Fonksiyonel Performans değerlendirilmesi<em&gt; Mdx</em&gt; Fare Modeli

Özet

Nöromüsküler hastalıklar için klinik çalışmalarda birincil sonuç ölçütü genellikle kas fonksiyonunu artırıldı. Bu nedenle, fare modellerinde klinik öncesi kas performansı üzerindeki potansiyel terapötik bileşiklerin etkisini değerlendirmek büyük önem taşımaktadır. Biz burada bu adrese birkaç fonksiyonel testler açıklar.

Özet

Duchenne müsküler distrofi (DMD) tedavisi kullanılabilir olduğu bozukluğu israf ciddi ve ilerleyici kas. Bununla birlikte, birkaç farklı farmasötik bileşikler ve gen terapisi yaklaşımları klinik çalışmalarda içine ilerlemiştir. Bu çalışmalarda en önemli uç noktası olma kas fonksiyonunda iyileşme ile, vurgu bir sürü kas fonksiyonu, gücü, durumu, ve koordinasyon değerlendirmek klinik öncesi fonksiyonel testler gerçekleştirmek için, güvenilir, tekrarlanabilir ve kolay kurma üzerine yerleştirilmiştir DMD için mdx fare modeli. Hem invaziv ve non-invaziv testler mevcuttur. Hastalığı şiddetlendirebilir olmayan testler hastalığın doğal seyrini ve terapötik müdahaleler (örneğin. Ön ayakları kavrama kuvveti testi, bir tel ya da bir ızgara ve rotarod çalışan kullanarak iki farklı asılı testleri) etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, zorunlu yürüme bandı yürütülmesini hastalığın ilerlemesini artırmak ve / veya değerlendirilmesi için kullanılabilirhastalık patolojisi üzerinde tedavi edici girişimlerin koruyucu etkileri. Burada güvenilir ve yeniden üretilebilir bir şekilde bu en yaygın olarak kullanılan fonksiyonel testlerin nasıl açıklar. Standart operasyon prosedürlerine dayanarak bu protokolleri kullanarak farklı laboratuarlar arasında verilerin karşılaştırılmasını sağlar.

Giriş

Duchenne müsküler distrofi (DMD) 1:5,000 yenidoğan erkek etkileyen en sık görülen nöromüsküler hastalıktır. Bu şiddetli ve ilerleyici kas erimesi hastalığı açık okuma çerçevesini bozabilir ve fonksiyonel distrofin protein sentezini engellemek DMD genindeki mutasyonların neden olur. Distrofini eksik kas lifleri inüklenmiş egzersiz açıktır. Kasın rejeneratif kapasitesinin tükendikten sonra, ve zarar gören kas kronik inflamasyon, lifler, örneğin fonksiyon kaybına yol açan, bağ dokusu ve yağ ile değiştirilir. Genellikle, DMD hastaları, ikinci on yılda erken alt ekstremite ambulasyonu kaybedersiniz. Daha sonra, aynı zamanda kol ve omuz kuşağı kasları etkilenen ve hastalar genellikle nedeniyle omuriliği destekleyen kasların asimetrik zayıflamasına torakolomber skolyoz gelişebilir. Yardımlı havalandırma genellikle geç ergenlik veya erken yirmili gereklidir. Solunum ve kalp yetmezliği kurşunüçüncü veya dördüncü on ¹ ölüme.

Neden olan gen 25 yıl önce ² keşfedilmiş olmasına rağmen, DMD için kullanılabilir tedavisi yoktur. Ancak, sağlık bakımı gelişmiş ve kortikosteroid kullanımı Batı dünyasında ³ yaşam beklentisini artmıştır. Mdx fare gibi hayvan modellerinin kullanımı ile önemli adımlar potansiyel tedavi stratejileri keşif içine iletmek yapılmıştır. Mdx fare en sık kullanılan DMD fare modelidir. Bu murin Dmd geninin ekson 23, bir nokta mutasyon vardır ve bunun sonucu olarak distrofin ⁴ yoksundur. Yıl son çift üzerinde, önerilen birçok strateji klinik çalışmalarda ^5-9 içine ilerlemiştir. Bu çalışmalarda, kas fonksiyonlarının iyileştirilmesi test öncesi klinik aşamasında farelerde kas fonksiyonu üzerinde bileşiklerin yararı test önemi vurgulanarak, birincil son nokta.

DMD gibiHastalar aynı zamanda, MDX farelerin distrofin olumsuz kas lifleri hasarını egzersiz hassas olan ve kas fonksiyonu C57BL/10ScSnJ yabani tip farelere kıyasla bozulur. Bu bozulma fonksiyonel testler çeşitli değerlendirilebilir. Bu testlerin bazıları noninvaziv ve kas patoloji (örn. ön ayakları kavrama gücü, asılı testleri ve rotarod çalışan) karışmaz. Bu yüzden, hastalığın doğal seyrini izlemek veya hastalığın ilerlemesi üzerinde bileşiklerin etkisini belirlemek için de kullanılabilir. Bir mdx farelerde kas fonksiyonu üzerinde bileşiklerin etkisi derinlik resimde, bu testlerin tüm oluşan hastalığın ilerlemesi ile müdahale etmeyen bir işlevsel test rejimi ¹⁰ kullanılabilmektedir almak için.

Alternatif olarak, zorla koşu bandı koşu kasten hastalığın ilerlemesini kötüleştirecek ve bileşiklerin ¹¹ koruyucu kapasitelerini test etmek için kullanılır. Koşu bandı da olabilirBu tedavi grupları arasındaki performans ¹³ daha büyük farklılıklar sağlanması daha sonraki bir işlevsel test daha az iyi performans o kadar tükenme kadar çalışma süresi ¹² ölçülen ya da yorgunluk, MDX fareler için bir araç olarak edildiği sonuç ölçüsü olarak kullanılır. Fonksiyonel testler seçerken mdx fare gibi ¹⁴ distrofik fareler test, özellikle hastalığın ilerlemesi üzerindeki etkileri göz önünde tutulmalıdır.

Biz burada TEDAVİ NMD ağı mevcut standart işletim prosedürleri dayalı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde en sık kullanılan fonksiyonel testler yapmak için nasıl ayrıntılı olarak açıklanmıştır. TEDAVİ Ulusal Füze Savunması ziyaret etmek için buraya tıklayın .

Protokol

Burada anlatılan deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC) ve Hayvan Etik Komitesi (DEC) tarafından onaylanmıştır. Fareler LUMC en hayvan tesis tarafından yetiştirilen ve 12 saat aydınlık karanlık döngüsü ile tek tek havalandırılmış kafeslerde tutuldu. Onlar su ve standart mamasına ad libitum erişim vardı.

Aşağıda tarif edilen fonksiyonel testlerin herhangi gerçekleştirirken, deney koşulları kesinlikle değişimini azaltmak için kontrol edilmesi gerekir. Performans yaş ve cinsiyetler arasındaki farklılık gibi Tercihen, yaş ve cinsiyet eşleştirilmiş fareler, kullanılmalıdır. Aynı çöp ait Fareler deney grupları üzerinde randomize olmalıdır. Hayvanlar deney grupları için kör aynı operatör tarafından test edilmelidir. Testler tek tek farelerden ve zaman noktaları arasında ¹⁴ büyük değişim herkes için görülebilir vb kokuları, sesleri, eşitlemek için gün ve hafta içi, aynı odada aynı anda üzerinde yapılmalıdırişlevsel testler, bu nedenle 6-8 farenin / deney grubu kullanılmalıdır. Fonksiyonel test performansı da büyük ölçüde farklı akraba yabani tip suşlar arasında farklılık olabilir. Bu yüzden, deney ve kontrol yabani tip farenin her zaman (MDX farelerde durumunda C57BL/10ScSnJ vahşi tip suşu kullanın) karşılık gelen arka olmalıdır. Burada tarif edilen tüm veriler, burada itibaren vahşi tip bakın C57BL/10ScSnJ vahşi tip suş ile elde edilmiştir. Burada tarif edilen deneyler MDX ve vahşi tip farelerde yaşı en az 1-19 ay uzunlamasına kullanılabilir. Testler ilgi ve görevi gerçekleştirmek için istekli kaybetme fareler önlemek için fazla haftada bir kez daha tekrar edilmemelidir.

1.. Ön ayakları Tutuş Dayanım Testi

Ön ayakları gücünü ölçmek için ön ayakları kavrama kuvveti testi kullanın. Test kuyruk ¹⁵ tarafından askıya zaman içgüdüsel bir ızgara kavramak için bir fare eğilimi dayalı ve adapte edilirD DMD_M2.2.001.pdf .

1. Aparatı kurmak: çekme sırasında ızgara üzerinde fare tarafından uygulanan maksimum kuvvet ölçen bir kuvvet dönüştürücü, bir ızgara takın. Emin ayar çekmek için Tepe germe modunda (T-PK) açık olduğundan emin olun. Güç birimleri ya da gram-of-kuvvet, gram-of-kuvveti-of pound-kuvvet, kilogram-of-kuvvet veya Newton olarak ayarlanabilir.
   Not: Biz değerlerin birimi olarak gram ile çalışmayı tercih. Birden metre ticari olarak mevcuttur, ancak kolu tipi kuvvet dönüştürücüler olumsuz kolu etkisi fizik yasaları tarafından etkilenmektedir gibi yalnızca eksenel dönüştürücüler güvenilir sonuçlar verir. , Bir ızgara veya nonflexible üçgen ya çapı 1-2 mm olan çubuklar kullanılabilir.
2. Testten önce, vücut ağırlığı için normalleştirme izin vermek için, fare vücut ağırlığı değerlendirmek.
3. Değerler birim olarak gram kullanın. Her reco başlangıcında metre sıfırlarding.
4. Kuyruk kapma ve ızgaraya doğru yatay olarak hareket ederek kafesinden fareyi çıkarın.
5. Fare hem forepaws sıkıca kavrıyor ızgara kontrol edin.
6. Onun kavramak kırık olduğunu bu yüzden uzak ızgara fareyi çekin; ızgarasına uygulanan yüksek kuvvet elle ya da otomatik olarak kaydedilmiş olabilir Transdüserin, ekranda gösterilir.
7. Sadece fare deneyci direnç gösteren hangi hesaba çeker alır. Sadece bir forepaw veya arka ayakların kullanılan ve fare çekme sırasında çevrildi hangi önlemlerin Reddet.
8. Fare bir satırda grid üç kez çekin ve ardından en az bir dakika dinlenme dönemi için kafes içinde iade edelim Not:. Serisi arasında bir dinlenme süresi fare kurtarmak ve alışkanlık oluşumunu önlemek için gerekli çeker.
9. Sonra fare çeker dört dizi, kısa bir dinlenme dönemi takip her yapalım. Bu şekilde mousE 15x (3 çekişten x 5 kat = 15) çekmeniz toplam çekti.
10. Maksimum kavrama gücünü belirlemek ve toplanan 15 değerleri dışında yüksek üç değerlerin ortalaması alınarak vücut ağırlığı normalleştirmek.
11. İsteğe bağlı: ilk iki ortalamasının ve çekiştirmeye son iki dizi 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C arasında ve 13 +14 + düşmeyi hesaplayarak yorgunluk belirleyin 15 = D. Formül: (C + D) / (A + B) yorgun olmayan fareler için 1 bir değer verir. Yorulmadan fare% 0 arasında bir değere ve ön ayaklar tamamen% 100 arasında bir değere sahiptir aşırı yorgunluk olduğu bir fare olması için bu yüzde olarak ifade edilebilir.

2. Testler asılı

Asılı testleri, denge, koordinasyon ve kas durumu ile değerlendirilebilir. Bu testler fareler bitkinlik ¹⁶ kadar tel veya ızgara üzerinde asılı kalması için istekli olduğu bilgisine dayanmaktadır. Iki farklı asılı testler ya testin başlangıcında bulunmaktadırİki ön ayakları veya tüm dört bacağı sırasıyla sadece bir tel veya ızgara kullanarak kullanılır. Tel ve ızgara kullanarak asılı testi uyarlanan uzun asma zaman yöntem DMD_M.2.1.004.pdf ve DMD_M.2.1.005.pdf sırasıyla. Sabit asılı sınırı 600 saniye kullanılır. Distrofik fareler Yapamam ise yabani tip farelerin çoğunluğu, 600 saniye için asabilirsiniz. Bu testi yapmanın zamanı harcama azaltmak için, maksimum asılı süre yerde kuruldu. Daha önce tel veya ızgara düşmek Fareler iki denemeden kadar verilir. Bu fareler asmak için gerçekten edemiyoruz nedeniyle sakarlık düşmemesi reasürans yapılır.

1. Iki kol ile bir test asılı
   1. Aparatı kurmak: Sıkıca bant ile bir rafa 2 mm kalınlığında metal kumaş askı güvenli ve çevresinde 37 askı korumak0, yatak tabakası üzerinde cm. Not: alternatif olarak, sıkı bir şekilde 2 dikey bantları arasında sabitlenmektedir genişliğinde 2 mm kalınlığında bir metal tel 55 cm kullanılabilir. 37 cm mesafe asılı kalması fareler teşvik etmek için yeterli, ama aynı zamanda düşme zaman yaralanmalardan fareler önlemek için yeteri kadar düşüktür. Tel titrer ya bu fare performansı olumsuz etkileyebilir test sırasında yerini almamalıdır.
   2. Kuyruk üzerinden fareyi idare ve tel yakın getirmek.
   3. Fare sadece iki ön ayakların ile tel kavramak edelim ve fare sadece telin (Şekil 2B) üzerindeki iki ön ayakların ile asılı olduğu bir şekilde arka ayakların alt.
   4. Fare serbest bırakıldığında doğrudan sayacını başlatmak. Serbest bırakıldıktan sonra, güçlü fareler (Şekil 2C) izin verilir, tüm dört bacağı ve kuyruğu ile tel yakalamaya çalışın.
   5. Bir fare üzerinde dengeleme ya da kasıtlı sh olarak tel atlama gibi yanlış bir davranış gösterir (zaman) Şekil 2D ve 2E kendi doğrudan zamanlayıcı durmadan tel üzerinde fareyi değiştirerek bu adresi.
   6. Bir fare teli kapalı düştüğünde, Sayacı durdurmak ve asılı zamanı kaydedecektir.
   7. Fareler 600 sn asmak için mümkün olduğunda, tel onları çıkarmak ve kafes onları geri. Bu sınırın önce düşmek Fareler iki denemeden bir süre verilir.
   8. (Çalışmaların uzun yani) maksimum asılı zamanını kaydedin ve daha fazla analiz için kullanabilirsiniz.
2. Dört bacağı ile testi asılı
   1. Aparatı kurmak: kullanın ya kare ya da bu test için bir sıçan veya tavşan için büyük bir kafesin kapağı yapılmış bir el. Düşen üzerine kendilerine zarar fareler önlemek için 25 cm yumuşak yatak üzerinde ızgara yerleştirin, aynı zamanda kasten ızgara kapalı atlamak için fareler vazgeçirmek için. Deneyci elle bu hareketler olarak deney sırasında ızgara tutmak zorunda kalmaması sıkıca ızgarayı güvenli olabilir iFarenin performansı ile nterfere.
   2. Onun dört pençeleri ile anlamasından böylece ızgara üzerinde fare yerleştirin.
   3. Fare asılı böylece ızgarayı ters çevirin ve doğrudan Sayacı başlatmak.
   4. Test oturumu 600 saniye bir süre için asmak mümkün olan fareler için sona erer. Izgara kapalı iki denemeden önce maksimum düşme fareler verin.
   5. Daha fazla analiz için maksimum asılı zaman (yani. Çalışmaların uzun) kullanın.

3. Rotarod Koşu

Rotarod Test kas gücü, koordinasyon, denge, ve durumu ¹⁷ tespit edilebilir.

1. Aparatı kurmak: Bu test için, fareler dönen bir tüp üzerinde çalıştırmak zorunda. Sabit hız dakika (rpm) başına 5 devirlerde ayarlanmış olduğundan emin olun ve ilk 15 saniye içinde 5-45 rpm hız artar o zaman başladı. Bundan sonra onun hızını korumak için vardır.
2. Döner çemberde geçirdiği bir tüp üzerinde fareler yerleştirinit 5 rpm yavaş sabit bir hızda döndüğü zaman. Beş fareye, eşzamanlı olarak test edilebilir.
3. Run bir kez tüm fareler konumlandırılmış başlayın. Ilk 15 saniye içinde tüpün hızını bu hızı muhafaza sonra 5-45 rpm hızlandırır.
4. Çalışmasını izleyin. Işletim süresi sürekli olarak yazılım tarafından kaydedilir. Bu tüpün altına yerleştirilmiş zaman çubuğu aktive olarak bir fare tüp kapalı düştüğünde zaman çalışan otomatik olarak durur. Döndürmek için tüp durmadan çalışırken tüp üzerinde ters yöne bakan dönüp fareler yeniden konumlandırmak.
5. 500 saniyelik bir süre için çalıştırmak mümkün olan fareler için bir test oturumu bitirmek. Farelere daha önce düştüğünde onlara, onların çalışma süresini artırmak için izin iki denemeden bir maksimum verir.
6. Daha fazla analiz için (denemelerinin uzun yani) maksimum çalışma süresi kullanın.

4. Koşu Bandı Egzersiz

Koşu bandı öncesi klinik araştırmalarda bir araç olarak üç şekilde kullanılabilir. Öncelikle, zorla koşu bandı koşu (: ayrıca bkz bu protokol açıklandığı gibi hastalığı patoloji azdırmak için kullanılabilir DMD_M2.1.001.pdf ). İkinci olarak, bu ilgili fare ve tedavilerin etkilerinin maksimum çalışma kapasitesi (farenin tükenme kadar çalışmasına izin metodu için bkz değerlendirilebilir DMD_M.2.1.003.pdf ). Son olarak, koşu bandı koşu bu ikinci testte ¹³ daha az iyi performans böylece fareyi tüketmeye önce başka bir fonksiyonel test için kullanılabilir. Bu doğrudan protokol 1-3 de tarif edilen fonksiyonel testlerden herhangi biri birini takip, aşağıda tarif edildiği gibi iki veya üç kez haftalık fareler egzersiz ile yapılır.

1. Aparatı kurmak: birkaç farenin ru can ticari olarak mevcut birkaç koşu bandı vardırn aynı anda ve yükseklik, süre ve hız ayarlanabilir hangi için. Bazı koşu bandı çalıştırmak için fareler teşvik etmek için düşük yoğunluklu şokları sunmak için bir ızgara ile donatılmıştır. Bununla birlikte, MDX farenin basınca karşı hassas ve kolayca akış yönünde el ile hafif bir itme dostça bir şekilde motive edilebilir. Bu nedenle, güçlü şok ızgara KULLANMAYIN teşvik edilmektedir. Genellikle, el ile uyarılması sadece ilk çalışma oturumu sırasında gereklidir.
2. Yatay koşu bandı üzerinde fareler yerleştirin.
3. / Dk 12 m koşu hızında koşu bandı başlayın. Daha yüksek hızlar kolaylıkla tükenme yol açtığı durumlarda, düşük hızlar (8 m / dakika) (> 15 ay) farelerin kullanılacak gerekir.
4. Ilk oturumunda, onlar kemer sonuna yakın olduğunuzda onları hafifçe iterek çalıştırmak için fareler teşvik ediyoruz.
5. Fareler 30 dakika bir süre için çalıĢtırdığınızda kendi kafes içine geri koyun.
6. Örneğin 12 hafta boyunca haftada iki kez tekrarlayın.
7. Gerektiğinde dinlenme süreleri izin verin. Örneğin, bazı mdx fareler çalışmasını durdurmak ve birkaç dakika dinlenmeye izin verilmelidir var. Bu durumda, kemer kapatın, tüm farelere iki dakikalık bir dinlenme süresi vermek, 4 m / dak iki dakika süreyle kemer açın. Bundan sonra, 12 m / dak hızını artırmak ve fareler protokolü tamamlamak için izin verir. Tüm fareler, tüm çalışma protokolü Tam önemlidir.
   
   Not: mdx fareler dinlenme dönemleri ihtiyaç durumunda 30 dakika egzersiz protokolü öncesine kadar sıcak bir düşünün. Derhal / min 8 m, 8 dakikalık ısınma ve ardından 4 m / dk 'lık bir hızda, 2 dakika iklime alıştırma süresi: Bu ısıtmak oturum oluşur.
   
   
   Bizim ellerde 4-16 haftalık dişi fareler mdx dinlenme olmadan 30 dakika egzersiz protokolünü tamamlamak edebiliyoruz. Diğerleri yaş erkek mdx farelere farelerin% 45 egzersiz bitirmek için dinlenme süreleri gerek yok uyumlu olduğunu bildirdi. Isınma protokolü azaltmakdurak ^12'nin s miktarı.

Sonuçlar

Vahşi tip ve MDX farelerin ön ayakları kavrama kuvveti 4-12 haftalık yaş arasında artar ve büyük farelerde daha azaltır. Yürürlükte Bozukluklar zaten genç MDX farelerde gözlemlenebilir. 9 haftalık dişi farelerin Örnek data Şekiller 1 A ve 1 B 'de gösterilmiştir. Yorgunluk bu yaşta henüz suşları arasındaki farklılık olmamasına rağmen, mdx vahşi farelerden daha zayıftır. Biz eski MDX ve vahşi tip farelerde yorgunluğ...

Tartışmalar

Burada sunulan işlevsel testler, yeniden üretilebilir, uygulaması kolay ve vahşi tip ve yaştan bağımsız distrofik fareler için de geçerlidir. Testler öncesi klinik kas fonksiyonu, gücü, durumu ve koordinasyonu değerlendirmek için yararlı araçlar sağlar. Hastalığın doğal seyri üzerinde bir bileşiğin etkilerini test ederken, girişimsel olmayan testler burada (ön ayakları kavrama gücü, hem asılı testleri ve rotarod testi) tarif güzel bu testler ardışık günlerde gerçekleştirilen bir i?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM