Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Résumé

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Résumé

De nombreuses protéines interagissent avec d'autres protéines de façon transitoire ou sont intégrés dans des complexes multi-protéiques de remplir leur fonction biologique. Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est une méthode in vivo de surveiller ces interactions dans les cellules végétales. Dans le protocole présenté les protéines candidates sont fusionnées à l'enquête moitiés complémentaires de protéines fluorescentes et les produits d'assemblage respectifs sont introduits dans des cellules végétales par transformation médiée par Agrobacterium. Par la suite, les protéines sont exprimées de manière transitoire dans les feuilles de tabac et les signaux fluorescents restaurées peuvent être détectés avec un microscope confocal à balayage laser dans les cellules intactes. Ceci permet non seulement la visualisation de l'interaction elle-même, mais aussi la localisation subcellulaire des complexes de protéines peut être déterminée. A cet effet, des gènes marqueurs contenant un marqueur fluorescent peuvent être co-exprimés avec les constructions BiFC, visualisant ainsi des structures cellulaires telles que la til reticulum endoplasmique, les mitochondries, l'appareil de Golgi ou la membrane plasmique. Le signal de fluorescence peut être contrôlée soit directement dans les cellules épidermiques des feuilles ou dans des protoplastes isolés, qui peuvent être facilement isolés à partir des feuilles de tabac transformées. BiFC est idéal pour étudier les interactions protéine-protéine dans leur milieu naturel au sein de la cellule vivante. Cependant, il doit être considéré que l'expression doit être entraînée par des promoteurs forts et que les partenaires d'interaction sont modifiées en raison de la fusion des balises relativement importantes de fluorescence, qui pourraient interférer avec le mécanisme d'interaction. Néanmoins, BiFC est une excellente approche complémentaire à d'autres méthodes couramment appliquées enquête interactions protéine-protéine, comme coimmunoprécipitation, essais in vitro déroulants ou des expériences de levure double hybride.

Introduction

L'étude de la formation de complexes de protéines et de leur localisation dans les cellules végétales in vivo est essentielle pour étudier les réseaux cellulaires, de signalisation et les processus métaboliques. BiFC permet la visualisation des interactions protéine-protéine dans leur environnement naturel directement à l'intérieur de la cellule de plante vivante ^1-5.

Dans le BiFC approcher la complémentation de deux fragments N-et C-terminaux d'une protéine non fluorescentes plomb fluorescent pour une protéine fluorescente reconstitué. Des fragments de nombreuses protéines fluorescentes différentes ont été utilisées pour détecter les interactions entre protéines, par exemple la protéine fluorescente verte (GFP) de la chromophore qui est chimiquement formée par trois résidus distincts ^6. Les protéines fluorescentes peuvent être réduites de moitié dans une boucle ou ß-brin pour donner les deux fragments non fluorescentes qui peuvent être fusionnés aux deux protéines d'intérêt. Le dosage peut être utilisé pour détecter des interactions dans toute compartme subcellulairent dans un organisme ou des cellules en croissance en milieu aérobie qui peut être génétiquement modifiée pour exprimer les protéines de fusion. Si les deux protéines sont en proximité étroite à l'intérieur de la cellule, la fluorescence est reconstitué et peut être surveillée par microscopie sans addition de fluorophores exogènes ou des colorants ^3.

Le tabac (Nicotiana benthamiana) s'est avéré être un organisme modèle commode pour visualiser l'interaction des protéines de plantes, étant donné que les protéines peuvent facilement être exprimées en utilisant une transformation médiée par Agrobacterium de feuilles de tabac avec les constructions générées. Agrobactéries utilisent un plasmide Ti dite (tumeur induisant) codant pour des enzymes qui interviennent dans la transduction du gène d'intérêt dans des cellules végétales. BiFC est bien applicable pour solubles ainsi que pour les protéines de la membrane au sein de tous les compartiments cellulaires et a été utilisé avec succès au cours des dernières années pour identifier des protéines qui interagissent in vivo, ainsi que pour analyser les sites d'interactiondans les protéines ^7-9. Lors de l'expression des gènes introduits, l'interaction des protéines fluorescentes peuvent être visualisées directement en feuille, qui est approprié pour des structures cellulaires plus gros, tels que le reticulum endoplasmique (ER), la membrane plasmatique ou les chloroplastes. Toutefois, pour contrôler la localisation dans des structures plus fines, par exemple, l'enveloppe des chloroplastes, il est souhaitable de visualiser la fluorescence dans des protoplastes isolés à partir de feuilles de tabac transformées. Un ensemble de vecteurs BiFC contenant soit un C-terminal ou un marqueur fluorescent N-terminale doit être utilisée pour l'approche BiFC dans des plantes ^10. Le protocole décrit de la suite a été utilisé pour étudier l'interaction de cytosolique protéine de choc thermique 90 (HSP90) avec la répétition de tetratricopeptide (TPR) de domaine contenant des protéines d'amarrage Toc64 et AtTPR7 résidant dans l'enveloppe extérieure du chloroplaste et le réticulum endoplasmique, respectivement ^11-13. A cet effet, HSP90 a été fusionné à la Ctpartie de erminal SCFP (SCFP ^C). La balise était N-terminale fusionnée à la protéine chaperon pour assurer l'accessibilité du motif C-terminal MEEVD liaison de HSP90 pour serrer de type domaines TPR. En parallèle, la partie N-terminale de Vénus (Venus ^N) a été fusionné aux domaines cytosoliques du domaine TPR contenant des protéines d'amarrage Toc64 et AtTPR7, respectivement. Comme témoin négatif nous avons cloné la partie C-terminale soluble SCFP ^C uniquement qui réside dans le cytosol et est donc un contrôle approprié.

Les marqueurs fluorescents de protéines étudiées doivent faire face à la même compartiment cellulaire pour permettre proximité et ainsi la reconstitution du signal fluorescent. Pour déterminer la localisation du signal fluorescent reconstitué une protéine marqueur fusionnée à une étiquette fluorescente différente peut être co-transformée à démontrer la localisation subcellulaire de l'interaction. Une protéine servant de marqueur ER fusionnée à mCherrry a été transformé simultanément à l'cas de l'ER situé AtTPR7 ^14. L'auto-fluorescence de la chlorophylle a servi de marqueur chloroplaste en cas de Toc64. Par cela, non seulement l'interaction in vivo de Toc64 AtTPR7 et, respectivement, avec le chaperon HSP90 cytosolique peut être surveillée directement dans les feuilles de tabac, mais aussi la localisation subcellulaire de l'interaction peut être étudiée.

BiFC est bien adapté comme une approche complémentaire à d'autres méthodes qui étudient les interactions protéine-protéine. Par rapport aux co-immunoprécipitation ou in vitro des expériences d'excursion basse, par exemple, pas d'anticorps spécifiques doivent être disponibles pour des protéines d'intérêt, et les protéines n'ont pas à être exprimé par recombinaison in vitro, ce qui peut être difficile, en particulier pour les protéines de la membrane. De plus, aussi les interactions transitoires peuvent être surveillés à l'aide BiFC, étant donné que les protéines sont capturées par l'interaction des marqueurs fluorescents fusionnées ^15.

Protocole

Une. Transformation de BiFC Construit en Agrobacteria

1. Le clonage de constructions BiFC
   1. Amplifier le gène d'intérêt à partir d'un modèle approprié, en utilisant des oligonucleotides contenant des sites attB encadrant. Effectuez une PCR en utilisant une polymérase de relecture. Adapter la longueur de l'étape de recuit de la combinaison d'amorces conçues et la durée de l'étape d'élongation en fonction de la taille des fragments. Vérifier le produit de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose et le purifier en utilisant une PCR Clean-up Kit.
   2. Effectuer la réaction BP avec le fragment obtenu et le vecteur d'entrée en utilisant une recombinase BP. Mélanger de 15 à 150 ng du produit attB-PCR avec 150 ng du vecteur d'entrée, ajouter 2 ul de la recombinase BP et remplir avec du tampon TE jusqu'à un volume total de 8 ul. Incuber le mélange réactionnel pendant 1 heure à température ambiante et arrêter la réaction en ajoutant 2 ul de proteinase K pendant 10 min à 37 ° C.
   3. Transformer la totalité de la réaction dans E. compétente coli DH5a; Cellules et écran des colonies obtenues par PCR sur colonie pour l'insertion correcte du fragment d'ADN dans le vecteur. Le séquençage d'ADN des plasmides positifs est effectué pour vérifier l'absence de mutations.
   4. Utiliser l'entrée clone obtenu pour la recombinaison LR avec le vecteur de destination appropriée en utilisant une recombinase de LR. Mélanger 50-150 ng du vecteur d'entrée avec 150 ng du vecteur de destination, ajouter 1 pl LR recombinase et remplir avec du tampon TE à un volume total de 5 pi. Incuber le mélange réactionnel pendant 1 heure à température ambiante et arrêter la réaction en ajoutant 1 ul de proteinase K pendant 10 min à 37 ° C.
   5. Transformer la totalité de la réaction dans des cellules de E. coli DH5a compétentes et écran colonies obtenues par PCR sur colonie pour l'insertion correcte du fragment d'ADN dans le vecteur. séquençage de l'ADN n'est pas nécessaire à cette étape.
   6. Isoler l'ADN plasmidique avec un kit plasmide Mini pour assurer un haut degré de pureté.
2. Préparation d'agrobactéries compétentes chimiquement (souche AGL1, la rifampicine et la résistance Carbénicilline)
   1. Streak sur agrobactéries d'une culture de valeurs et se développent pendant 24 heures à 28 ° C.
   2. Inoculer 5 ml de milieu LB avec une colonie unique et incuber pendant une nuit à 28 ° C.
   3. Inoculer 50 ml de milieu LB avec 2 ml de la culture d'une nuit et croître pendant environ 4 heures à 28 ° C jusqu'à une DO ₆₀₀ de 1,0.
   4. Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 15 min à 4 ° C et remettre en suspension le culot dans 1 ml stérilisées glacée _CaCl2 (10 mM). Gardez les cellules sur la glace après cette étape.
   5. Préparer des aliquotes (100 pi) des cellules, geler immédiatement dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.
3. Transformation des agrobactéries chimiquement compétente
   1. Décongeler une aliquote de cellules AGL1 compétentes sur la glace. Ajouter 1-2 ug d'ADN de plasmide dans les cellules. Incuber pendant 5 min sur de la glace, 5 min dans de l'azote liquide et 5 min à 37 ° C. Ajouter 600 ul de milieu LB pour les cellules et les smerlu à 650 tours par minute pendant 4 heures à 28 ° C.
   2. Centrifuger les cellules pendant 1 min à 8000 xg et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 50 ul de milieu LB et restant plaque sur des plaques LB contenant les antibiotiques appropriés. Sceller les plaques et incuber pendant 2 jours à 28 ° C. colonies d'écran pour la présence du plasmide par PCR sur colonie.
   3. Inoculer une colonie positive dans 5 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés et incuber à 28 ° C pendant une nuit. Mélanger 500 ul de la culture d'une nuit avec 500 ul de glycerol à 50% stérile et congeler à -80 ° C.
   4. Inoculer les agrobactéries en milieu LB contenant les antibiotiques appropriés directement du stock de glycérol pour la transformation transitoire de feuilles de tabac.

2. Transformation transitoire de feuilles de tabac

1. Agrobacteria croissance
   1. Préparer les solutions mères suivantes: Acétosyringone (150 mM, dissoudre dans 70% EtOH), magasin sous forme d'aliquotes à -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, conserver à 4 ° C (filtre stérile à travers un filtre de 0,2 um pour prévenir la croissance bactérienne pendant plus de stockage), MgCl ₂ (1 M) stock, magasin à la température ambiante.
   2. Inoculer 10 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés avec 50 pl de la AGL1 stock de glycérol culture contenant le plasmide d'intérêt dans un tube de 50 ml stérile et incuber à 28 ° C pendant au moins 24 heures sous agitation à 190 tours par minute jusqu'à une DO ₆₀₀ de 1,0 -2,0 est atteinte.
   3. bactéries à centrifuger à 3000 g pendant 15 min. Reprendre le culot dans fraîchement moyen d'infiltration _[MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, Acétosyringone (150 M)] et ajuster la suspension à une DO ₆₀₀ de 1,0.
   4. Incuber les cellules agrobactéries dans un agitateur de tête pendant 2 heures dans l'obscurité. Les cellules peuvent ensuite être utilisés pour l'infiltration.
2. L'infiltration des feuilles de tabac
   1. Utilisez troissemaine vieux tabac (Nicotiana benthamiana) plantes. Choisissez plusieurs feuilles les plus âgées d'infiltration.
   2. Mélanger des volumes égaux des agrobactéries portant les constructions d'intérêt (3 ml chacun). Prendre une seringue de 5 ml sans aiguille pour l'infiltration. Infiltrer la suspension de cellules avec précaution dans les feuilles de tabac en appuyant sur la seringue sur la face inférieure des feuilles à plusieurs endroits.
   3. Arrosez les plantes et les laisser dans l'obscurité pendant deux jours.

3. Préparation de protoplastes

Préparation de protoplastes de feuilles de tabac a été adapté à partir de Koop et al. ¹⁶ et légèrement modifié.

1. préparation de tampon
   1. Préparer milieu F-PCN: Macro-sels [KNO ₃ (1012 pg / ml), CaCl ₂ • 2H ₂ O (440 pg / ml), MgSO ₄ 7H ₂ O • (370 pg / ml), KH ₂ PO ₄ ( 170 pg / ml), NH _4-succinate [(20 mM; préparer un 2 m stock solution (succinate (236 ug / ml) et NH ₄ Cl (106 ug / ml), ajuster le pH à 5,8 pour dissoudre)], les micro-sels [EDTA-Fe (III) x sel de Na (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H ₃ BO ₃ (3 pg / ml), MnSO ₄ • H ₂ O (10 pg / ml), ZnSO ₄ • 7H ₂ O (2 pg / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 ug / ml), CuSO ₄ • 5H ₂ O (0,025 pg / ml), CoCl ₂ • 6H ₂ O (0,025 g / ml)], MES (390 ug / ml), du glucose (environ 80 pg / ml) osmolarité de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Magasin à -20 ° C.
   2. Préparer le milieu F-PIN: tous les ingrédients du F-PCN, mais au lieu d'utiliser le glucose du saccharose (environ 110 pg / ml), l'osmolarité de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Magasin à -20 ° C.
   3. Préparer milieu W5: NaCl 150 mM, 125 mM CaCl _2, 5 mM de KCl, 2 mM MES, osmolarité 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Conserver à 4 °; C (filtre stérile à travers un filtre de 0,2 um à prévenir la croissance bactérienne pendant plus de stockage).
   4. Préparer une solution fraîche d'enzymes pour l'isolement de protoplastes (0,1 g de cellulase, 0,03 g dans 10 ml macerozym F-PIN). Incuber la solution à 55 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 100 ul de 10% de SAB à 10 ml de solution.
2. Isolement de protoplastes
   1. Placez une feuille infiltré dans une boîte de Pétri et ajouter la solution d'enzyme fraîche. Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour couper la feuille en environ 0,5 cm ² morceaux. Transférer les feuilles-pièces avec la solution d'enzyme dans un flacon sous vide et l'infiltration sous vide s'infiltrer pendant environ 20 secondes jusqu'à ce que des bulles d'air se dégagent à partir des feuilles (aspirateur de libération très attentivement).
   2. Agiter le flacon pendant 90 min à 40 min dans l'obscurité.
   3. Relâchez protoplastes par agitation pendant 1 min à 90 min. Filtrer la solution à travers de la gaze (100 pM) dans un tube à centrifugation de 15 ml (à fond rond).
   4. Superposer la solution de protoplastes avec 2 ml de tampon F-PCN et centrifuger pendant 10 min à 70 xg (accélération et de décélération lente) à température ambiante.
   5. Protoplastes intacts s'accumulent à l'interface de la solution d'enzyme et de F-PCN. Prenez un large orifice 1 pointe ml de pipette pour transférer les protoplastes intacts dans un tube de centrifugeuse frais et remplir avec du tampon W5. Centrifuger pendant 2 min à 100 xg (accélération et décélération lente) pour sédimenter les protoplastes.
   6. Retirer le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette et remettre en suspension le culot dans environ 200 ul de tampon de W5, en fonction de la quantité de protoplastes.
   7. Toujours utiliser des embouts d'orifice large pour éviter la rupture de protoplastes intacts.

4. Balayage laser

1. Préparation de l'échantillon
   1. Coller deux petites bandes de mastic autour d'une lame de microscope (2 cm d'intervalle). Placer 20 ul de la solution de protoplastes entre les bandes et placer soigneusement un couvercle en verresur le dessus. Les bandes d'étanchéité assurez-vous que les protoplastes ne sont pas écrasés par le couvercle en verre.
   2. Pour les échantillons de feuilles découpées au total un morceau de 1 cm de la feuille et le placer sur une lame de microscope avec le côté inférieur de la feuille tournée vers le haut. Ajouter environ 30 pi H ₂ O, placer un couvercle en verre sur le dessus et le fixer solidement avec du ruban adhésif sur les deux côtés.
2. Paramètres d'imagerie et microscope confocal
   1. L'imagerie est réalisée avec un microscope confocal à balayage laser microscope de Leica, Type: TCS SP5. Pour grossissement utiliser un objectif (HCX PL APO CS) d'une magnitude de 63X avec le glycérol comme moyen d'imagerie. Réglez l'ouverture numérique de 1.3. Utilisez le logiciel Leica Application Suite / avancée de fluorescence pour l'évaluation (voir données supplémentaires S1).
   2. Réglez le laser argon à 30% et la puissance du laser à 488 nm à une intensité de 18% pour surveiller le signal BiFC reconstitué à 515 nm et définir un débit d'émission de détecteur de PMT 495-550.
   3. Pour surveiller la chlorophylle autofluorescence mis une seconde bande passante d'émission de détecteur de PMT 650-705.
   4. Pour surveiller le signal mCherry utiliser le laser HeNe 561, régler l'intensité de laser de 561 à 18% et la largeur de bande d'émission d'un troisième détecteur de PMT 587-610.
   5. Assurez-vous que les photos de tous les canaux de détection PMT sont prises avec les mêmes réglages de gain (gain doit être compris entre 800-900 à exclure les signaux de fond).
   6. Prenez des photos dans un format largeur / hauteur de 1024 x 1024 pixels avec une vitesse de balayage de 100 Hz.
   7. Pour Z-empilements utilisent une distance maximale de 0,5 um entre chaque pile.

Résultats

Dans cet exemple, nous avons utilisé la méthode BiFC pour surveiller l'interaction entre le chaperon moléculaire de HSP90 cytosolique des protéines membranaires amarrage AtTPR7 et Toc64. AtTPR7 fait partie du translocon Sec et interagit avec les chaperons cytosoliques, qui délivrent éventuellement préprotéines sécrétoires pour la translocation post-traductionnelle de la membrane du RE. De même, Toc64 à l'enveloppe extérieure chloroplaste agit dans l'importation post-traductionnelle en recevant H...

Discussion

Lors de la planification d'une expérience BiFC plusieurs points doivent être considérés. Bien qu'aucune information structurale sur les protéines d'intérêt est requise, la topologie doit être connu lorsque l'on travaille avec des protéines de la membrane couvrant. Les protéines fluorescentes doivent se trouver dans le même compartiment sous-cellulaire ou orientés dans le même côté d'une membrane pour permettre l'interaction. Naturellement, lorsque l'on analyse les protéines qu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning