Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Resumen

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Resumen

Muchas proteínas interactúan de forma transitoria con otras proteínas o se integran en varios complejos de proteínas para llevar a cabo su función biológica. Complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es un método in vivo para monitorear tales interacciones en las células vegetales. En el protocolo presentado las proteínas candidatas investigados se fusionan a mitades complementarias de proteínas fluorescentes y los respectivos constructos se introducen en las células vegetales a través de la transformación mediada por Agrobacterium. Posteriormente, las proteínas se expresan transitoriamente en hojas de tabaco y las señales fluorescentes restaurados se pueden detectar con un microscopio de barrido láser confocal en las células intactas. Esto permite no sólo la visualización de la interacción en sí misma, sino también la localización subcelular de los complejos de proteínas se puede determinar. Para este propósito, los genes marcadores que contienen una etiqueta fluorescente se pueden coexpressed junto con los constructos BiFC, visualizando de este modo las estructuras celulares tales como tél retículo endoplasmático, mitocondria, aparato de Golgi o la membrana plasmática. La señal fluorescente se puede controlar ya sea directamente en las células epidérmicas de la hoja o en protoplastos individuales, que pueden ser fácilmente aislado de las hojas de tabaco transformadas. BiFC es ideal para estudiar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural dentro de la célula viva. Sin embargo, se tiene que considerar que la expresión tiene que ser impulsado por promotores fuertes y que los compañeros de interacción se modifican debido a la fusión de las relativamente grandes etiquetas de fluorescencia, lo que podría interferir con el mecanismo de interacción. Sin embargo, BiFC es un excelente enfoque complementario a otros métodos comúnmente aplicados investigan las interacciones proteína-proteína, como coimmunoprecipitation, vitro desplegable ensayos o experimentos en la levadura de dos híbridos.

Introducción

El estudio de la formación de complejos de proteínas y su localización en células vegetales in vivo es esencial para investigar las redes celulares, la señalización y los procesos metabólicos. BiFC permite la visualización de las interacciones proteína-proteína en su entorno natural directamente dentro de la célula de la planta de estar ^1-5.

En la BiFC acercarse a la complementación de dos fragmentos N-y C-terminales no fluorescentes de una ventaja de la proteína fluorescente a una proteína fluorescente reconstituido. Fragmentos de muchas proteínas fluorescentes diferentes se han utilizado para detectar interacciones de proteínas, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) el cromóforo de que se forma químicamente por tres residuos distintos ^6. Proteínas fluorescentes pueden reducirse a la mitad dentro de un bucle o ß-cadena para dar lugar a los dos fragmentos no fluorescentes que se pueden fusionar a ambas proteínas de interés. El ensayo se puede usar para detectar interacciones en cualquier compartme subcelularnt en cualquier organismo aeróbicamente creciente o células que se pueden modificar genéticamente para expresar las proteínas de fusión. Si las dos proteínas entran en estrecha proximidad dentro de la célula, la fluorescencia se reconstituye y se puede monitorizar mediante microscopía sin la adición de fluoróforos o colorantes exógenos ^3.

Tabaco (Nicotiana benthamiana) ha demostrado ser un organismo modelo conveniente de visualizar la interacción de proteínas de plantas, ya que las proteínas se pueden expresar fácilmente mediante la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium de hojas de tabaco con las construcciones generadas. Agrobacterias utilizan un plásmido Ti llamado (inductor de tumores) que codifican enzimas que median la transducción del gen de interés en células de plantas. BiFC es así aplicable para solubles, así como para proteínas de la membrana dentro de todos los compartimentos celulares y ha sido utilizado con éxito en los últimos años para identificar las proteínas que interactúan in vivo, así como para analizar sitios de interaccióndentro de las proteínas ^7-9. Tras la expresión de los genes introducidos, la interacción de las proteínas fluorescentes puede ser visualizada directamente en hojas, que es adecuado para estructuras celulares más grandes, tales como el retículo endoplasmático (ER), la membrana de plasma o cloroplastos. Sin embargo, para supervisar la localización en estructuras más refinadas, por ejemplo, la envoltura del cloroplasto, es aconsejable para visualizar la fluorescencia en protoplastos aislados a partir de hojas de tabaco transformadas. Un conjunto de vectores de BiFC que contienen ya sea un C-terminal o una etiqueta fluorescente N-terminal tiene que ser utilizado para el enfoque BiFC en las plantas ^10. El protocolo se describe más adelante se utilizó para estudiar la interacción de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90) con el tetratricopeptide repetir (TPR) de dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7 que residían en la envoltura exterior del cloroplasto y el retículo endoplásmico, respectivamente ^11-13. Para este propósito, la HSP90 se fusionó a la Ctparte erminal de SCFP (SCFP ^C). La etiqueta era N-terminal fusionado a la chaperona para garantizar la accesibilidad de la C-terminal motivo MEEVD unión de HSP90 para sujetar tipo dominios TPR. En paralelo, la parte N-terminal de Venus (Venus ^N) se fusionó a los dominios citosólicos de la TPR dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7, respectivamente. Como control negativo se clonó la parte C-terminal soluble de SCFP ^C únicamente que reside en el citosol y por lo tanto es un control apropiado.

Las etiquetas fluorescentes de las proteínas estudiadas tienen que enfrentar el mismo compartimento celular para permitir la proximidad y por lo tanto la reconstitución de la señal fluorescente. Para determinar la localización de la señal fluorescente reconstituido una proteína marcador fusionado a una etiqueta fluorescente diferente puede ser cotransformado para demostrar la localización subcelular de la interacción. Una proteína marcador ER fusionado a mCherrry fue transformado simultáneamente en elcaso de la sala de emergencia situada AtTPR7 ^14. La autofluorescencia de la clorofila se desempeñó como marcador de cloroplasto en caso de Toc64. Por esto no sólo la interacción in vivo de Toc64 y AtTPR7, respectivamente, con la chaperona HSP90 citosólica se puede monitorizar directamente en las hojas de tabaco, sino también la localización subcelular de la interacción puede ser investigado.

BiFC Es muy adecuado como un enfoque complementario a otros métodos que estudian las interacciones proteína-proteína. En comparación con coimmunoprecipitation o en experimentos de pull-down in vitro, por ejemplo, no hay anticuerpos específicos tienen que estar disponibles para las proteínas de interés, y las proteínas no tienen que ser expresadas de forma recombinante in vitro, que puede ser un reto, especialmente para las proteínas de membrana. Por otra parte, también interacciones transitorias pueden ser controlados usando BiFC, ya que las proteínas son capturados por la interacción de las etiquetas fluorescentes fusionados ^15.

Protocolo

1. Transformación de BiFC construcciones en las agrobacterias

1. Clonación de construcciones BiFC
   1. Amplificar el gen de interés a partir de una plantilla adecuada utilizando oligonucleótidos que contienen sitios que flanquean attB-. Lleve a cabo una PCR utilizando una corrección de la polimerasa. Adaptar la longitud de la etapa de recocido a la combinación de cebadores diseñado y la longitud de la etapa de elongación de acuerdo con el tamaño del fragmento. Compruebe el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa y purificar mediante el uso de un kit de PCR Clean-Up.
   2. Lleve a cabo la reacción de BP con el fragmento obtenido y el vector de entrada usando una recombinasa BP. Mezclar 15-150 ng del producto attB-PCR con 150 ng del vector de entrada, añadir 2 l de la recombinasa BP y llenar con tampón TE hasta un volumen total de 8 l. Incubar la reacción durante 1 hora a TA y detener la reacción mediante la adición de 2 l de proteinasa K durante 10 min a 37 ° C.
   3. Transformar toda la reacción en E. competente coli DH5a; Células y la pantalla de las colonias obtenidas mediante PCR de colonias para la correcta inserción del fragmento de ADN en el vector. La secuenciación del ADN de los plásmidos positivos se realiza para verificar la ausencia de mutaciones.
   4. Utilice la entrada clon obtenido por LR recombinación con el vector destino apropiado usando una recombinasa LR. Mezclar 50-150 ng del vector de entrada con 150 ng del vector de destino, añadir 1 l LR recombinasa y se llenan con tampón TE a un volumen total de 5 l. Incubar la reacción durante 1 hora a TA y detener la reacción mediante la adición de 1 l de proteinasa K durante 10 min a 37 ° C.
   5. Transformar la reacción completa en células de E. coli DH5a competentes y pantalla de colonias obtenidos mediante PCR de colonias para la correcta inserción del fragmento de ADN en el vector. La secuenciación de ADN no es necesario en este paso.
   6. Aislar el ADN plásmido con un kit de plásmido mini para asegurar un alto grado de pureza.
2. Preparación de agrobacterias químicamente competentes (AGL1 cepa, rifampicina y la resistencia a carbenicilina)
   1. Racha fuera agrobacteria de una cultura de valores y crecer durante 24 horas a 28 ° C.
   2. Inocular 5 ml de medio LB con una sola colonia y se incuba durante la noche a 28 ° C.
   3. Inocular 50 ml de medio LB con 2 ml del cultivo durante la noche y crecer durante aproximadamente 4 horas a 28 ° C a un OD ₆₀₀ de 1,0.
   4. Centrifugar las células a 3000 xg durante 15 min a 4 ° C y resuspender el precipitado en 1 ml esterilizados enfriada con hielo de CaCl ₂ (10 mM). Mantener las células en hielo después de este paso.
   5. Preparar alícuotas (100 l) de las células, congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
3. Transformación de agrobacterias químicamente competente
   1. Descongelar una alícuota de células AGL1 competentes en hielo. Añadir 1-2 g de ADN plásmido a las células. Incubar durante 5 min en hielo, 5 min en nitrógeno líquido y 5 min a 37 ° C. Añadir 600 l de medio LB a las células y smerluza a 650 rpm durante 4 horas a 28 ° C.
   2. Centrifugar las células durante 1 min a 8000 x g y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 50 l de medio LB restante y la placa sobre placas de LB que contenían los antibióticos apropiados. Tapar la placa e incubar durante 2 días a 28 ° C. Colonias de pantalla para la presencia del plásmido mediante PCR de colonias.
   3. Inocular una colonia positiva en 5 ml de medio LB que contenía los antibióticos apropiados y se incuba a 28 ° C durante la noche. Mezclar 500 l de cultivo de una noche con 500 l 50% de glicerol esterilizado y congelar a -80 ° C.
   4. Inocular las agrobacterias en medio LB que contienen los antibióticos apropiados directamente de la solución madre en glicerol para la transformación transitoria de las hojas de tabaco.

2. Transformación Transitoria de hojas de tabaco

1. Agrobacteria crecimiento
   1. Prepare las siguientes soluciones madre: Acetosiringona (150 mM, se disuelve en 70% EtOH), almacenar en alícuotas a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M), pH 5,7, se almacenan a 4 ° C (filtro estéril a través de un filtro de 0,2 M a prevenir el crecimiento de bacterias durante el almacenamiento más largo), MgCl ₂ (1 M) stock, almacenar a temperatura ambiente.
   2. Inocular 10 ml de medio LB que contenía los antibióticos apropiados con 50 l de la glicerol AGL1 de stock de cultivo que contiene el plásmido de interés en un tubo estéril de 50 ml y se incuba a 28 ° C durante al menos 24 horas de agitación a 190 rpm hasta una OD ₆₀₀ entre 1,0 se alcanza -2.0.
   3. Bacterias centrifugar a 3000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento en medio de infiltración recién hecho _[MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, de Acetosiringona (150 M)] y ajustar la suspensión a un OD ₆₀₀ de 1,0.
   4. Se incuban las células Agrobacteria en un agitador de arriba durante 2 horas en la oscuridad. Las células luego se pueden utilizar para la infiltración.
2. La infiltración de hojas de tabaco
   1. Utilice tressemanas de edad del tabaco (Nicotiana benthamiana) plantas. Seleccione varias hojas más viejas de la infiltración.
   2. Mezclar volúmenes iguales de las agrobacterias que transportan los constructos de interés (3 ml cada uno). Tome una jeringa de 5 ml sin aguja para la infiltración. Infiltrarse en la suspensión de células cuidadosamente en las hojas de tabaco pulsando la jeringa en el lado inferior de las hojas en varios lugares.
   3. Riegue las plantas y dejarlos en la oscuridad durante dos días.

3. Preparación de protoplastos

Preparación de protoplastos de hojas de tabaco es una adaptación de Koop et al. ¹⁶ y ligeramente modificado.

1. Preparación Buffer
   1. Preparar medio F-PCN: Macro-sales [KNO ₃ (1,012 g / ml), _CaCl2 • 2H ₂ O (440 mg / ml), _MgSO4 • 7H ₂ O (370 mg / ml), KH ₂ PO ₄ ( 170 mg / ml), NH _4-succinato [(20 mM, preparar una acción de sol 2 Mlución (succinato (236 mg / ml) y NH ₄ Cl (106 mg / ml), se ajustan a pH 5,8 para disolver)], Micro-sales [EDTA-Fe (III) x Na-sal (40 g / ml), KJ (0.75 g / ml), H ₃ BO ₃ (3 g / ml), _MnSO4 • _H2O (10 g / ml), ZnSO ₄ • 7H ₂ O (2 g / ml), Na _{2 Moo 4} • 7H ₂ O (0,25 g / ml), CuSO ₄ • 5H ₂ O (0,025 g / ml), COCl ₂ • 6H ₂ O (0,025 g / ml)], MES (390 mg / ml), glucosa (aproximadamente 80 g / ml) osmolaridad 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Almacenar en alícuotas a -20 ° C.
   2. Preparar medio F-PIN: Todos los ingredientes como F-PCN pero en lugar de sacarosa glucosa uso (aproximadamente 110 g / ml), osmolaridad de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Almacenar en alícuotas a -20 ° C.
   3. Preparar medio W5: NaCl 150 mM, 125 mM de _CaCl2, 5 mM de KCl, 2 mM de MES, osmolaridad 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Almacenar a 4 °; C (filtro estéril a través de un filtro de 0,2 micras para prevenir el crecimiento de bacterias durante el almacenamiento más largo).
   4. Preparar la solución de enzima fresco para el aislamiento de protoplastos (0,1 g celulasa, 0,03 g macerozym en 10 ml de F-PIN). Se incuba la solución a 55 ° C durante 10 min y enfriar a ta. Añadir 100 l de 10% de BSA a 10 ml de solución.
2. Aislamiento de protoplastos
   1. Coloque una hoja de infiltrado en una placa de Petri y la solución de enzima fresco. Utilice una nueva hoja de afeitar para cortar la hoja en aproximadamente 0,5 cm ² piezas de tamaño. Transfiera los hoja-piezas con la solución de la enzima en un matraz infiltración al vacío y el vacío se infiltran por aproximadamente 20 segundos hasta que las burbujas de aire salen de las hojas (vacío liberación con mucho cuidado).
   2. Agitar el matraz durante 90 minutos a 40 rpm en la oscuridad.
   3. Soltar protoplastos por agitación durante 1 min a 90 rpm. Filtrar la solución a través de una gasa (100 M) en un tubo de centrifugación de 15 ml (fondo redondo).
   4. Superposición de la solución de protoplastos con 2 ml de tampón F-PCN y centrifugar durante 10 min a 70 x g (aceleración y deceleración lenta) a TA.
   5. Protoplastos intactos se acumulan en la interfase de la solución de enzima y F-PCN. Tome una punta ancha orificio de 1 ml pipeta para transferir los protoplastos intactos en un tubo de centrífuga fresco y rellenar con tampón W5. Centrifugar durante 2 min a 100 x g (aceleración y deceleración lenta) para sedimentar los protoplastos.
   6. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta y Resuspender el sedimento en aproximadamente 200 l de tampón W5, dependiendo de la cantidad de protoplastos.
   7. Utilice siempre puntas de los orificios de ancho para evitar ruptura de protoplastos intactos.

4. Laser Scanning Microscopy

1. Preparación de la muestra
   1. Pegue dos pequeñas tiras de sellador alrededor de un portaobjetos de microscopio (2 cm de distancia). Ponga 20 l de la solución de protoplastos entre las tiras y colocar cuidadosamente una cubierta de vidrioen la parte superior. Las tiras de sellador se aseguran de que los protoplastos no son aplastadas por la cubierta de vidrio.
   2. Para el total de muestras de hojas cortan una pieza de 1 cm de la hoja y la colocan en un portaobjetos de microscopio con el lado inferior de la hoja hacia arriba. Añadir aproximadamente 30 l H ₂ O, coloque una cubierta de cristal en la parte superior y fijarla firmemente con cinta adhesiva por ambos lados.
2. Ajustes de imagen y microscopio confocal
   1. Formación de imágenes se realizó con un microscopio de barrido láser confocal de Leica, Tipo: TCS SP5. Para ampliación utilizar una lente de objetivo (HCX PL APO CS) con una magnitud de 63X con glicerol como medio de formación de imágenes. Ajuste la apertura numérica de 1,3. Utilice el software Leica Application Suite / Advanced fluorescencia para la evaluación (ver Datos Suplementarios S1).
   2. Ajuste el láser de argón a 30% y la potencia del láser a 488 nm y una intensidad del 18% para monitorizar la señal BiFC reconstituido a 515 nm y establecer un ancho de banda de emisión detector PMT 495-550.
   3. Para supervisar la autofluorescencia clorofila estableció un segundo de ancho de banda de emisión detector PMT 650-705.
   4. Para monitorizar la señal mCherry utilizar el láser de He-Ne 561, ajuste la intensidad de láser de 561 a 18%, y el ancho de banda de la emisión de un tercer detector PMT 587-610.
   5. Asegúrese de que las imágenes de todos los canales del detector PMT se toman con la misma configuración de ganancia (ganancia debe estar entre 800-900 para excluir las señales de fondo).
   6. Hacer fotos en un formato de ancho / altura de 1024 x 1024 píxeles con una velocidad de barrido de 100 Hz.
   7. Para Z-apilamientos utilizan una distancia máxima de 0,5 m entre cada pila.

Resultados

En este ejemplo se utilizó el método BiFC para supervisar la interacción de la HSP90 citosólica chaperona molecular con las proteínas de unión a las membranas AtTPR7 y Toc64. AtTPR7 es parte de la translocón Sec y interactúa con chaperonas citosólicas, que posiblemente entregan preproteínas secretora para la translocación post-traducción a la membrana del RE. Del mismo modo, Toc64 en el sobre exterior cloroplasto actúa en la importación después de la traducción mediante la recepción de HSP90 preproteín...

Discusión

Después de la planificación de un experimento BiFC deben considerarse varios puntos. Aunque no se requiere ninguna información estructural de las proteínas de interés, la topología tiene que ser conocido cuando se trabaja con proteínas de membrana que abarca. Las proteínas fluorescentes tienen que residir en el mismo compartimento subcelular o enfrentar el mismo lado de una membrana para permitir la interacción. Naturalmente, cuando el análisis de proteínas que requieren una secuencia de orientación N-termin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning