의 기능적 성능을 평가<em&gt; MDX</em&gt; 마우스 모델

요약

신경 근육 질환에 대한 임상 시험에서 일차 결과 측정은 일반적으로 근육의 기능을 향상시킬 수있다. 따라서, 마우스 모델에서 임상 적으로 전치 근육 성능에 잠재적 인 치료 화합물의 효과를 평가하는 것은 매우 중요하다. 우리는 여기서이 문제를 해결하기 위해 여러 기능 테스트를 설명합니다.

초록

Duchenne 근육 퇴행 위축 (DMD)는 더 치료를 사용할 수 없습니다되는 장애를 낭비 심각하고 진보적 인 근육이다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 잠재적 제약 화합물 및 유전자 치료 방법은 임상 시험으로 진행했다. 이 시험에서 가장 중요한 끝 지점이되는 근육의 기능 개선과 함께, 강조의 많은 근육의 기능, 강도, 상태, 그리고의 조화를 평가하는 임상 사전 기능 테스트를 수행하기 위해, 안정적인 재현성, 쉬운 설정에 배치되었습니다 DMD에 대한 MDX 마우스 모델. 모두 침략과 비 침습적 인 검사를 사용할 수 있습니다. 질병을 악화하지 않는 시험은 질병의 자연사 및 치료 적 개입 (예. 앞다리 그립 강도 시험, 와이어 또는 격자와 로타로드 실행을 사용하여 두 개의 다른 거는 시험)의 효과를 결정하기 위하여 사용될 수있다. 선택적으로, 강제 트레드밀 런닝 질병의 진행을 강화 및 / 또는 평가할 수있다질병의 병리에 대한 치료 적 개입의 보호 효과. 우리는 여기에서 안정적이고 재현 가능한 방법이 가장 일반적으로 사용되는 기능 테스트를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 표준 운영 절차에 따라이 프로토콜을 사용하여 서로 다른 실험실 사이의 데이터의 비교를 가능하게한다.

서문

Duchenne 근육 퇴행 위축 (DMD)는 1:5,000 신생아 소년에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 근육 질환이다. 이 심각하고 진보적 인 근육 낭비 질병은 오픈 리딩 프레임을 방해하고 기능적으로 dystrophin 단백질의 합성을 방지 DMD 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. dystrophin에 부족한 근육 섬유의 손상을 유도 운동에 취약합니다. 근육의 재생 능력의 고갈에 따라, 인해 손상된 근육의 만성 염증으로, 섬유는 이후 기능의 손실로 이어지는, 결합 조직과 지방으로 대체됩니다. 일반적으로, DMD 환자는 두 번째 10 년의 초기에하지의 보행을 잃게됩니다. 나중에, 또한 팔과 어깨 띠의 근육이 영향을받습니다 환자는 종종 인해 척추를지지하는 근육의 비대칭 약화 흉 요추부 척추 측만증을 개발한다. 보조 환기는 일반적으로 대 후반 또는 20 대 초반이 필요합니다. 호흡과 심장 마비 리드세 번째 또는 네 번째 10 년 ¹ 죽음.

원인이되는 유전자가 25 년 ^{전 발견되었지만,} DMD에 해당하는 치료법은 없습니다. 그러나, 의료 서비스를 개선하고 스테로이드의 사용은 서구 세계 ^3에 수명을 증가하고있다. MDX 마우스와 같은 동물 모델을 이용하여, 주요 단계는 잠재적 인 치료 전략의 발견에 전달되었습니다. MDX 마우스는 가장 일반적으로 사용되는 DMD의 마우스 모델이다. 그것은 쥐의 DMD 유전자의 엑손 23 점 돌연변이가 결과적으로 dystrophin ^{4 없다.} 지난 몇 년 동안, 많은 제안 전략은 임상 시험 ^5-9으로 진행했다. 이러한 실험에서, 근육 기능의 향상은 시험 전 임상 단계에서 마우스에서 근육 기능의 화합물의 효과를 시험의 중요성을 밑에, 기본 종점이다.

DMD 같은환자는 또한 MDX 생쥐 디스트로핀 부정적 근육 섬유는 유도 손상을 행사할 취약 그들의 근육 기능 C57BL/10ScSnJ 야생형 마우스에 비해 저하된다. 이 손상은 기능 시험의 다양한 평가 될 수있다. 이러한 테스트 중 일부는 비 침습적이며 근육 병리 (예를 들어 앞다리 악력, 거는 테스트 및 로타 실행)을 방해하지 않습니다. 따라서 이들은 질병의 자연사를 모니터링하거나 질병 진행에 화합물의 효과를 결정하기 위하여 사용될 수있다. MDX 생쥐의 근육 기능에 대한 화합물의 영향을 깊이 그림에서,이 테스트의 모든 구성된 질병의 진행을 방해하지 않는 기능 테스트 정권이 ^10을 사용할 수 있습니다 얻을 수 있습니다.

선택적으로, 강제 트레드밀 런닝 의도적 질병의 진행을 악화 및 화합물 ^(11)의 보호 능력을 테스트하는데 사용될 수있다. 디딜 방아는 할 수있다그들은 치료 그룹 ⁽¹³⁾ 사이의 성능에 큰 차이를 보장 이후 기능 시험에 덜 잘 수행 할 수 있도록 소진 때까지 시간을 실행하는 ^12을 측정, 또는 피로 MDX 마우스를 도구로하는 결과 측정으로 사용. 기능 테스트를 선택할 때 MDX 마우스 ⁽¹⁴⁾ 등 이영 마우스를 테스트 특히, 질병의 진행에 미치는 영향은 명심해야한다.

우리는 여기에 TREAT-NMD 네트워크에서 사용 가능한 표준 운영 절차에 따라 안정적이고 재현 가능한 방법으로 가장 일반적으로 사용되는 기능 테스트를 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. TREAT-NMD를 방문하려면 여기를 클릭하십시오 .

프로토콜

여기에 설명 된 실험은 라이덴 대학 의료 센터 (LUMC)의 동물 윤리위원회 (DEC)에 의해 승인되었다. 마우스는 LUMC의 동물 시설에서 사육하고 12 시간 빛 어두운주기와 개별 환기 케이지에 보관했다. 그들은 물과 표준 차우에 광고를 무제한으로 접근했다.

후술 기능 테스트 중 하나를 수행 할 때, 실험 조건은 엄격하게 편차를 감소하도록 제어되어야한다. 성능이 연령과 성별 사이의 차이로 바람직하게는, 나이, 성별 일치 마우스는 사용되어야한다. 같은 쓰레기에 속하는 마우스는 실험 그룹에 무작위 배정되어야한다. 동물 실험 그룹에 눈을 멀게하는 동일한 연산자로 테스트해야합니다. 테스트는 각각의 마우스와 시간 지점 ⁽¹⁴⁾ 사이에 큰 변화가 모두 관찰 할 수있는 등의 냄새, 소리를, 균등하게 하루 (주말 제외), 같은 방에 같은 시간에 수행해야기능 테스트는, 따라서 6-8 마우스 / 실험군이 사용되어야한다. 기능 테스트 성능은 크게 다른 근친 야생형 균주마다 다를 수 있습니다. 따라서, 실험과 제어 야생형 마우스는 항상 MDX (마우스의 경우 C57BL/10ScSnJ 야생형 균주를 사용) 배경에 대응 한 것이다. 여기에 설명 된 모든 데이터는 우리가 여기에에서와 같은 야생 형식을 참조 C57BL/10ScSnJ 야생형 균주로 얻어졌다. 여기에 설명 된 시험은 MDX와 야생형 생쥐의 나이가 적어도 1-19개월 세로 방향으로 사용할 수 있습니다. 시험은 관심과 작업을 수행 할 수있는 의지를 잃지 쥐를 방지하기 위해 더 많은 매주 한 번 이상 반복 할 수 없습니다.

1. 앞다리 그립의 강도 시험

앞다리의 강도를 측정하기 위해 앞다리 그립 강도 시험을 사용한다. 테스트는 꼬리 ^(15)에 의해 중단 될 때 무심코 그리드 잡기 마우스의 경향에 기초하고있다 ADAPTE에서 D DMD_M2.2.001.pdf .

1. 장치 설정 : 풀 동안 그리드에 마우스로 적용되는 최대 힘을​​ 측정하는 힘 센서에 그리드를 연결합니다. 확인 설정을 당기는 피크 긴장 모드 (T-PK)에 있는지 확인합니다. 힘의 단위는 하나 온스 -의 - 힘, 그램 -의 - 힘, 파운드 -의 - 힘, 킬로그램 -의 - 힘, 또는 뉴턴에서 조정할 수 있습니다.
   참고 : 우리는 값의 단위로 그램와 함께 작업하는 것을 선호합니다. 여러 미터 상업적으로 사용할 수 있지만, 레버 타입 힘 센서가 부정적인 레버 효과의 물리적 법칙에 의해 영향으로 만 축 트랜스 듀서는 믿을 수있는 결과를 제공합니다. 비가 요성 그리드 또는 삼각형 하나는 직경 1 ~ 2 mm까지 막대를 사용할 수 있습니다.
2. 시험 전에, 체중에 대한 정규화를 할 수 있도록, 마우스의 체중을 평가.
3. 값의 단위로 그램을 사용합니다. 각 RE​​CO의 시작 부분에 측정기를 재설정에 rding.
4. 꼬리를 잡아 그리드 향해 수평으로 이동하여 케이지에서 마우스를 제거합니다.
5. 마우스를 두 앞발로 단단히 그리드를 파악 있는지 확인합니다.
6. 그 이해가 파손되도록 멀리 그리드에서 마우스를 끌어, 그리드에 적용되는 가장 높은 힘은 수동 또는 자동으로 기록 될 수있는 트랜스 듀서의 디스플레이에 표시됩니다.
7. 만 마우스가 실험에 대한 저항력을 보여줍니다하는 계정에 잡아 당기기를 취할. 하나의 앞발, 또는 뒷다리가 사용하고있는 마우스를 끌어 동안 켜져 있었던 어떤 조치를 거부합니다.
8. 마우스가 행의 표를 세 번 당기 후 1 분 이상의 휴식 기간 동안 케이지로 돌아 가자 참고 :.의 시리즈 사이의 휴식 기간은 마우스가 복구 습관 형성을 방지하기 위해 필요합니다 가져옵니다.
9. 그런 다음 마우스를 당긴 네 시리즈, 짧은 휴식 기간 뒤에 각을 수행 할 수 있습니다. 이런 식으로 양해 각서 (MOU)E는 15 배 (3 당긴 × 5 회 = 15 잡아 당기기)의 총을 뽑아왔다.
10. 최대 악력을 결정하고 수집 된 15 값 중 세 개의 가장 높은 값의 평균을 취함으로써 체중에 대한 정상화.
11. 선택 사항 : 처음 두의 평균 및 잡아 당기기의 마지막 두 시리즈 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C 사이 13 +14 + 감소를 계산하여 피로를 결정 15 = D. 공식 : (C + D) / (A + B)는 피로하지 않은 쥐에 대한 1의 값을 제공합니다. 피로없이 마우스가 0 %의 값과 앞발을 완전히 100 %의 값을 갖는다 피로되어 마우스를 갖도록이 백분율로 표현 될 수있다.

2. 테스트를 거는

거는 시험, 균형, 조화 및 근육 상태로 평가 될 수있다. 이 테스트는 마우스가 고갈 ^16까지 유선 또는 그리드에 매달려 남아 열망하는 지식을 기반으로합니다. 두 특유한 거는 테스트 역시 시험의 시작이두 앞발 또는 모든 사지 만 각각 와이어 또는 격자를 사용하여, 사용됩니다. 와이어 그리드를 사용하여 거는 시험에서 적응 긴 현수교 시간 방법입니다 DMD_M.2.1.004.pdf 및 DMD_M.2.1.005.pdf 이었다. 고정 매달려 제한은 600 초 사용됩니다. 이영 마우스는 할 수 없지만 야생형 마우스의 대부분은, 600 초 동안 정지 될 수 있습니다. 이 테스트를 수행하는 시간의 지출을 줄이기 위해 최대 거는 시간은 장소에 설립되었다. 그 전에 선이나 그리드 떨어지지 마우스를 두 번 더 시도까지 주어집니다. 이것은 마우스가 응답 정말없는 인해 어색함에 해당하지 않는 재보험하다하기위한 것입니다.

1. 두 팔다리 테스트를 거는
   1. 장치 설정 : 단단히 테이프를 선반에 2 mm 두께의 금속 피복 걸이를 확보하고 37 개의 행거를 유지0; 침구 층 위의 CM. 참고 : 또는 단단히 2 세로 스탠드 사이에 고정 폭 2mm 두께의 금속 와이어 55cm가 사용될 수있다. 37cm의 거리가 매달려 남아 마우스를 장려하기에 충분하지만, 또한 아래로 떨어지는 경우 부상에서 마우스를 방지하기 위해 충분히 낮다. 와이어 나 진동이 마우스의 성능을 방해 할 수 있으므로 시험 동안 변위 안된다.
   2. 꼬리를 통해 마우스를 처리하고 전선 근처에 가져옵니다.
   3. 마우스 만이 앞발로 와이어를 잡아시켜, 마우스만을 와이어 (도 2B)에이 앞발로 중단하는 방식으로 뒷발을 낮출.
   4. 마우스를 놓을 때 직접 타이머를 시작합니다. 출시 후 강력한 마우스 (그림 2C) 허용되는 모든 사지와 꼬리와 와이어를 잡으려고.
   5. 마우스는 균형 또는 의도적으로 쉬로 와이어를 점프 같은 부적절한 행동을 (표시하는 경우)도 2D 및 2E에 자신의 직접 타이머를 중지하지 않고 와이어에 마우스를 대체하여이 문제를 해결.
   6. 마우스가 선을 떨어질 때, 타이머를 중지하고 매달려 시간을 기록한다.
   7. 생쥐는 600 초 동안 중단 할 수있게되면, 와이어를 벗고 케이지에 반환. 이 제한 전에 가을 마우스를 두 번 더 시도 할 최대 주어진다.
   8. (시험의 긴 즉) 최대 매달려 시간을 기록하고 추가 분석을 위해이를 사용합니다.
2. 사지와 테스트를 거는
   1. 장치가 설정 중 하나를 사용하여 정사각형이나이 테스트 쥐 또는 토끼에 대한 큰 케이지의 뚜껑을 만든 손. 하락에 따라 자신을 해치는 쥐를 방지하기 위해 25cm 부드러운 침대 위의 격자의 위치뿐만 아니라, 의도적으로 그리드를 뛰어 마우스를 억제 할 수 있습니다. 실험은 수동 운동으로 실험 기간 동안 그리드를 보유하지 않도록 단단히 그리드를 확보하고있을 거예요마우스의 성능을 nterfere.
   2. 그것의 네 발로 파악 있도록 그리드에 마우스를 놓습니다.
   3. 마우스가 매달려되도록 격자를 거꾸로하고 직접 타이머를 시작합니다.
   4. 테스트 세션은 600 초 동안 중단 할 수있는 마우스에 끝납니다. 그리드에서 두 번 더 시도 이전 최대 가을 마우스를 제공합니다.
   5. 추가 분석을 위해 최대 거는 시간 (예. 시험의 가장 긴)를 사용합니다.

3. 로타 실행

로타로드 테스트 근육 강도, 조정, 균형, 및 조건 ^(17)을 결정할 수있다.

1. 장치 설정이 테스트의 경우, 마우스는 회전 튜브에 실행해야합니다. 정상 속도는 분 (RPM) 당 5 회전에 설정되어 있는지 확인하고, 처음 15 초에 5-45 RPM의 속도가 증가 시작할 때 그. 이 후에는 그 속도를 유지한다.
2. 로타의 튜브에 마우스를 놓고그것은 5 rpm의 느린 꾸준한 속도로 회전 할 때. 다섯 생쥐를 동시에 테스트 할 수있다.
3. 실행 한 모든 마우스가 위치한다를 시작합니다. 제 15 초 이내에 튜브의 속도는 그 속도를 유지 한 후, 5-45 RPM에서 가속.
4. 실행을 모니터링합니다. 실행 시간은 지속적으로 소프트웨어에 의해 기록된다. 이 관 아래에 위치하는 시간 표시 줄을 활성화로 마우스가 관을 떨어질 때 시간을 실행하면 자동으로 멈 춥니 다. 회전 튜브를 중지하지 않고 실행하는 동안 튜브에 반대 방향에 직면 돌아서 마우스의 위치를​​ 조정합니다.
5. 500 초 동안 실행 할 수있는 마우스에 대한 테스트 세션을 종료합니다. 쥐에게 그들이 이전에 빠졌을 때 그들 자신의 실행 시간을 개선 할 수 있도록 두 번 더 시도 할 최대를 제공합니다.
6. 추가 분석을 위해 (시험의 긴 즉) 최대 실행 시간을 사용합니다.

4. 디딜 방아 운동

디딜 방아는 사전 임상 연구의 도구로 세 가지 방법으로 사용할 수 있습니다. 첫째, 강제 트레드밀 달리기 (참조 :이 프로토콜의 설명에 따라 질병의 병리를 악화 할 수 있습니다 DMD_M2.1.001.pdf을 ). 둘째,이에 마우스 및 치료의 효과의 최대 실행 기능 (마우스가 소진 때까지 실행할 수 있도록하는 방법을 참조하십시오 평가 될 수 DMD_M.2.1.003.pdf을 ). 마지막으로, 트레드밀 달리기는 두 번째 테스트 ^(13)에 덜 잘 수행되도록 마우스를 배출하기 이전에 다른 기능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 직접 프로토콜 1-3에 기재된 기능 테스트 중 어느 하나 다음에, 후술하는 바와 같이 2 내지 3 배 주간 마우스 운동에 의해 수행된다.

1. 장치 설정 : 여러 가지 마우스는 루 수에 상업적으로 사용할 수있는 여러 가지 디딜 방아가있다N 동시에 상승, 지속 시간 및 속도를 조정할 수있는. 일부 러닝 머신을 실행하는 마우스를 장려하기 위해 낮은 강도의 충격을 전달하기 위해 그리드를 갖추고 있습니다. 그러나 MDX 마우스는 스트레스에 민감하고 쉽게 실행 방향의 손으로 부드럽게 밀어 넣기로 친숙한 방식으로 동기를 부여 할 수있다. 따라서, 강하게 충격 그리드를 사용하지 않도록 권장합니다. 일반적으로, 손으로 자극은 제 실행 세션 동안 필요하다.
2. 수평 디딜 방아에 마우스를 놓습니다.
3. / 분 12m의 실행 속도로 러닝 머신을 시작합니다. 더 높은 속도가 쉽게 고갈로 이어질 여기서 낮은 속도 (8m / 분), (> 15개월) 된 마우스에서 사용되어야한다.
4. 첫 번째 세션 동안, 그들은 벨트의 끝 부분에있을 때 살짝을 눌러 실행하는 마우스를 바랍니다.
5. 마우스는 30 분의 시간 동안 실행 한 경우, 자신의 새장에 다시 그들을 놓습니다.
6. 예를 들어 12 주 동안 일주일에 두 번이 작업을 반복합니다.
7. 필요한 경우 기간을 휴식 할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 MDX 마우스는 실행을 중지하고 몇 분 동안 휴식을 허용해야합니다. 이 경우, 벨트를 끄고 모든 마우스 두 분의 휴식 시간을주고, 4m / 분에서 두 분의 벨트를 켭니다. 이 후, 12m / 분으로 속도를 증가시키고 마우스 프로토콜을 완성 할 수 있습니다. 그것은 모든 마우스는 전체 실행 프로토콜을 완료하는 것이 중요하다.
   
   참고 : MDX 마우스는 휴식 기간이 필요한 경우, 30 분 운동 프로토콜 전에 워밍업 고려하십시오. 즉시 / 분 8m에서 8 분 예열 다음에 4m / 분의 속도로 2 분의 적응 기간이 따뜻하게 세션으로 구성되어 있습니다.
   
   
   우리 손에 4-16주 세 여자 MDX 마우스는 휴식없이 30 분 운동 프로토콜을 완료 할 수 있습니다. 다른 시대에 남성 MDX 쥐에게 쥐의 45 %가 운동을 마무리하는 기간 휴식이 필요합니까? 일치하는 것으로보고있다. 워밍업 프로토콜은 감소정지 ^(12)의 양.

결과

야생형 및 MDX 마우스의 앞다리 그립 강도 4-12 주 세 사이에 증가하고 오래된 마우스에서 다시 감소시킨다. 힘의 손상은 이미 젊은 MDX 마우스에서 관찰 할 수있다. 구주 된 암컷 생쥐의 대표적인 데이터는도 1a 및 B에 표시됩니다. 피로는이 나이에 아직 변종 사이에 차이가 없습니다 만, MDX 마우스는 야생형 마우스에 비해 약하다. 우리는 나이가 MDX와<...

토론

여기에 제시된 기능 테스트는 재현하기 쉬운 야생 유형과 연령의 독립적 인 이영 마우스에 적용 할 수있다. 테스트는 사전 임상 적으로 근육의 기능, 강도, 상태, 및 조정을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 질병의 자연사에 대한 화합물의 효과를 시험 할 때, 비 침습적 검사가 여기 (앞다리 악력 모두 거는 테스트 및 로타로드 테스트)을 설명하는 것은 잘이 시험은 연속 일에 수행되는 기능 테...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM