Evaluación del desempeño funcional en el<em&gt; Mdx</em&gt; Modelo de ratón

Resumen

La medida de resultado primaria en los ensayos clínicos de trastornos neuromusculares en general se mejoró la función muscular. Por lo tanto, la evaluación del efecto de los compuestos terapéuticos potenciales sobre el rendimiento muscular pre clínica en modelos de ratón es de gran importancia. Se describen varias pruebas funcionales para abordar esta cuestión.

Resumen

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un músculo severa y progresiva perder trastorno para el que no hay cura disponible. Sin embargo, varios compuestos farmacéuticos potenciales y estrategias de terapia génica han progresado en los ensayos clínicos. Con la mejora en la función muscular es el punto final lo más importante en estos ensayos, mucho énfasis se ha puesto en la creación de fiable, reproducible y fácil de realizar pruebas funcionales de comprobar la validez clínicamente evaluar la función muscular, la fuerza, la condición y la coordinación en la modelo de ratón mdx de la DMD. Ambas pruebas invasivas y no invasivas disponibles. Los exámenes que no agraven la enfermedad pueden ser usados ​​para determinar la historia natural de la enfermedad y los efectos de las intervenciones terapéuticas (p. ej. Prueba de la fuerza de agarre de la extremidad anterior, dos pruebas que cuelgan diferentes utilizando ya sea un cable o una rejilla y rotarod ejecución). Alternativamente, forzada la cinta rodante puede ser utilizado para mejorar la progresión de la enfermedad y / o evaluarefectos protectores de las intervenciones terapéuticas en patología de la enfermedad. Se describen cómo realizar estas pruebas funcionales más utilizadas de una manera fiable y reproducible. El uso de estos protocolos basados ​​en procedimientos operativos estándar permite la comparación de datos entre diferentes laboratorios.

Introducción

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la enfermedad neuromuscular más común que afecta a 1:5.000 varones recién nacidos. Esta enfermedad pérdida de masa muscular severa y progresiva es causada por mutaciones en el gen de la DMD que alteran el marco de lectura abierto y previenen la síntesis de la proteína distrofina funcional. Las fibras musculares que carecen de distrofina son vulnerables al daño inducido por el ejercicio. En caso de agotamiento de la capacidad de regeneración del músculo, y debido a la inflamación crónica del músculo dañado, fibras son reemplazadas por tejido conectivo y grasa, que posteriormente conducen a una pérdida de la función. En general, los pacientes con DMD pierden la deambulación de los miembros inferiores primeros en la segunda década. Más tarde, también los músculos de los brazos y la cintura escapular son afectados y los pacientes a menudo desarrollan escoliosis toracolumbar debido al debilitamiento asimétrica de los músculos que sostienen la columna vertebral. La ventilación asistida se requiere generalmente en la adolescencia o veinteañeros. Respiratorio y el corazón de plomo fracasoa la muerte en la tercera o cuarta década ^1.

Aunque el gen causante se ha descubierto hace más de 25 años ^2, no existe una cura disponible para la DMD. Sin embargo, la mejora de la atención de salud y el uso de corticosteroides han aumentado la esperanza de vida en el mundo occidental ^3. Con el uso de modelos animales como el ratón mdx, grandes avances en el descubrimiento de posibles estrategias terapéuticas se han hecho. El ratón mdx es el modelo de ratón DMD más utilizado. Tiene un punto de mutación en el exón 23 del gen murino Dmd y, en consecuencia carece de distrofina ^4. Durante el último par de años, muchas de las estrategias propuestas han progresado en los ensayos clínicos ^5-9. En estos ensayos, la mejora de la función muscular es el criterio principal de valoración, que subyace a la importancia de probar el beneficio de los compuestos sobre la función muscular en ratones durante la etapa de pre clínica de las pruebas.

Como DMDpacientes, también las fibras musculares negativas distrofina de ratones mdx son vulnerables al daño inducido por el ejercicio y la función muscular se deteriora en comparación con los ratones de tipo salvaje C57BL/10ScSnJ. Este deterioro se puede evaluar con una variedad de pruebas funcionales. Algunas de estas pruebas son no invasivos y no interfieren con la patología muscular (por ejemplo, la fuerza de prensión de la extremidad anterior, las pruebas que cuelgan y rotarod ejecución). Por lo tanto pueden ser utilizados para controlar la historia natural de la enfermedad o para determinar los efectos de los compuestos sobre la progresión de la enfermedad. Para obtener una imagen en profundidad de la influencia de los compuestos sobre la función muscular en ratones mdx, un régimen de ensayo funcional que no interfiera con la progresión de la enfermedad que consiste en todas estas pruebas se puede utilizar ^10.

Alternativamente, forzada la cinta rodante puede ser utilizado para exacerbar intencionalmente progresión de la enfermedad y probar las capacidades de protección de compuestos ^11. La cinta también puede serutiliza como medida de resultado en el que tiempo de funcionamiento hasta el agotamiento se mide ^12, o como una herramienta para los ratones mdx de fatiga para que rinden menos en una prueba de funcionamiento posterior garantizar mayores diferencias en el rendimiento entre los grupos de tratamiento ^13. Al elegir las pruebas funcionales, su efecto sobre la progresión de la enfermedad se debe tener en cuenta especialmente cuando se prueba los ratones distróficos como el ratón mdx ^14.

Se describen en detalle cómo realizar las pruebas funcionales más utilizadas de una manera fiable y reproducible sobre la base de los procedimientos de operación estándar disponibles de la red TREAT-NMD. Haga clic aquí para visitar TREAT-NMD .

Protocolo

Los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Ética Animal (DEC) del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). Los ratones fueron criados por el animalario del LUMC y se mantienen en jaulas ventiladas individualmente con 12 ciclos de oscuridad luz hr. Tenían acceso ad libitum al agua y al pienso estándar.

Al realizar alguna de las pruebas funcionales se describen a continuación, las condiciones experimentales tienen que ser estrictamente controlada para reducir la variación. Preferiblemente, edad y sexo ratones emparejados deben utilizarse, como el rendimiento se diferencia entre la edad y sexos. Los ratones pertenecientes a la misma camada deben ser asignados al azar en los grupos experimentales. Los animales deben ser probados por el mismo operador, que está ciego a los grupos experimentales. Las pruebas deben realizarse en el mismo momento del día y día de la semana, la misma sala para igualar olores, ruidos, etc ¹⁴ gran variación entre los ratones individuales y puntos de tiempo se observa para todospruebas funcionales, por lo tanto / deberían utilizarse grupo experimental 6-8 ratones. Rendimiento de la prueba funcional también puede diferir en gran medida entre las diferentes cepas de tipo salvaje endogámicas. Por lo tanto, los ratones de tipo salvaje experimentales y de control deben siempre han fondos correspondiente (en el caso de los ratones mdx utilizar el C57BL/10ScSnJ cepa de tipo salvaje). Todos los datos que se describen aquí se han obtenido con la C57BL/10ScSnJ cepa de tipo salvaje, al cual nos referimos como el tipo salvaje de aquí en adelante. Los ensayos descritos aquí se pueden utilizar longitudinalmente desde al menos 1-19 meses de edad en los ratones de tipo salvaje y mdx. Las pruebas no deben repetirse más de una vez por semana para evitar que los ratones de la pérdida de interés y voluntad para llevar a cabo la tarea.

1. Prueba de fuerza de agarre Miembro Anterior

Utilice la prueba de fuerza de agarre de la extremidad anterior para medir la fuerza de las extremidades anteriores. La prueba se basa en la tendencia de un ratón para captar instintivamente una cuadrícula cuando se suspenden por la cola ^15, y ADAPTEd de DMD_M2.2.001.pdf .

1. Aparato creó: Coloque una cuadrícula a un transductor de fuerza, que mide la fuerza máxima aplicada por el ratón en la parrilla durante el tirón. Asegúrese de que el ajuste es el modo de tensión máxima (T-PK) para tirar. Las unidades de fuerza puede ajustarse en cualquiera de oz-de-force, gramos-de-force, libras-de-force, kilogramos-de-force, o Newtons.
   Nota: Nosotros preferimos trabajar con gramos como unidad de valores. Metros múltiples están disponibles comercialmente, pero sólo transductores axiales dan resultados confiables como transductores de fuerza del tipo de palanca son influenciados negativamente por las leyes físicas del efecto palanca. Cualquiera de una rejilla o un triángulo no flexible se pueden utilizar con las barras que son de 1-2 mm de diámetro.
2. Antes de la prueba, evaluar el peso corporal del ratón, para permitir la normalización de peso corporal.
3. Utilice gramos como unidad de valores. Restablecer el contador al inicio de cada recording.
4. Retire el ratón de su jaula por el acaparamiento de la cola y se mueve horizontalmente hacia la rejilla.
5. Compruebe que el ratón agarra la rejilla firmemente con ambas patas delanteras.
6. Tire del ratón fuera de la cuadrícula de modo que su alcance se ha roto, la fuerza máxima aplicada a la red se mostrará en la pantalla del transductor, que puede ser de forma manual o automáticamente registrado.
7. Sólo tome tirones en cuenta en la que el ratón muestra resistencia al experimentador. Rechazar medidas en las que sólo una pata delantera, o los miembros posteriores se utilizan y en el que el ratón se convirtieron durante el tirón.
8. Deje que el ratón tirar la red tres veces en una fila y luego regresar en la jaula por un período de descanso de al menos un minuto Nota:. Entre las series de tira de un periodo de descanso es necesario para que el ratón para recuperarse y evitar la formación de hábitos.
9. Entonces deje el ratón realizar cuatro series de intentos, cada uno seguido por un breve periodo de descanso. De esta manera el mouse ha retirado un total de 15x (3 tirones x 5 veces = 15 tirones).
10. Determinar la fuerza máxima de agarre y normalizar para el peso corporal tomando el promedio de los tres valores más altos de los valores recogidos 15.
11. Opcional: Determinar la fatiga mediante el cálculo de la disminución entre la media de las dos primeras y las dos últimas series de tirones 1 2 3 = A, 4 5 6 = B, 10 11 12 = C y 13 14 + 15 = D. La fórmula: (C + D) / (A + B) da un valor de 1 para los ratones que no están fatigados. Esto puede ser expresado en porcentajes de manera que un ratón sin fatiga tiene un valor de 0% y un ratón que extremidades anteriores están completamente fatigado tiene un valor de 100%.

2. Colgando Pruebas

Con las pruebas de colgantes, el equilibrio, la coordinación y la condición muscular puede evaluarse. Estas pruebas se basan en el conocimiento de que los ratones están deseosos de permanecer colgado de un alambre o rejilla hasta el agotamiento ^16. Hay dos pruebas colgantes distintivos en el que en el inicio de la prueba, ya seasólo se utilizan los dos miembros delanteros o las cuatro extremidades, utilizando un alambre o rejilla, respectivamente. La prueba de clasificación utilizando el cable y la red son el método de tiempo de suspensión más largo adaptado de DMD_M.2.1.004.pdf y DMD_M.2.1.005.pdf respectivamente. Un límite colgando fijo se utiliza de 600 seg. La mayoría de los ratones de tipo salvaje puede colgar de 600 seg, mientras que los ratones distróficos no puede. Para reducir el gasto de tiempo de realizar esta prueba, un tiempo máximo colgante se puso en su lugar. Los ratones que caen del alambre o rejilla hasta entonces se les da un máximo de dos intentos más. Esto se hace para reasegurar que los ratones son realmente incapaces de pasar el rato y no se caen debido a la torpeza.

1. Colgando de prueba con dos extremidades
   1. Aparato establecido: Asegure firmemente a 2 mm de espesor de metal percha de paño a un estante con cinta y mantener la suspensión de alrededor de 370; cm por encima de una capa de ropa de cama. Nota: como alternativa, a 55 cm de ancho mm de alambre metálico 2 de espesor que está bien conectado entre 2 soportes verticales se podrían utilizar. La distancia de 37 cm es suficiente para alentar a los ratones permanecer colgante, pero también suficientemente baja para evitar que los ratones de lesiones al caer hacia abajo. El alambre no debe vibrar o desplazar durante la prueba ya que esto podría interferir con el rendimiento del ratón.
   2. Manejar el ratón a través de la cola y llevarlo cerca del alambre.
   3. Deje el ratón Tome el alambre con los únicos dos patas delanteras, y bajar las patas traseras de una manera tal que el ratón solamente cuelga con las dos patas delanteras en el alambre (Figura 2B).
   4. Directamente en marcha el cronómetro cuando se suelta el ratón. Después de la liberación, los ratones fuertes tratan de atrapar el cable con las cuatro extremidades y la cola, que se permite (Figura 2C).
   5. Cuando un ratón muestra un comportamiento inadecuado (como el equilibrio sobre o deliberadamente saltar el alambre como shcompra en las Figuras 2D y 2E), abordar directamente esta reemplazando el ratón sobre el alambre sin detener el temporizador.
   6. Cuando un ratón cae del alambre, parar el cronómetro y registre el tiempo que cuelga.
   7. Cuando los ratones son capaces de pasar de 600 seg, apáguelo el alambre y devolverlos a la jaula. Los ratones que caen antes de que este límite se les da un máximo de dos intentos más.
   8. Registre el tiempo máximo de clasificación (es decir, el más largo de los ensayos) y utilizar este para su posterior análisis.
2. Colgando de prueba con cuatro extremidades
   1. Aparato creó: Utilice una mano hecha cuadrado o la tapa de una jaula grande para una rata o conejo para esta prueba. Coloque la rejilla de 25 cm por encima de la ropa de cama suave para evitar que los ratones se dañen al caer, sino también para disuadir a los ratones para saltar intencionalmente fuera de la red. Asegure firmemente la rejilla de modo que el experimentador no tiene que sostener manualmente la red durante el experimento, ya que estos movimientos podría yonterfere con el rendimiento del ratón.
   2. Coloque el ratón sobre la cuadrícula para que se agarra con sus cuatro patas.
   3. Invierta la cuadrícula de modo que el ratón está colgando y empezar directamente el temporizador.
   4. La sesión de prueba termina para los ratones que son capaces de colgar para una duración de 600 seg. Dale ratones que caen fuera de la red a principios de un máximo de dos intentos más.
   5. Utilice el tiempo máximo de clasificación (es decir. El más largo de los ensayos) para su posterior análisis.

3. Ejecución de Rotarod

Con la fuerza muscular rotarod prueba, la coordinación, el equilibrio, y el estado se pueden determinar ^17.

1. Aparato de configurar: Para esta prueba, ratones tienen que ejecutarse en un tubo giratorio. Asegúrese de que la velocidad constante se ha fijado en 5 rotaciones por minuto (rpm), y que la velocidad aumenta 5-45 rpm en los primeros 15 segundos cuando comenzaron. Después de esto, tiene que mantener su velocidad.
2. Coloque el ratón sobre el tubo del rodillo giratoriocuando se gira a una velocidad lenta y constante de 5 rpm. Cinco ratones se pueden probar simultáneamente.
3. Inicie la carrera una vez que todos los ratones se colocan. Dentro de los primeros 15 segundos de la velocidad del tubo acelera 5-45 rpm después de lo cual se mantiene esa velocidad.
4. Supervisar la ejecución. El tiempo de ejecución se registra de forma continua por el software. Tiempo de proyección se detiene automáticamente cuando un ratón se cae del tubo, ya que activa la barra de tiempo de posicionado por debajo del tubo. Volver a colocar los ratones que giran alrededor de frente a la dirección opuesta en el tubo mientras se ejecuta sin detener el tubo para girar.
5. Finalice la sesión de pruebas para los ratones que son capaces de correr durante un tiempo de 500 seg. Dale ratones un máximo de dos intentos más lo que les permite mejorar su tiempo de funcionamiento, cuando se caen antes.
6. Utilice el tiempo de funcionamiento máximo (es decir, el más largo de los ensayos) para su posterior análisis.

4. De esfuerzo

Lacinta de correr se puede utilizar de tres maneras como una herramienta en la investigación clínica previa. En primer lugar, obligó a la cinta rodante se puede utilizar para agravar la patología de la enfermedad tal como se describe en este protocolo (véase también: DMD_M2.1.001.pdf ). En segundo lugar, la capacidad de funcionamiento máxima de los ratones y los efectos de los tratamientos sobre este se puede evaluar (Véase, por el método de dejar que los ratones se ejecutan hasta el agotamiento DMD_M.2.1.003.pdf ). Por último, la cinta rodante se puede utilizar antes de la otra prueba de funcionamiento de agotar el ratón para que realice menos bien en la segunda prueba ^13. Esto se hace mediante el ejercicio de los ratones dos veces o tres veces a la semana como se describe a continuación, seguido directamente por cualquiera de una de las pruebas funcionales descritos en el protocolo de 1-3.

1. Aparato creó: Hay varias máquinas disponibles en el mercado en el que varios ratones puede ruN simultáneamente y para el cual se puede ajustar la elevación, la duración y la velocidad. Algunas cintas de correr están equipados con una rejilla para suministrar descargas de baja intensidad para estimular los ratones a correr. Sin embargo, los ratones mdx son sensibles al estrés y pueden ser fácilmente motivados de una manera más amigable con un suave empujón con la mano en el sentido de la marcha. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente a NO utilizar la cuadrícula de shock. En general, la estimulación con la mano sólo es necesaria durante la primera sesión en ejecución.
2. Coloque el ratón en la cinta horizontal.
3. Inicie la cinta de correr a una velocidad de marcha de 12 m / min. Las velocidades más bajas (8 m / min) deben ser utilizados en ratones viejos (> 15 meses), donde las velocidades más altas conducen fácilmente al agotamiento.
4. Durante la primera sesión, alentar a los ratones para ejecutar presionando suavemente cuando están cerca del final de la cinta.
5. Cuando los ratones se han quedado con una duración de 30 minutos, colocar de nuevo en su jaula.
6. Repita esto dos veces por semana durante por ejemplo 12 semanas.
7. Permitir períodos de descanso cuando sea necesario. Por ejemplo, algunos ratones mdx tienen que dejar de correr y se les debe permitir descansar durante unos minutos. Si esto ocurre, apague la correa para sacarla, dar todos los ratones de un período de descanso de dos minutos, gire el cinturón durante dos minutos a 4 m / min. Después de esto, aumentar la velocidad a 12 m / min y permiten a los ratones para terminar el protocolo. Es importante que todos los ratones completar todo el protocolo de funcionamiento.
   
   Nota: En el caso de los ratones mdx necesitan períodos de descanso, considere un calentamiento antes del protocolo de ejercicio de 30 min. Esta sesión de calentamiento consta de: un período de aclimatación de 2 min a una velocidad de 4 m / min, inmediatamente seguido por un calentamiento 8 min a 8 m / min.
   
   
   En nuestras manos 4-16 semanas de edad ratones mdx hembras son capaces de completar el protocolo de ejercicios de 30 minutos sin descanso. Otros han informado de que en la edad coincide ratones mdx masculino 45% de los ratones no necesitan periodos de descanso para terminar el ejercicio. El protocolo de calentamiento a reducirs la cantidad de paradas ^12.

Resultados

La fuerza de agarre de la extremidad anterior de tipo salvaje y ratones mdx aumenta entre la edad de 4-12 semanas y reduce de nuevo en ratones de más edad. Deficiencias en vigor ya se pueden observar en los ratones mdx jóvenes. Los datos representativos de 9 semanas de edad ratones hembra se muestran en las Figuras 1A y 1 B. Aunque la fatiga no difiere entre las cepas aún a esta edad, los ratones mdx son más débiles que los ratones de tipo salvaje. No ten...

Discusión

Las pruebas funcionales que se presentan aquí son reproducibles, fácil de realizar y aplicable a la de tipo salvaje y ratones distróficos con independencia de su edad. Las pruebas proporcionan herramientas útiles para pre clínicamente evaluar la función muscular, la fuerza, condición, y la coordinación. Al probar los efectos de un compuesto sobre la historia natural de la enfermedad, las pruebas no invasivas describen aquí (fuerza de agarre de la extremidad anterior, ambas pruebas colgantes y la prueba de rotar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM