona k ² piazzolee una trama diffusione lineare.
   4. Fare clic su "Impostazioni negozio e procedere".
   5. Fare clic su "sì" per visualizzare tutti i grafici.
   6. Fare clic su "serie di immagini Load" (vedi cerchio 2 in Figura 1), poi cliccare su "area di lavoro".
   7. Selezionare "imgSerCrop", quindi fare clic su "Importa da lavoro".
   8. Immettere le impostazioni della raccolta sistema di imaging. Nella "dimensione pixel" casella immettere la dimensione dei pixel previsto per il sistema di imaging in cui le pile di immagini vengono acquisite. Per AQP3-EGFP, 0.111 è stato utilizzato. Nella casella "Immettere il tempo (s) tra i fotogrammi", 0,1150 è stato utilizzato per AQP3-EGFP.
   9. Fare clic su "seleziona ROI", inserire "1", fare clic su ok e "usare tutta l'immagine".
   10. Fare clic su "Analisi Do CCI" e fare clic su Sì per fare "filtraggio immobile". I risultati si apriranno automaticamente le immagini.
   11. Minimizzare la finestra delle impostazioni, ridurre al minimo le informazioni cellule window, e ridurre al minimo la finestra fotofisica. Nella finestra dinamiche, verificare che la trama dinamica mostra un fit lineare dei dati a una linea con una pendenza negativa significa che i punti dati correlano e libera diffusione può essere assunta. Registrare il coefficiente di diffusione per l'intervallo di tempo specifico e k ² impostazioni (non è necessario rilevare la deviazione standard del fit). I punti dati in k ² terreni devono essere raggruppati attorno alla linea per il tempo determinato ritardi.
   12. Barrare la casella "Salva figure aperte come immagini", quindi fare clic su "Salva figure aperte come immagini" per salvare i file risultato. Salvare in una nuova cartella in C: Users Documenti AQP3diffusion. Fare clic su "dati attuali chiara" e proseguire con l'analisi del prossimo raccolto.

3. Medio del coefficiente di diffusione calcolata è calcolato per ottenere una panoramica dei dati analizzati

1. Immettere i coefficienti di diffusione individuali di ogni ROI in un SPREadsheet (assicuratevi di annotare il τ e k ² valori), utilizzare i nomi delle colture, come stabilito in precedenza.
2. Calcolare il coefficiente medio di diffusione e la deviazione standard utilizzando un foglio di calcolo.
3. Eseguire un test di Kolmogorov-Smirnov o studenti t-test per valutare le differenze statistiche utilizzando un livello di significatività del 5%. Confronti Quantitave tra le cellule (per esempio trattati vs non trattati) possono essere fatte.
4. Aprire la versione foglio delle piazzole di diffusione che è stato generato dal software di analisi per ciascuna coltura, e nella media dei dati per ciascuna condizione per ogni intervallo di tempo. Genera una nuova trama diffusione media per la presentazione di documenti o presentazioni.

Risultati

Per acquisire stack di immagini adatte ad essere analizzati con CCI, possono essere utilizzati diversi sistemi microscopio. È possibile analizzare sequenze di immagini da un microscopio epi-fluorescenza, nonché una configurazione disco TIRF o filatura. La membrana deve essere piatta, senza grandi organelli cellulari in movimento o lo spostamento di vescicole / oggetti. Questo articolo presenta una sequenza di immagini lasso di tempo di AQP3 con etichetta EGFP in cellule MDCK vive impressi su un microscopio disco rotan...

Discussione

Questo documento presenta una panoramica dettagliata passo-passo su come applicare il metodo di analisi CCI per determinare i coefficienti di diffusione di immagini di microscopia di proteine ​​marcate con proteine ​​fluorescenti. L'analisi è indipendente dalla scelta sonda con una ampia gamma dinamica della densità etichettatura e può quindi essere applicato anche per proteine ​​marcate con punti quantici così come coloranti e proteine ​​fluorescenti come la EGFP.

Pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+