Évaluation de la performance fonctionnelle dans le<em&gt; MDX</em&gt; Modèle de souris

Résumé

Le critère de jugement principal dans les essais cliniques pour les maladies neuromusculaires est généralement amélioré la fonction musculaire. Par conséquent, l'évaluation de l'effet des composés thérapeutiques potentiels sur la performance musculaire pré clinique dans des modèles de souris est d'une grande importance. Nous décrivons ici plusieurs tests fonctionnels pour y remédier.

Résumé

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une musculaire sévère et progressive perdre trouble pour lequel aucun traitement n'est disponible. Néanmoins, plusieurs composés pharmaceutiques potentiels et des approches de thérapie génique ont progressé dans des essais cliniques. Avec l'amélioration de la fonction musculaire soit le point final le plus important dans ces essais, beaucoup d'accent a été mis sur la mise en place fiable, reproductible et facile à effectuer des tests fonctionnels de pré clinique évaluer la fonction musculaire, la force, l'état et la coordination dans le modèle de souris mdx de DMD. Les deux tests invasifs et non invasifs sont disponibles. Tests qui ne aggravent la maladie peuvent être utilisés pour déterminer l'histoire naturelle de la maladie et les effets des interventions thérapeutiques (p. ex. Des tests de résistance préhension des membres antérieurs, deux essais de suspension différents en utilisant soit un fil ou une grille et rotarod fonctionnement). Sinon, course sur tapis roulant forcé peut être utilisé pour améliorer la progression de la maladie et / ou évaluereffets protecteurs des interventions thérapeutiques sur la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici comment effectuer ces tests fonctionnels les plus couramment utilisés d'une manière fiable et reproductible. L'utilisation de ces protocoles basés sur des procédures d'exploitation standard permet de comparer les données entre les différents laboratoires.

Introduction

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente chez les garçons nouveau-nés 1:5000. Cette maladie du dépérissement musculaire sévère et progressive est causée par des mutations dans le gène DMD qui perturbent le cadre de lecture ouvert et empêchent la synthèse de la protéine dystrophine fonctionnelle. Les fibres musculaires qui n'ont pas la dystrophine sont vulnérables à exercer dommages induits. Lors de l'épuisement de la capacité de régénération du muscle, et en raison de l'inflammation chronique des muscles endommagés, les fibres sont remplacées par du tissu conjonctif et de la graisse, ce qui conduit par la suite à une perte de fonction. Généralement, les patients DMD perdent la marche des membres inférieurs au début de la deuxième décennie. Plus tard, aussi les muscles des bras et de la ceinture scapulaire sont touchés et les patients développent souvent une scoliose dorso-lombaire raison de l'affaiblissement asymétrique des muscles de soutien de la moelle épinière. La ventilation assistée est généralement nécessaire à la fin de l'adolescence ou au début de la vingtaine. Respiratoire et l'insuffisance cardiaque plombà la mort dans le troisième ou quatrième décennie ^1.

Bien que le gène responsable a été découvert il ya plus de 25 ans ^2, il n'existe aucun remède disponible pour la DMD. Cependant, l'amélioration des soins de santé et l'utilisation de corticostéroïdes ont augmenté l'espérance de vie dans le monde occidental ^3. Avec l'utilisation de modèles animaux comme la souris mdx, de grandes avancées dans la découverte de stratégies thérapeutiques potentielles ont été faites. La souris mdx est le modèle de la souris DMD le plus couramment utilisé. Il a un point de mutation dans l'exon 23 du gène de la DMD murine et manque par conséquent, la dystrophine ^4. Au cours des deux dernières années, de nombreuses stratégies proposées ont progressé dans les essais cliniques ^5-9. Dans ces essais, l'amélioration de la fonction musculaire est le principal critère d'évaluation, soulignant l'importance de tester l'intérêt des composés sur la fonction musculaire chez la souris lors de la phase préclinique d'essais.

Comme DMDpatients, aussi les dystrophine négatifs fibres musculaires de souris mdx sont vulnérables à exercer dommages induits et leur fonction musculaire est diminuée par rapport à des souris de type sauvage C57BL/10ScSnJ. Cette déficience peut être évaluée avec une variété de tests fonctionnels. Certains de ces tests sont non invasive et n'interfèrent pas avec la pathologie musculaire (par exemple, des membres antérieurs de la force de préhension, les tests suspendus et rotarod fonctionnement). Par conséquent, ils peuvent être utilisés pour surveiller l'évolution naturelle de la maladie ou de déterminer les effets de composés sur la progression de la maladie. Pour obtenir une image en profondeur l'influence des composés sur la fonction musculaire chez la souris mdx, un régime de test fonctionnel qui n'interfère pas avec la progression de la maladie composé de tous ces tests peut être utilisé ^10.

En variante, tapis roulant en marche forcée peut être utilisé pour exacerber intentionnellement progression de la maladie et de tester les capacités de protection des composés ^11. Le tapis de course peut aussi êtreutilisé comme mesure de résultat dans lequel durée jusqu'à l'épuisement est mesurée ^12, ou comme un outil de souris mdx de fatigue afin qu'ils réussissent moins bien dans un test fonctionnel ultérieur assurer de plus grandes différences de performance entre les groupes de traitement ^13. Lors du choix des tests fonctionnels, leur effet sur ​​la progression de la maladie doit être gardé à l'esprit en particulier lors de l'essai souris dystrophique comme la souris mdx ^14.

Nous décrivons ici en détail comment effectuer des tests les plus couramment utilisés fonctionnels d'une manière fiable et reproductible sur la base de procédures normalisées d'exploitation disponibles sur le réseau TREAT-NMD. Cliquez ici pour visiter TREAT-NMD .

Protocole

Les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité d'éthique animale (DEC) de la Leiden University Medical Center (LUMC). Les souris ont été élevés par l'animalerie du LUMC et gardés dans des cages individuellement ventilées avec 12 h de lumière de cycles sombres. Ils ont eu accès à volonté à l'eau et une nourriture standard.

Lors de l'un des tests fonctionnels décrits ci-dessous, les conditions expérimentales doivent être strictement contrôlée pour réduire la variation. De préférence, les souris appariés par âge et sexe devraient être utilisés, comme la performance diffère entre l'âge et les sexes. Les souris appartenant à la même portée doivent être répartis de façon aléatoire dans les groupes expérimentaux. Les animaux doivent être testés par le même opérateur, qui est aveugle aux groupes expérimentaux. Les tests doivent être effectués sur la même heure de la journée et de la semaine, même salle pour égaliser les odeurs, les bruits, etc ¹⁴ Grande variation entre les souris individuelles et les points de temps peut être observée pour tousles tests fonctionnels, donc 6-8 souris / groupe expérimental doivent être utilisés. Les performances du test fonctionnel peut aussi largement différer entre les différentes souches de type sauvage consanguines. Par conséquent, les souris de type sauvage et témoins auraient toujours dû milieux correspondant (dans le cas des souris mdx utiliser la souche de type sauvage C57BL/10ScSnJ). Toutes les données décrites ici ont été obtenus avec la souche de type sauvage C57BL/10ScSnJ, que nous appelons de type sauvage comme à partir d'ici. Les essais décrits ici peuvent être utilisés longitudinalement d'au moins 1-19 mois chez les souris de type sauvage et MDX. Tests ne devraient pas être répétées plus d'une fois par semaine pour éviter de perdre des souris intérêt et la volonté d'accomplir la tâche.

Une. Préhension des membres antérieurs test de résistance

Utilisez le test préhension des membres antérieurs de force pour mesurer la force des membres antérieurs. Le test est basé sur la tendance d'une souris pour saisir instinctivement une grille lorsqu'il est suspendu par la queue ^15, et adapted à partir DMD_M2.2.001.pdf .

1. Appareil mis en place: Fixez une grille à un capteur de force, qui mesure la force maximale appliquée par la souris sur la grille lors de la traction. Assurez-vous que le réglage est sur le pic mode de tension (T-PK) pour tirer. Les unités de force peuvent être ajustés en soit onces à la force, en grammes de la force, de livres à la force, en kilogrammes de la force, ou Newton.
   Note: Nous préférons travailler avec des grammes comme unité de valeurs. Mètres multiples sont disponibles dans le commerce, mais seulement transducteurs axiaux donnent des résultats fiables que des transducteurs de type levier de force sont influencés négativement par les lois de la physique de l'effet de levier. Soit d'une grille ou d'un triangle non flexible peuvent être utilisés avec des barres qui sont de 1 à 2 mm de diamètre.
2. Avant l'essai, l'évaluation du poids corporel de la souris, pour permettre la normalisation de poids corporel.
3. Utilisation grammes comme unité de valeurs. Réinitialiser le compteur au début de chaque recording.
4. Débranchez la souris de sa cage en saisissant la queue et se déplaçant horizontalement vers la grille.
5. Vérifiez que la souris saisit la grille fermement avec les deux pattes de devant.
6. Tirez la souris de la grille de sorte que sa portée est cassé, la plus grande force appliquée à la grille sera affiché sur l'écran de la sonde, qui peut être soit manuellement ou automatiquement enregistrée.
7. Ne prendre que des tractions en compte dans laquelle la souris présente une résistance à l'expérimentateur. Rejeter mesures dont un seul patte, ou les membres postérieurs ont été utilisés et dans lequel la souris transformées au cours de la traction.
8. Laissez la souris tirer sur la grille trois fois de suite, puis revenir dans la cage pour une période de repos d'au moins une minute. Remarque: entre les séries de tire une période de repos est nécessaire pour la souris pour récupérer et éviter la formation de l'habitude.
9. Alors laissez la souris effectuer quatre séries de tractions, chacune suivie d'une période de repos de courte. De cette façon, la mouse a tiré un total de 15x (3 essais x 5 = 15 fois PULLS).
10. Déterminer la force de préhension maximale et de normaliser le poids corporel en prenant la moyenne des trois valeurs les plus élevées des 15 valeurs recueillies.
11. Facultatif: déterminer la fatigue par le calcul de la décrémentation de la moyenne entre les deux premières et les deux dernières séries de tractions 1 2 3 = A, 4 5 6 = B, 10 11 12 13 et C = 14 + 15 = D. La formule: (C + D) / (A + B) donne une valeur de 1 pour les souris qui ne sont pas fatigués. Cela peut être exprimée en pourcentage de sorte que la souris sans fatigue a une valeur de 0% et une souris qui pattes avant sont complètement fatigué a une valeur de 100%.

2. Suspendre Tests

Avec les tests de suspension, l'équilibre, la coordination et l'état musculaire peut être évaluée. Ces tests sont basés sur la connaissance que les souris sont désireux de rester suspendu à un fil ou une grille jusqu'à épuisement ^16. Il existe deux tests d'accrochage distinctifs dans lequel au début de l'essai, soitseuls les deux membres antérieurs ou les quatre membres sont utilisés, à l'aide d'un fil ou d'une grille respectivement. Le test d'accrochage à l'aide du fil et le réseau sont les plus longues méthode du temps de suspension adapté de DMD_M.2.1.004.pdf et DMD_M.2.1.005.pdf respectivement. Une limite pendaison fixe est utilisée de 600 sec. La majorité des souris de type sauvage peut accrocher pour 600 secondes, alors que les souris dystrophiques ne peux pas. Pour réduire les dépenses de temps à effectuer ce test, un temps de suspension maximale a été mis en place. Les souris qui tombent du fil ou de la grille avant sont ensuite donnés à deux autres essais. Ceci est fait pour réassurer que les souris sont vraiment pas à accrocher et ne tombent pas en raison de la maladresse.

1. Suspendre test avec deux branches
   1. Appareil mis en place: Étroitement obtenir un 2 mm suspension de toile métallique d'épaisseur à un plateau avec du ruban adhésif et de maintenir la suspension environ 370; cm au-dessus d'une couche de litière. Remarque: alternativement, à 55 cm de large mm de fil métallique épaisse 2 qui est étroitement solidaires entre 2 montants verticaux peuvent être utilisés. La distance de 37 cm est suffisant pour encourager les souris à rester suspendu, mais aussi suffisamment bas pour empêcher les souris de blessures en cas de chute vers le bas. Le fil ne doit pas vibrer ou déplacer pendant le test, car cela pourrait interférer avec le fonctionnement de la souris.
   2. Manipuler la souris par la queue et l'amener près du fil.
   3. Laissez la souris saisir le fil avec les deux pattes avant seulement, et abaisser les membres postérieurs de façon à ce que la souris se bloque uniquement avec les deux pattes de devant sur ​​le fil (figure 2B).
   4. Commencer directement la minuterie lorsque la souris est relâché. Après la libération, les souris fortes essayer d'attraper le fil avec tous les quatre membres et la queue, qui est permis (figure 2C).
   5. Quand une souris montre un comportement inapproprié (comme en équilibre sur ou délibérément sauter le fil comme shposséder les figures 2D et 2E), s'adresser directement ce par le remplacement de la souris sur le fil sans arrêter le chronomètre.
   6. Quand une souris tombe le fil, arrêter le chronomètre et noter le temps de suspension.
   7. Lorsque les souris sont capables de bloquer pendant 600 secondes, les retirer du fil et de les retourner à la cage. Les souris qui tombent avant cette limite sont donnés un maximum de deux autres essais.
   8. Noter le temps de suspension maximale (la plus longue des essais) et l'utiliser pour une analyse ultérieure.
2. Suspendre test avec quatre membres
   1. Appareil mis en place: Utilisez soit une main faite carré ou le couvercle d'une grande cage pour un rat ou le lapin pour ce test. Placez la grille de 25 cm au-dessus de la literie doux pour éviter les souris de se nuire en tombant, mais aussi pour décourager les souris pour sauter volontairement hors de la grille. Fixer solidement la grille de sorte que l'expérimentateur n'a pas à tenir manuellement le réseau au cours de l'expérience que ces mouvements pourraient interfere de la performance de la souris.
   2. Placez la souris sur la grille de sorte qu'il saisit avec ses quatre pattes.
   3. Inversez la grille de sorte que la souris est suspendu et commencer directement la minuterie.
   4. La séance de test se termine pour les souris qui sont capables de bloquer pendant une durée de 600 secondes. Donnez souris qui tombent de la grille plus tôt, un maximum de deux autres essais.
   5. Utiliser le temps maximal de suspension (ie. La plus longue des essais) pour une analyse ultérieure.

3. Course à pied rotarod

Avec la force musculaire de test de la tige tournante, la coordination, l'équilibre, et l'état peuvent être déterminées ^17.

1. Appareil mis en place: Pour ce test, les souris doivent fonctionner sur un tube tournant. Assurez-vous que la vitesse constante est fixé à 5 rotations par minute (rpm), et que la vitesse augmente de 5 à 45 tours par minute dans les 15 premières secondes quand ont commencé. Après cela, il doit maintenir sa vitesse.
2. Placer la souris sur le tube de la tige tournantequand il tourne à une vitesse lente et régulière de 5 tours. Cinq souris peuvent être testés simultanément.
3. Démarrez la course une fois toutes les souris sont placées. Dans les 15 premières secondes de la vitesse du tube accélère 5-45 min après quoi il maintient cette vitesse.
4. Surveillance de la course. Le temps d'exécution est enregistré en continu par le logiciel. Durée s'arrête automatiquement lorsque la souris tombe le tube car cela active la barre de temps positionné en dessous du tube. Repositionner les souris qui tournent autour de la direction opposée sur le tube lors de l'exécution sans arrêt le tube de tourner.
5. Fin de la session de test pour les souris qui sont capables de fonctionner pendant une durée de 500 secondes. Donnez souris un maximum de deux autres essais leur permettant d'améliorer leur temps de course, quand ils tombent plus tôt.
6. Utilisez la durée maximale (c'est à dire la plus longue des essais) pour une analyse plus approfondie.

4. Exercice tapis roulant

Latapis roulant peut être utilisé de trois manières comme un outil dans la recherche préclinique. Tout d'abord, course sur tapis roulant forcé peut être utilisé pour exacerber la pathologie de la maladie, comme décrit dans ce protocole (voir aussi: DMD_M2.1.001.pdf ). Deuxièmement, la capacité de fonctionnement maximale de la souris et les effets des traitements sur ce qui peut être évalué (voir la méthode de laisser les souris courir jusqu'à épuisement DMD_M.2.1.003.pdf ). Enfin, course sur tapis roulant peut être utilisé avant un autre test fonctionnel d'épuiser la souris de sorte qu'il est moins performant dans le deuxième test ^13. Cela se fait en exerçant des souris deux fois ou trois fois par semaine comme décrit ci-dessous, directement suivi par l'un quelconque des essais fonctionnels décrits dans le protocole 3.1.

1. Appareil mis en place: Il ya plusieurs tapis roulants disponibles dans le commerce sur lequel plusieurs souris peuvent run en même temps et pour lequel l'altitude, la vitesse et la durée peuvent être ajustées. Certains tapis roulants sont équipés d'une grille de livrer des chocs de faible intensité pour encourager les souris à courir. Cependant, les souris mdx sont sensibles au stress et peuvent facilement être motivés de façon conviviale par une légère poussée avec la main dans le sens de la marche. Par conséquent, il est vivement recommandé de ne PAS utiliser la grille de choc. En général, la stimulation de la main est nécessaire uniquement lors de la première séance de cours.
2. Placez la souris sur le tapis roulant horizontal.
3. Démarrer le tapis roulant à une vitesse de défilement de 12 m / min. Des vitesses plus faibles (8 m / min) doivent être utilisés chez les souris âgées (> 15 mois), où des vitesses plus élevées facilement conduire à l'épuisement.
4. Au cours de la première session, encourager souris pour exécuter en les poussant doucement quand ils sont près de l'extrémité de la ceinture.
5. Lorsque les souris ont couru pour une durée de 30 min, remettez-les dans leur cage.
6. Répétez cette opération deux fois par semaine pendant 12 semaines par exemple.
7. Autoriser les périodes de repos en cas de besoin. Par exemple, certaines souris mdx ont arrêter de courir et devrait être autorisé à se reposer pendant quelques minutes. Si cela se produit, tourner la courroie, donner toutes les souris une période de repos de deux minutes, mettez la ceinture pendant deux minutes à 4 m / min. Après cela, augmenter la vitesse de 12 m / min et de permettre aux souris pour terminer le protocole. Il est important que toutes les souris terminent le protocole de roulement entière.
   
   Remarque: Dans le cas des souris mdx ont besoin de périodes de repos, envisager un échauffement avant le protocole d'exercice de 30 min. Cette session réchauffer se compose de: une période d'acclimatation de 2 min à une vitesse de 4 m / min, suivi immédiatement par un échauffement de 8 min à 8 m / min.
   
   
   Dans nos vieilles mains 4-16 semaines souris mdx femelles sont capables de compléter le protocole d'exercice de 30 minutes sans repos. D'autres ont signalé que dans appariés pour l'âge des souris mdx mâle 45% des souris n'ont pas besoin des périodes de repos pour terminer l'exercice. Le protocole d'échauffement réduires le montant des butées ^12.

Résultats

La force de préhension des membres antérieurs de type sauvage et des souris mdx augmente entre l'âge de 4-12 semaines et réduit de nouveau chez les souris âgées. Déficiences en vigueur peuvent déjà être observés chez les jeunes souris mdx. Des données représentatives de 9 semaines les souris femelles sont présentés dans les figures 1A et 1B. Bien que la fatigue ne diffère pas entre les souches encore à cet âge, les souris mdx sont plus fa...

Discussion

Les tests fonctionnels présentés ici sont reproductibles, faciles à réaliser et applicable au type sauvage et une souris dystrophique indépendamment de leur âge. Les tests fournissent des outils utiles pour pré clinique évaluer la fonction musculaire, la force, l'état et la coordination. Quand tester les effets d'un composé sur l'histoire naturelle de la maladie, les tests non invasifs décrits ici (force préhension des membres antérieurs, les deux tests suspendus et le test de la tige tournante)...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM