Beurteilung der Funktionsentwicklung in der<em&gt; Mdx</em&gt; Maus-Modell

Zusammenfassung

Der primäre Endpunkt in klinischen Studien für neuromuskuläre Erkrankungen ist in der Regel die Muskelfunktion verbessert. Daher die Beurteilung des Einflusses von möglichen therapeutischen Verbindungen auf die Muskelleistung in Maus-Modellen vor, klinisch von großer Bedeutung ist. Wir beschreiben hier einige funktionale Tests, um dieses Problem anzugehen.

Zusammenfassung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere und progressive Muskel verschwenden Erkrankung, für die keine Heilung ist. Dennoch haben mehrere potenzielle pharmazeutische Verbindungen und Gentherapieansätze in klinischen Studien vorangekommen. Mit Verbesserung der Muskelfunktion die wichtigste Endpunkt in diesen Studien wurde viel Wert auf die Einrichtung zuverlässige, reproduzierbare und einfach zu Funktionstests durchführen, um klinisch vorge beurteilen Muskelfunktion, Kraft, Kondition und Koordination in der gelegt mdx-Maus-Modell für DMD. Beide invasive und nicht-invasive Tests zur Verfügung stehen. Tests, die die Krankheit nicht verschlimmern Sie können verwendet werden, um den natürlichen Verlauf der Erkrankung und die Wirkung von therapeutischen Interventionen (zB. Forelimb Greifkraft-Test, zwei Hänge Tests entweder mit einem Draht oder ein Gitter und Rotarod Laufen) zu bestimmen. Alternativ kann gezwungen Laufband zur Progression der Krankheit zu verbessern und / oder zu beurteilenschützende Wirkung von therapeutischen Interventionen auf den Krankheits Pathologie. Wir beschreiben, wie diese am häufigsten verwendeten funktionellen Tests in zuverlässiger und reproduzierbarer Weise durchzuführen. Mit Hilfe dieser Protokolle auf Basis von Standard-Betriebsverfahren ermöglicht den Vergleich der Daten zwischen verschiedenen Laboratorien.

Einleitung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist die häufigste neuromuskuläre Erkrankung, die 1:5000 neugeborenen Jungen. Diese schwere und fortschreitende Muskelschwäche Krankheit wird durch Mutationen im DMD-Gen, das den offenen Leserahmen stören und verhindern, dass die Synthese funktionaler Dystrophin-Protein verursacht. Muskelfasern Dystrophin fehlt, sind anfällig für induzierte Schäden auszuüben. Nach Erschöpfung der Regenerationsfähigkeit des Muskels, und durch eine chronische Entzündung der geschädigten Muskel, werden Fasern von Bindegewebe und Fett ersetzt ist, anschließend zu einem Verlust der Funktion führt. Generell DMD-Patienten verlieren Gehfähigkeit der unteren Extremitäten in der zweiten Dekade früh. Später auch die Muskeln der Arme und Schultergürtel sind betroffen und die Patienten entwickeln oft thorakolumbalen Skoliose durch asymmetrische Schwächung der Muskeln unterstützt das Rückenmark. Beatmung wird in der Regel in den späten Teenager-oder frühen zwanziger Jahren erforderlich. Atmungs-und Herzversagen führenTod in der dritten oder vierten Lebensjahrzehnt ^ein.

Obwohl das ursächliche Gen wurde vor über 25 Jahren entdeckt, ^2, gibt es keine Heilung für DMD zur Verfügung. Allerdings verbesserte Gesundheitsversorgung und der Einsatz von Kortikosteroiden Lebenserwartung in der westlichen Welt ³ erhöht. Mit der Verwendung von Tiermodellen, wie der mdx-Maus, leiten wichtige Schritte in der Entdeckung der potenziellen therapeutischen Strategien vorgenommen wurden. Die mdx-Maus ist die am häufigsten verwendeten DMD-Maus-Modell. Es hat eine Punktmutation in Exon 23 des murinen Dmd Gen und damit fehlt ^{Dystrophin-4.} In den letzten paar Jahren haben viele vorgeschlagenen Strategien in klinischen Studien ^5-9 fortgeschritten ist. In diesen Studien, die Verbesserung der Muskelfunktion ist der primäre Endpunkt, die Bedeutung der Prüfung der Nutzen der Verbindungen auf die Muskelfunktion bei Mäusen während der präklinischen Phase der Prüfung zugrunde liegen.

Wie DMDPatienten, auch die negativen Muskelfasern Dystrophin von mdx-Mäusen sind anfällig für induzierte Schäden zu üben und ihre Muskelfunktion im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen C57BL/10ScSnJ beeinträchtigt. Diese Beeinträchtigung kann mit einer Vielzahl von funktionellen Tests beurteilt werden. Einige dieser Tests sind nicht-invasive und nicht mit Muskel Pathologie (zB forelimb Griffstärke, hängende Tests und Rotarod Laufen) stören. Daher können sie verwendet werden, um den natürlichen Verlauf der Krankheit zu überwachen oder zu bestimmen, die Auswirkungen der Verbindungen auf den Krankheitsverlauf werden. Um erhalten eine eingehende Bild von dem Einfluss der Verbindungen auf die Muskelfunktion in mdx-Mäusen, eine Funktionsprüfung Regime, das nicht mit Fortschreiten der Erkrankung, die aus allen diesen Tests nicht stört kann verwendet werden, ¹⁰ werden.

Alternativ kann gezwungen Laufband verwendet werden, um absichtlich verschärfen Fortschreiten der Krankheit und testen Sie die Schutzkapazitäten von Verbindungen ¹¹ werden. Das Laufband kann auchals Ergebnis Maßnahme eingesetzt, in denen Laufzeit bis Erschöpfung gemessen ^12, oder als Instrument zur Ermüdung mdx-Mäusen, so dass sie weniger gut durchzuführen in einer anschließenden Funktionstest gewährleistet größere Leistungsunterschiede zwischen den Behandlungsgruppen ^13. Bei der Auswahl der Funktionstests, sollten ihre Wirkung auf den Krankheitsverlauf im Auge besonders bei der Prüfung dystrophischen Mäusen wie der mdx-Maus ¹⁴ gehalten werden.

Wir beschreiben hier im Detail, wie die am häufigsten verwendeten Funktionstests eine zuverlässige und reproduzierbare Weise auf der Grundlage von Standard-Betriebsverfahren der TREAT-NMD-Netzwerk durchzuführen. Klicken Sie hier, um die TREAT-NMD besuchen .

Protokoll

Die hier beschriebenen Experimente wurden von der Tierethikkommission (DEC) des Leiden University Medical Center (LUMC) zugelassen. Die Mäuse wurden durch die Tieranlage des LUMC gezüchtet und gehalten in einzeln belüfteten Käfigen mit 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklen. Sie hatten freien Zugang zu Wasser und Standardfutter.

Wenn die eine der nachfolgend beschriebenen Funktionstests bieten Versuchsbedingungen streng kontrolliert werden, um Schwankung zu verringern. Vorzugsweise sollten Alter und Geschlecht übereinstimmen Mäuse verwendet werden, da die Leistung unterscheidet zwischen Alter und Geschlechter. Mäuse auf dem gleichen Wurf angehören, sollten in den Versuchsgruppen randomisiert werden. Die Tiere sollten vom selben Betreiber, der den Versuchsgruppen geblendet wird getestet werden. Tests sollte auf der gleichen Tageszeit und Wochentag, gleichen Raum durchgeführt, um Gerüche, Geräusche usw. auszugleichen ¹⁴ große Unterschiede zwischen den einzelnen Mäusen und Zeitpunkte für alle beobachtet werdenFunktionstests, daher 6-8 Mäuse / Versuchsgruppe verwendet werden. Funktionstest Leistung kann auch weitgehend zwischen verschiedenen Inzuchtwildtyp-Stämme unterscheiden. Daher sollte Versuchs-und Kontrollwildtyp-Mäusen haben immer entsprechende Hintergründe (bei ​​mdx-Mäusen die C57BL/10ScSnJ Wildtyp-Stamm zu verwenden). Alle hier beschriebenen Daten wurden mit C57BL/10ScSnJ Wildtyp-Stammes, die wir als Wildtyp von hier aus erhalten. Die hier beschriebenen Tests können in Längsrichtung von mindestens 1-19 Monaten in mdx-und Wildtyp-Mäusen verwendet werden. Die Tests sollten nicht mehr als einmal pro Woche wiederholt werden, um Mäuse verlieren Interesse und die Bereitschaft für die Aufgabe zu verhindern.

1. Vorderbein Grip Krafttest

Verwenden Sie die Vordergliedmaße Griffstärke Test, um die Stärke der Vorderbeine zu messen. Der Test basiert auf der Tendenz einer Maus instinktiv erfassen, wenn ein Gitter am Schwanz aufgehängt ¹⁵ basiert, und adapted von DMD_M2.2.001.pdf .

1. Gerät einzurichten: Bringen Sie ein Raster, um einen Kraftwandler, die das von der Maus auf das Netz in dem Pull angewendet Maximalkraft misst. Achten Sie darauf, die Einstellung zum Peak Spannung Modus (T-PK) zum Ziehen. Die Krafteinheiten können entweder in Unzen-of-force, g-of-force, Pfund-of-Kraft, Kilogramm-of-Kraft oder Newton eingestellt werden.
   Hinweis: Wir bevorzugen es, mit Gramm als Einheit von Werten zu arbeiten. Mehrere Meter sind im Handel erhältlich, sondern nur axiale Wandler geben zuverlässige Ergebnisse als Hebel Kraftaufnehmer sind negativ durch die physikalischen Gesetze der Hebelwirkung beeinflusst. Entweder eine nicht-flexible Gitter oder Dreieck mit Balken, 1-2 mm im Durchmesser verwendet werden.
2. Vor dem Test, bewerten das Körpergewicht der Maus, zur Normalisierung des Körpergewichts zu ermöglichen.
3. Verwenden Gramm als Einheit von Werten. Setzen Sie das Messgerät zu Beginn eines jeden recoDing.
4. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig durch packte den Schwanz und bewegt es horizontal in Richtung des Rasters.
5. Überprüfen Sie, dass die Maus greift das Gitter fest mit beiden Vorderpfoten.
6. Ziehen Sie die Maus weg vom Netz, so dass sein Griff ist gebrochen, der höchste Kraft in das Netz angewendet werden auf der Wandler Anzeige, die entweder manuell oder automatisch aufgezeichnet werden können, angezeigt.
7. Nur zieht berücksichtigen, in dem die Maus zeigt Widerstand gegen den Experimentator. Ablehnen Maßnahmen in dem nur eine Vorderpfote, oder die Hinterbeine wurden verwendet und in der die Maus während des Zieh gedreht.
8. Lassen Sie die Maus ziehen Sie die Gitter drei Mal in Folge und dann wieder in den Käfig für eine Ruhezeit von mindestens einer Minute. Hinweis: zwischen Reihe zieht eine Ruhezeit ist notwendig für die Maus zu erholen und Gewohnheitsbildung zu vermeiden.
9. Dann lassen Sie die Maus ausführen vier Serien von Zügen, jeweils gefolgt von einer kurzen Ruhephase. Auf diese Weise mousE hat insgesamt 15x (3 zieht x 5 = 15 mal zieht) gezogen.
10. Bestimmen Sie die maximale Griffkraft und Normalisierung des Körpergewichts, indem der Durchschnitt der drei höchsten Werte der 15 Werte gesammelt.
11. Optional: Bestimmen Ermüdung durch Berechnen der Abnahme zwischen dem Mittelwert der beiden ersten und der letzten zwei Reihen von Zügen 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C und + 13 +14 15 = D. Die Formel: (C + D) / (A + B) ergibt einen Wert von 1 für Mäuse, die nicht ermüdet. Dies kann in Prozenten ausgedrückt werden, so dass eine Maus ohne Ermüdung hat einen Wert von 0% und einer Maus, die Vorderbeine vollständig erschöpft hat einen Wert von 100%.

2. Hängende Tests

Mit hängenden Tests, Balance, Koordination und Muskelzustand beurteilt werden kann. Diese Tests basieren auf der Kenntnis, dass Mäuse sind gespannt hängt an einem Draht oder Gitter Erschöpfung bis ¹⁶ zu bleiben, basiert. Es gibt zwei verschiedene Hängetests, bei denen zu Beginn des Tests entwedernur die beiden Vorderbeine oder alle vier Gliedmaßen verwendet werden, mit einem Draht oder Gitter auf. Die Hängetest mit dem Draht und das Gitter sind die längste Hängezeit-Verfahren adaptiert aus DMD_M.2.1.004.pdf und DMD_M.2.1.005.pdf sind. Eine feste Grenze hängen von 600 Sekunden verwendet. Die Mehrheit der Wildtyp-Mäusen kann für 600 sec hängen, während dystrophischen Mäusen nicht. Um Zeit zu verbringen Durchführung dieses Tests zu reduzieren, wurde eine maximale Hänge Zeit in Kraft gesetzt. Mäuse, die aus der Leitung oder Gitter, bevor dann fallen, werden bis zu zwei weitere Versuche gegeben. Dies geschieht, um rückversichern, dass die Mäuse sind wirklich nicht in der Lage zu hängen und nicht durch Ungeschicklichkeit fallen.

1. Hängetest mit zwei Schenkeln
   1. Gerät einzurichten: Dicht sichern eine 2 mm dicke Metall Kleiderbügel an einem Regal mit Band und rund 37 halten die Kleiderbügel0; cm über einer Schicht aus Betten. Hinweis: Alternativ kann eine 55 cm breite 2 mm dicke Metalldraht, der fest zwischen zwei vertikale Ständer befestigt ist, verwendet werden könnten. Der Abstand von 37 cm ist ausreichend, um Mäuse zu ermutigen, hängen bleiben, aber auch niedrig genug, um Mäuse von Verletzungen zu verhindern, wenn nach unten fallen. Der Draht sollte nicht vibrieren oder zu verdrängen während des Tests, da dies mit der Leistung der Maus stören.
   2. Behandeln Sie die Maus über den Schwanz und bringen es in der Nähe des Drahtes.
   3. Lassen Sie die Maus zu erfassen den Draht nur mit den beiden Vorderpfoten und Senken der Hinterbeine in der Weise, dass die Maus hängt nur mit den beiden Vorderpfoten auf den Draht (2B).
   4. Direkt den Timer zu starten, wenn die Maustaste losgelassen wird. Nach der Freigabe, versuchen starke Mäuse, um den Draht mit allen vier Gliedmaßen und Schwanz, was erlaubt ist (Abbildung 2C) zu fangen.
   5. Wenn eine Maus zeigt ungebührliches Verhalten (wie Balancieren auf oder absichtlich Sprung von der Draht als shbesitzen in den 2D und 2E), direkt an diese durch den Austausch mit der Maus auf den Draht, ohne den Timer.
   6. Wenn eine Maus fällt vom Draht, stoppen Sie die Zeit und notieren Sie die Zeit hängen.
   7. Wenn Mäuse sind in der Lage, für 600 sec hängen, nehmen Sie sie aus dem Draht und bringt sie in den Käfig. Mäuse, die vor dieser Grenze liegen, werden maximal zwei weitere Versuche gegeben.
   8. Notieren Sie den maximalen Hängezeit (dh der längste der Studien) und nutzen diese für die weitere Analyse.
2. Hängetest mit vier Gliedmaßen
   1. Gerät einrichten: Verwenden Sie entweder eine Hand Quadrat oder der Deckel eines großen Käfig für Ratten oder Kaninchen für diesen Test gemacht. Positionieren Sie das Raster 25 cm über weiche Bettwäsche, Mäuse vor auf fallende schaden sich selbst verhindern, sondern auch, um Mäuse zu entmutigen, um absichtlich zu springen, aus dem Netz. Dicht sichern das Netz, so dass der Experimentator nicht, um das Gitter während des Experiments als diese Bewegungen von Hand halten könnte interfere mit der Leistung der Maus.
   2. Platzieren Sie die Maus auf das Gitter, so dass es greift es mit seinen vier Pfoten.
   3. Kehren Sie die Gitter so, dass die Maus hängen und den Timer direkt starten.
   4. Die Testsitzung endet für Mäuse, die in der Lage, für die Dauer von 600 Sekunden hängen, sind. Geben Mäuse, die aus dem Netz früher maximal zwei weitere Versuche fallen.
   5. Verwenden Sie die maximale Hängezeit (dh. Den längsten der Studien) für die weitere Analyse.

3. Rotarod Lauf

Mit dem Test Rotarod Muskelkraft, können Koordination, Gleichgewicht, und der Zustand bestimmt ¹⁷ werden.

1. Gerät einzurichten: Für diesen Test haben Mäuse auf einem Drehrohr laufen. Stellen Sie sicher, dass die konstante Geschwindigkeit bei 5 Umdrehungen pro Minute (rpm) eingestellt ist, und dass die Geschwindigkeit erhöht 5-45 min in der ersten 15 Sekunden beim Start. Nach diesem hat, um seine Geschwindigkeit zu halten.
2. Zeigen die Mäuse auf dem Rohr des RotaRodwenn es sich mit einer langsamen, gleichmäßigen Geschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute. Fünf Mäuse können gleichzeitig geprüft werden.
3. Starten Sie den Lauf einmal alle Mäuse positioniert sind. Innerhalb der ersten 15 sec die Geschwindigkeit des Rohres beschleunigt 5-45 min nach dem es diese Geschwindigkeit beibehält.
4. Überwachen Sie den Lauf. Die Laufzeit wird kontinuierlich durch die Software aufgezeichnet. Laufzeit stoppt automatisch, wenn eine Maus fällt das Rohr, da dies aktiviert den Zeitbalken unter dem Rohr positioniert. Mäuse, die neu umzudrehen in die entgegengesetzte Richtung auf das Rohr während des Betriebs ohne Anhalten der Röhre zu drehen.
5. Beenden Sie die Testsitzung für Mäuse, die in der Lage, für die Dauer von 500 Sekunden laufen. Geben Mäuse maximal zwei weitere Versuche, so dass sie ihre Laufzeit zu verbessern, wenn sie früher fallen.
6. Verwenden Sie die maximale Laufzeit (dh die längste der Studien) für die weitere Analyse.

4. Laufband-Übung

DieLaufband kann auf drei Arten als Werkzeug in der präklinischen Forschung. Erstens kann gezwungen Laufband verwendet werden, um Krankheitspathologie verschärfen, wie in diesem Protokoll beschrieben (siehe auch: DMD_M2.1.001.pdf ). Zweitens kann die maximale Lauffähigkeit von Mäusen und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese bewertet (Siehe für die Methode Mäuse bis Erschöpfung laufen zu lassen, werden DMD_M.2.1.003.pdf ). Schließlich können Laufband vor einem anderen Funktionstest verwendet werden, um die Maus zu erschöpfen, so dass es weniger gut führt im zweiten Test ¹³ werden. Dies wird durch die Ausübung Mäusen zweimal oder dreimal pro Woche, wie nachstehend beschrieben, direkt durch eines der in den Protokoll 1-3 beschriebenen funktionellen Tests durchgeführt, gefolgt.

1. Gerät einzurichten: Es gibt mehrere Laufbänder, auf denen mehrere Mäuse können ru Handel erhältlichn gleichzeitig für die Höhe, Dauer und Geschwindigkeit einstellbar ist. Einige Laufbänder sind mit einem Gitter ausgestattet, um Schocks geringer Intensität zu liefern, um Mäuse zu ermutigen, zu laufen. Allerdings mdx-Mäusen reagieren empfindlich auf Stress und kann leicht in einem freundlicher Weise durch einen leichten Druck mit der Hand in der Laufrichtung motiviert werden. Es wird daher dringend empfohlen, NICHT den Schock Netz. Im allgemeinen wird die Stimulation mit der Hand nur während der ersten Laufeinheit benötigt.
2. Legen Sie die Maus auf der horizontalen Laufband.
3. Starten Sie das Laufband mit einer Laufgeschwindigkeit von 12 m / min. Niedrigere Drehzahlen (8 m / min) haben in alten Mäusen verwendet werden (> 15 Monate), bei höheren Geschwindigkeiten leicht bis zur Erschöpfung führen.
4. Während der ersten Sitzung, zu fördern Mäusen durch sanften Druck, wenn sie in der Nähe des Ende des Bandes sind auszuführen.
5. Wenn die Mäuse für eine Dauer von 30 min laufen, legen Sie sie zurück in ihren Käfig.
6. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal pro Woche für zB 12 Wochen.
7. Lassen Ruhezeiten, wenn nötig. Zum Beispiel haben einige mdx-Mäusen laufen zu stoppen und erlaubt sein sollte, für ein paar Minuten ruhen werden. Wenn dies passiert, schalten Sie den Gürtel aus, geben alle Mäuse eine Ruhezeit von zwei Minuten, drehen Sie den Gurt auf zwei Minuten bei 4 m / min. Danach erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 12 m / min und lassen die Mäuse, um das Protokoll zu beenden. Wichtig ist, dass alle Mäuse, vervollständigen die gesamte Lauf Protokoll.
   
   Hinweis: Bei mdx-Mäusen brauchen Ruhezeiten, betrachten ein Warm-up, bevor die 30 Minuten Übung Protokoll. Diese erwärmen Sitzung besteht aus: 2 min Eingewöhnungszeit bei einer Geschwindigkeit von 4 m / min, unmittelbar gefolgt von einer 8 min Aufwärm bei 8 m / min gefolgt.
   
   
   In unseren Händen 4-16 Wochen alte weibliche mdx-Mäuse sind in der Lage, die 30 Minuten ohne Pause Übung Protokoll abzuschließen. Andere haben berichtet, dass im Alter abgestimmt männlichen mdx-Mäusen 45% der Mäuse brauchen Ruhezeiten, um die Übung zu beenden. Die Warm-up-Protokoll reduzierens die Menge der Anschläge ^12.

Ergebnisse

Die Vordergliedmaße Griffstärke von Wildtyp-und mdx-Mäusen erhöht im Alter zwischen 4-12 Wochen und reduziert wieder in älteren Mäusen. Wertminderungen in Kraft kann bereits in jungen mdx-Mäusen beobachtet werden. Repräsentative Daten von 9 Wochen alte weibliche Mäuse werden in den 1A und 1 B gezeigt. Obwohl Müdigkeit nicht zwischen die Stämme unterscheiden sich noch in diesem Alter sind mdx-Mäusen schwächer als Wildtyp-Mäusen. Wir haben keine Da...

Diskussion

Die hier vorgestellten Funktionsprüfungen sind reproduzierbar, einfach durchzuführen und für Wildtyp und dystrophischen Mäusen unabhängig von ihrem Alter. Die Tests liefern nützliche Tools vor, klinisch beurteilen Muskelfunktion, Kraft, Kondition und Koordination. Bei der Prüfung der Auswirkungen einer Verbindung über die Naturgeschichte der Krankheit, hier beschrieben (Vordergliedmaße Griffstärke, beide hängen Tests und die Test Rotarod) die nicht-invasive Tests lässt sich sehr schön in einem Funktionstest...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse grip strength meter	Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments)	# 80529
Hanging wire 2 limbs device	Cloth hanger or custom made device
Hanging wire 4 limbs device	Lid of rat cage or custom made device
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Treadmill for mice Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM