הערכת ביצועים תפקודיים ב<em&gt; MDX</em&gt; עכבר דגם

Summary

מדד התוצאה העיקרי בניסויים קליניים לטיפול בהפרעות התוקפת משתפר בדרך כלל תפקוד שרירים. לכן, הערכת ההשפעה של תרכובות טיפוליות אפשריות על ביצועי שרירים מראש קליני במודלים של עכבר היא בעל חשיבות רבה. אנחנו כאן לתאר כמה בדיקות פונקציונליות לכתובת זו.

Abstract

ניוון שרירים דושן (DMD) הוא שרירים חמורים ומתקדמים מבזבזים את ההפרעה שלאין תרופה זמינה. עם זאת, כמה תרכובות תרופות פוטנציאליות וגישות ריפוי גנטי התקדמו לניסויים קליניים. עם שיפור בלהיות נקודת הסיום החשובה ביותר בניסויים אלה תפקוד שרירים, דגש רב הושם על ההקמה אמינה, לשחזור, וקל לביצוע בדיקות פונקציונליות מראש קליני להעריך את תפקוד שריר, כוח, מצב, ותיאום ב מודל עכבר MDX עבור DMD. שני בדיקות פולשניות ולא פולשנית זמינות. בדיקות שלא להחמיר את המחלה ניתן להשתמש בם כדי לקבוע את המהלך הטבעי של המחלה ואת ההשפעות של התערבויות טיפוליות (למשל. מבחן אחיזת forelimb כוח, שתי בדיקות תלייה שונות או באמצעות חוט או רשת וריצה rotarod). לחלופין, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי לשפר את התקדמות מחלה ו / או להעריךהשפעות מגנות של התערבויות טיפוליות בפתולוגיה מחלה. אנחנו כאן מתארים כיצד לבצע בדיקות תפקודיות הנפוצות ביותר אלה באופן אמין לשחזור. תוך שימוש בפרוטוקולים אלה מבוססים על נהלי הפעלה סטנדרטיים מאפשר השוואת נתונים בין מעבדות שונות.

Introduction

ניוון שרירים דושן (DMD) הוא הפרעת neuromuscular הנפוצה ביותר המשפיעה על 1:5,000 נערים שזה עתה נולד. מחלה ממארת זו חמורה ומתקדמת שרירים נגרמת על ידי מוטציות בגן DMD, המשבשות את מסגרת הקריאה הפתוחה ולמנוע את סינתזת חלבון דיסטרופין התפקודי של. סיבי שריר חסרי דיסטרופין פגיעים לממש נזק מושרה. על מיצוי יכולת ההתחדשות של השריר, ועקב דלקת כרונית של שריר פגוע, סיבים מוחלפים על ידי רקמת שומן וחיבור, לאחר מכן מובילים לאובדן התפקוד. באופן כללי, חולי DMD לאבד ניידות של הגפיים התחתונים בתחילת העשור השני. מאוחר יותר, גם על שרירי הידיים וחגורת כתפיים הם מושפעים וחולים לעתים קרובות לפתח עקמת thoracolumbar בשל היחלשות סימטרית של השרירים התומכים בעמוד השדרה. אוורור בסיוע נדרש בדרך כלל בסוף שנות העשרה או בשנתי העשרים המוקדמות. להוביל כשל נשימתי ואת הלבלמוות בעשור השלישי או רביעי ^1.

למרות שהגן סיבתי כבר גילה לפני 25 שנה ^2, אין תרופה זמינה עבור DMD. עם זאת, שיפור בריאות והשימוש בסטרואידים הגדילו את תוחלת חיים בעולם המערבי ^3. עם השימוש במודלים של בעלי חיים כמו עכבר MDX, צעדים גדולים קדימה לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות אפשריות נעשה. עכבר MDX הוא המודל של עכברי DMD הנפוץ ביותר. יש לו מוטציה נקודתית באקסון 23 של גן Dmd העכברי וכתוצאה מכך חסר דיסטרופין ^4. במהלך השנים האחרונות, אסטרטגיות המוצעות רבות התקדמו לתוך ניסויים קליניים ^5-9. בניסויים אלה, שיפור בתפקוד שרירים הוא נקודת הסיום הראשונית, העומד בבסיס החשיבות של בדיקות היתרון של תרכובות בתפקוד שרירים בעכברים בשלב הקליני מראש של בדיקות.

כמו DMDחולים, גם את סיבי השריר השליליים דיסטרופין של עכברי mdx פגיעים לממש את הנזק נגרם ותפקוד השרירים שלהם נפגעים בהשוואה לעכברי סוג בר C57BL/10ScSnJ. ירידת ערך זו ניתן להעריך עם מגוון רחב של בדיקות פונקציונליות. חלק מהבדיקות האלה הן לא פולשנית ולא להפריע לפתולוגיה שריר (כוח אחיזה למשל forelimb, בדיקות תלויות וריצה rotarod). לכן הם יכולים לשמש כדי לפקח על המהלך הטבעי של המחלה או לקבוע את ההשפעות של תרכובות בהתקדמות מחלה. כדי לקבל תמונה בעומק של ההשפעה של תרכובות בתפקוד שרירים בעכברי MDX, משטר מבחן פונקציונלי שאינו מפריעים להתקדמות מחלה המורכבת מכל מבחנים אלה יכול לשמש ^10.

לחלופין, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי להחריף בכוונה את התקדמות מחלה ולבדוק את היכולות המגנה של תרכובות ^11. הליכון יכול להיות גםמשמש כמדד תוצאה שבה פועל זמן עד התשישות נמדדה ^12, או ככלי לעכברי MDX עייפות, כך שהם מבצעים פחות טובים במבחן תפקודי הבא להבטיח הבדלים גדולים בביצועים בין קבוצות טיפול ^13. בעת בחירת בדיקות פונקציונליות, ההשפעה שלהם על התקדמות מחלה צריכה לזכור במיוחד כאשר בדיקות עכברי dystrophic כמו עכבר MDX ^14.

אנחנו כאן לתאר בפירוט כיצד לבצע את הבדיקות תפקודיות הנפוצות ביותר באופן אמין לשחזור המבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים זמינים מרשת TREAT-NMD. לחצו כאן כדי לבקר TREAT-NMD.

Protocol

הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי החיים (DEC) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC). עכברים גידלו במתקן בעלי החיים של LUMC ובכלובים מאווררים בנפרד עם 12 מחזורים חשוכים שעות אור. היה להם גישה כרצונך מודעת מים ואוכל רגיל.

בעת ביצוע כל הבדיקות פונקציונליות המפורטות להלן, תנאי ניסוי צריכים להיות מבוקרים בקפידה כדי להפחית וריאציה. רצוי, יש להשתמש בעכברים מותאמים גיל ומין, כפי שביצועים משתנים בין גיל ומינים. עכברים שייכים לאותו המלטה צריכים להיות באופן אקראי על פני קבוצות ניסוי. בעלי חיים צריכים להיבדק על ידי אותו מפעיל, שהתעוור לקבוצות ניסוי. בדיקות יש לבצע באותו זמן, בחדר באותו יום בשבוע ולהשוות ריחות, רעשים, וכו ^'14 וריאציה גדולה בין עכברים הבודדים ונקודות זמן ניתן לצפות לכלבדיקות פונקציונליות, ולכן 6-8 עכברים / צריכה לשמש קבוצת ניסוי. ביצועים במבחן פונקציונליים יכולים גם נבדלים בעיקר בין זני סוג בר מולדים השונים. לכן, עכברי סוג בר ניסיוניים ולשלוט צריכים תמיד מתאימים רקע (במקרה של עכברי mdx להשתמש בזן פראי סוג C57BL/10ScSnJ). כל הנתונים שתוארו כאן התקבלו עם הזן פראי סוג C57BL/10ScSnJ, שבו אנו מתייחסים לסוג בר כמכאן והלאה. הבדיקות שתוארו כאן יכולות לשמש ציר אורך של לפחות 1-19 חודשים של גיל בעכברי MDX ופראיים סוג. בדיקות לא צריכים להיות חזרו יותר מפעם בשבוע כדי למנוע מעכברים לאבד עניין ונכונות לבצע את המשימה.

1. מבחן כוח אחיזת forelimb

השתמש בבדיקת כוח אחיזת forelimb כדי למדוד את עוצמתו של forelimbs. הבדיקה מבוססת על הנטייה של עכבר כדי לתפוס באופן אינסטינקטיבי רשת כאשר הושעה על ידי הזנב ^15, וadapteד מDMD_M2.2.001.pdf.

1. מנגנון שהוקם: צרף רשת למתמר כוח, המודד את הכוח המרבי המיושם על ידי העכבר על הרשת במשיכה. ודא שההגדרה היא על מצב מתח שיא (T-PK) למשיכה. היחידות של כוח יכולות להיות מותאמות בכל אחד,,,, או ניוטון גרם-of-כוח קילוגרמים של כוח אונקיות של כוח קילו של כוח.
   הערה: אנחנו מעדיפים לעבוד עם גרם כיחידה של ערכים. מטרים מרובים זמינים באופן מסחרי, אך רק מתמרים צירי נותנים תוצאות אמינות כמו מתמרים כוח סוג המנוף מושפעים לרעה על ידי חוקי הפיזיקה של אפקט המנוף. כך או רשת או משולש nonflexible ניתן להשתמש עם ברים, כי הם 1-2 מ"מ בקוטר.
2. לפני הבדיקה, להעריך את משקל הגוף של העכבר, כדי לאפשר נורמליזציה למשקל גוף.
3. השתמש גרם כיחידה של ערכים. אפס את המונה בתחילת כל recording.
4. הסר את העכבר מהכלוב שלה על ידי גרירת הזנב ולהעביר אותו בצורה אופקית לכיוון הרשת.
5. בדוק שהעכבר תופס את הרשת באופן הדוק עם שני כפות רגליו קדמיות.
6. משוך את העכבר הרחק מהרשת, כך שאחיזתו נשברה; הכוח הגבוה ביותר מיושם על הרשת יוצג בתצוגה של המתמר, אשר יכול להיות באופן ידני או באופן אוטומטי נרשם.
7. לקחת רק מושך בחשבון שבעכבר מראה התנגדות לנסיין. לדחות את הצעדים שבהם רק אחד בכפו, או hindlimbs שימשו ושבו העכבר פנה במהלך המשיכה.
8. בואו העכבר למשוך את הרשת שלוש פעמים ברציפות ולאחר מכן להחזיר אותו בכלוב לתקופת מנוחה של דקה אחת לפחות הערה:. בין הסדרה מושכת תקופת מנוחה הכרחית לעכבר כדי להתאושש ולמנוע היווצרות הרגל.
9. אז בואו העכבר ארבע סדרות של מושך, כל אחד ואחרי תקופת מנוחה קצרה לבצע. בדרך זו mousדואר משך כולל של 15x (3 מושך x = 5 פעמים 15 מושך).
10. קבע את כוח האחיזה המקסימאלי ולנרמל למשקל גוף על ידי לקיחת הממוצע של שלושה הערכים הגבוהים ביותר מערכי 15 שנאספו.
11. אופציונאלי: קבע עייפות על ידי חישוב המפחית בין הממוצע של שני הראשונים ושתי הסדרות האחרונות של מושך 1 +2 +3 = 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C ו13 +14 + 15 = ד הנוסחה: / (+ B) (C + D) נותנת ערך של 1 לעכברים שאינם עייפים. זה יכול לבוא לידי ביטוי באחוזים, כך שעכבר ללא עייפות יש לו ערך של 0% ועכבר שforelimbs עייפים לחלוטין יש ערך של 100%.

2. תליית בדיקות

עם בדיקות תלייה, שיווי משקל, קואורדינציה ומצב שרירים ניתן להעריך. בדיקות אלה מבוססות על הידע שהעכברים להוטים להישאר תלוי על חוט או רשת עד תשישות ^16. ישנן גם שתי בדיקות תלייה ייחודיות שבו בתחילת המבחןרק שני forelimbs או כל ארבעת הגפיים משמשים, באמצעות חוט או רשת בהתאמה. הבדיקה התלויה באמצעות החוט והרשת הן שיטת זמן השעיה הארוכה ביותר המותאמת מDMD_M.2.1.004.pdf וDMD_M.2.1.005.pdf בהתאמה. גבול תלוי קבוע משמש 600 שניות. רוב עכברי סוג בר יכול לתלות ל600 שניות, ואילו עכברי dystrophic לא יכולים. כדי להפחית את הוצאת זמן ביצוע בדיקה זו, זמן תלייה מרבי נקבע במקום. עכברים שנופלים לו החוט או רשת לפני אז הם ויתרו על שני ניסיונות נוספים. הדבר נעשה כדי ביטוח משנה שהעכברים הם באמת לא מסוגלים להסתובב ואינו נופלים בשל סרבול.

1. תליית מבחן עם שני איברים
   1. מנגנון שהוקם: בחוזקה לאבטח קולב בד עבה מתכת 2 מ"מ למדף עם קלטת ולשמור על הקולב סביב 370; ס"מ מעל שכבת המצעים. הערה: לחלופין, יכול לשמש 55 סנטימטר חוט רחב 2 מ"מ עובי מתכתי המובטחת בחוזקה בין 2 יציעים אנכיים. המרחק של 37 סנטימטר מספיק כדי לעודד עכברים להישאר תלוי, אלא גם נמוך מספיק כדי למנוע עכברים מפציעות כאשר נופלים למטה. התיל לא צריך לרטוט או לעקור במהלך הבדיקה כמו זה יכול להפריע לביצועים של העכבר.
   2. להתמודד עם העכבר באמצעות הזנב ולהביא אותו ליד התיל.
   3. תן את העכבר לתפוס את החוט עם שתי רגליים הקדמיות בלבד, ולהפחית את hindlimbs באופן כזה שהעכבר נתקע רק עם שתי רגליו הקדמיות על החוט (איור 2).
   4. ישירות להפעיל את הטיימר כאשר העכבר הוא שוחרר. לאחר שחרורו, עכברים חזקים מנסים לתפוס את החוט עם כל הגפיים ארבעה והזנב, שהוא מותר (איור 2 ג).
   5. כאשר עכבר מציג התנהגות לא נאותה (כמו איזון או במכוון קופצים מהחוט כshבעלות ב2D דמויות ו2E), ישירות כתובת זו על ידי החלפה את העכבר על החוט בלי לעצור את שעון העצר.
   6. כאשר עכבר נופל תיל, לעצור את השעון ולרשום את זמן התלייה.
   7. כאשר עכברים מסוגלים לתלות ל600 שניות, לקחת אותם את החוט ולהחזיר אותם לכלוב. עכברים שנופלים לפני שהמגבלה זו ניתנים למקסימום של שני ניסיונות נוספים.
   8. רשום את זמן תלייה המרבי (כלומר הארוך ביותר של הניסויים) ולהשתמש בזה לניתוח נוסף.
2. תליית בדיקה עם ארבעה גפיים
   1. מנגנון שהוקם: השתמש באחת יד מרובעת או המכסה של כלוב גדול לחולדה או ארנבת לבדיקה זו. מקם את הרשת 25 ס"מ מעל מצעים רכים כדי למנוע עכברים מלפגוע בעצמם על ירידה, אלא גם כדי להרתיע עכברים לקפוץ במכוון הרשת. חוזקה לאבטח את הרשת, כך שהניסוי לא צריך להחזיק באופן ידני את הרשת במהלך הניסוי כתנועות אלה יורשו ליnterfere עם הביצועים של העכבר.
   2. מניחים את העכבר על הרשת, כך שהוא תופס אותו עם ארבע כפות הרגליים שלה.
   3. הפוך את הרשת, כך שהעכבר הוא תלוי וישירות להתחיל את הטיימר.
   4. פגישת המבחן מסתיימת לעכברים כי הם מסוגלים לתלות למשך תקופה של 600 שניות. תן עכברים שנופלים מחוץ לרשת מוקדם יותר מקסימום של שני ניסיונות נוספים.
   5. לנצל את הזמן המרבי התלוי (כלומר. הארוך ביותר של הניסויים) לניתוח נוסף.

3. ריצה Rotarod

עם כוח השרירים מבחן rotarod, ניתן לקבוע קואורדינציה, שיווי משקל, ומצב ^17.

1. מנגנון שהוקם: לבדיקה זו, עכברים צריכים לרוץ בצינור מסתובב. ודא שהמהירות הקבועה מוגדרת ב 5 סיבובים לדקה (סל"ד), וכי עליות מהירות 5-45 סל"ד בשניות 15 הראשונות כאשר התחילו. אחרי זה יש לו כדי לשמור על המהירות שלו.
2. מקם את העכברים בצינור של rotarodכשהוא מסתובב במהירות קבועה איטית של 5 סל"ד. ניתן לבדוק חמישה עכברים בו זמנית.
3. התחל לרוץ פעם אחת את כל העכברים בעמדה. בתוך שניות 15 הראשונות את המהירות של הצינור מאיצה 5-45 סל"ד אחרי שהיא שומרת על מהירות זו.
4. לפקח על הריצה. זמן הריצה נרשם ברציפות על ידי התוכנה. זמן הריצה מפסיקה באופן אוטומטי כאשר עכבר נופל צינור כמו זה מפעיל את סרגל הזמן המוצב מתחת לצינור. מיקום מחדש של עכברים שמסתובבים פונה לכיוון ההפוך בצינור תוך כדי ריצה מבלי לעצור את הצינור כדי לסובב.
5. בסוף יום המבחן לעכברים כי הם מסוגלים להתמודד על משך 500 שניות. תן עכברים מרביים של שני מנסה יותר ומאפשר להם לשפר את זמן הריצה שלהם, כאשר הם נופלים מוקדם יותר.
6. השתמש בזמן הריצה לכל היותר (כלומר הארוך ביותר של הניסויים) לניתוח נוסף.

4. תרגיל הליכון

הליכון ניתן להשתמש בשלוש דרכים ככלי במחקר קליני מראש. ראשית, ריצה על הליכון בכפייה יכולה לשמש כדי להחמיר הפתולוגיה מחלה כפי שתוארה בפרוטוקול זה (ראה גם: DMD_M2.1.001.pdf). שנית, את יכולת הריצה המקסימלי של עכברים ואת ההשפעות של טיפולים על זה ניתן להעריך (ראה לשיטה לתת לעכברים לרוץ עד אפיסת כוחות DMD_M.2.1.003.pdf). לבסוף, ריצה על הליכון יכולה לשמש לפני עוד מבחן תפקודי כדי למצות את העכבר, כך שהוא מבצע פחות טוב במבחן השני ^13. הדבר נעשה על ידי פעילות גופנית עכברים פעמיים או שלוש פעמים בשבוע כפי שיתואר להלן, באופן ישיר ואחריו האחד משתי הבדיקות פונקציונליות שתוארו בפרוטוקול 1-3.

1. מנגנון שהוקם: יש כמה הליכונים זמינים המסחרית שבו כמה עכברים יכולים run בו זמנית, ואשר יכולים להיות מותאמת גובה, משך ומהירות. הליכונים חלקם מצוידים ברשת כדי לספק זעזועים בעצימות נמוכים כדי לעודד עכברים לרוץ. עם זאת, עכברי MDX רגישים ללחץ והוא יכול בקלות להיות מונעים באופן ידידותי יותר על ידי דחיפה עדינה עם היד בכיוון הריצה. לכן, הוא עודד מאוד לא להשתמש ברשת ההלם. באופן כללי, גירוי עם היד יש צורך רק במהלך פגישת הריצה הראשונה.
2. מניחים את העכברים על ההליכון האופקי.
3. הפעל את ההליכון במהירות ריצה של 12 מ '/ דקה. מהירויות נמוכות (8 מ '/ דקה) צריכים להיות בשימוש בעכברים ישנים (> 15 חודשים), שבו במהירויות גבוהות יותר בקלות להוביל לתשישות.
4. במהלך הפגישה הראשונה, לעודד עכברים לרוץ בעדינות על ידי דוחף אותם כאשר הם קרובים לסוף של החגורה.
5. כאשר העכברים לרוץ לתקופת 30 דקות, הנח אותם בחזרה לכלוב שלהם.
6. חזור על פעולה זו פעמיים בשבוע לדוגמה 12 שבועות.
7. לאפשר מנוחה תקופות בעת צורך. לדוגמא, כמה עכברי MDX צריכים להפסיק לרוץ ויש לאפשר לו לנוח כמה דקות. אם זה קורה, כבה את החגורה מעל, לתת את כל עכברי תקופת מנוחה של שתי דקות, לכבות את החגורה לשתי דקות ב 4 מ '/ דקה. אחרי זה, להגביר את המהירות ל12 מ '/ דקה ולאפשר לעכברים כדי לסיים את הפרוטוקול. חשוב שכל העכברים להשלים את פרוטוקול כל הריצה.
   
   הערה: במקרה עכברי MDX צריכים תקופות מנוחה, לשקול חימום לפני הפעילות הגופנית פרוטוקול 30 דקות. מפגש להתחמם זה מורכב: תקופה 2 דקות התאקלמות במהירות של 4 מ '/ דקה, ומייד אחרי חימום 8 דקות ב 8 מ' / דקה.
   
   
   בידיים שלנו עכברי MDX נשיים 4-16 בן שבוע הם מסוגלים להשלים את פרוטוקול פעילות גופני 30 דקות ללא מנוחה. אחרים דיווחו כי בגיל מתאים עכברי MDX זכר 45% מהעכברים צריכים מנוחה תקופות כדי לסיים את התרגיל. הפרוטוקול להתחמם להפחיתשל כמות התחנות ^12.

תוצאות

כוח אחיזת forelimb מסוג פרוע ועכברי MDX מגביר בין גיל 4-12 שבועות ומקטין שוב בעכברים מבוגרים. ליקויים בכוח כבר יכולים להיות שנצפו בעכברי MDX צעירים. נציגי נתונים של נקבות עכברים 9 שבוע ישן מוצגים באיורי 1 א 'וב' 1. למרות עייפות אינה שונה בין הזנים עדיין בגי...

Discussion

הבדיקות פונקציונליות המוצגות כאן הן לשחזור, קלים לביצוע ומתאימים לסוג בר ועכברי dystrophic עצמאיים של בני גילם. הבדיקות מספקות כלים שימושיים לטרום קליני להעריך את תפקוד שריר, כוח, מצב, ותיאום. כאשר בודקים את ההשפעות של מתחם על ההיסטוריה הטבעית של המחלה, הבדיקות פולשנית תו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM