Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Resumo

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Resumo

Muitas proteínas interagir transientemente com outras proteínas ou são integrados em complexos multi-proteína para desempenhar a sua função biológica. Complementação fluorescência bimolecular (BiFC) é um método in vivo para monitorizar estas interacções em células vegetais. No protocolo apresentou as proteínas candidatas investigados são fundidas com as metades complementares de proteínas fluorescentes e as respectivas construções são introduzidas em células de plantas por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Subsequentemente, as proteínas são expressas transitoriamente em folhas de tabaco e os sinais fluorescentes restaurado pode ser detectada com um microscópio confocal de varrimento laser nas células intactas. Isto permite não só a visualização da própria interacção, mas também a localização subcelular dos complexos de proteína pode ser determinada. Para esta finalidade, genes marcadores que contêm um marcador fluorescente pode ser co-expresso juntamente com as construções BIFC, visualizando, assim, estruturas celulares, tais como tele retículo endoplasmático, mitocôndria, o aparelho de Golgi ou na membrana plasmática. O sinal fluorescente pode ser monitorada, quer directamente na epiderme foliar ou em protoplastos individuais, que podem ser facilmente isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. BiFC é ideal para estudar as interações proteína-proteína em seu ambiente natural dentro da célula viva. No entanto, isso tem de ser considerado que a expressão tem de ser accionada por promotores fortes e que os parceiros de interacção são modificadas devido à fusão das marcações de fluorescência relativamente grandes, o que pode interferir com o mecanismo de interacção. No entanto, BiFC é uma abordagem complementar excelente para outros métodos vulgarmente utilizados para investigação de interacções proteína-proteína, tais como coimmunoprecipitation, os ensaios in vitro suspensos ou experiências de levedura de dois híbridos.

Introdução

Estudando a formação de complexos de proteínas e a sua localização em células de plantas in vivo é essencial para investigar redes celulares, a sinalização e os processos metabólicos. BiFC permite a visualização de interações proteína-proteína em seu ambiente natural diretamente dentro da célula vegetal vida ^1-5.

No BiFC aproximar a complementação de dois fragmentos N-e C-terminais não fluorescentes de uma ligação de proteína fluorescente para uma proteína fluorescente reconstituído. Fragmentos de muitas proteínas fluorescentes diferentes têm sido utilizados para detectar interacções de proteínas, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP), o cromóforo de que é quimicamente formado por três resíduos distintas ^6. As proteínas fluorescentes pode ser reduzido para metade dentro de um loop ou ß-fio para resultar nos dois fragmentos não fluorescentes, que podem ser fundidos para ambas as proteínas de interesse. O ensaio pode ser utilizado para detectar interacções, em qualquer compartme subcelularnt em qualquer organismo cresce aerobicamente ou células que podem ser geneticamente modificados para expressar as proteínas de fusão. Se as duas proteínas de entrar em estreita proximidade no interior da célula, a fluorescência é reconstituído e pode ser monitorizada por microscopia, sem a adição de corantes ou fluoróforos exógenos ^3.

Tabaco (Nicotiana benthamiana) provou ser um organismo modelo conveniente para visualizar a interacção de proteínas de plantas, uma vez que as proteínas podem ser facilmente expressas utilizando a transformação mediada por Agrobacterium de folhas de tabaco com as construções gerados. Agrobacterium usar um assim chamado plasmídeo Ti (indução de tumores) que codificam para as enzimas que medeiam a transdução do gene de interesse em células de plantas. BiFC é também aplicável para a solúvel, bem como para as proteínas de membrana dentro de todos os compartimentos celulares e tem sido utilizado com êxito nos últimos anos para identificar proteínas que interagem in vivo, bem como para analisar os sítios de interacçãodentro das proteínas ^7-9. Após a expressão dos genes introduzidos, a interacção das proteínas fluorescentes podem ser visualizados directamente nas folhas, o que é adequado para estruturas celulares maiores, tais como o retículo endoplasmático (ER), a membrana plasmática ou cloroplastos. No entanto, para controlar a localização de estruturas mais refinados, por exemplo, o invólucro do cloroplasto, é aconselhável para visualizar fluorescência em protoplastos isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. Um conjunto de vectores BIFC contendo quer um C-terminal ou uma etiqueta fluorescente do terminal-N tem que ser utilizado para a abordagem BiFC em plantas ^10. O protocolo descrito a seguir foi usado para estudar a interação de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90), com o tetratricopeptide repetição (TPR) de domínio que contém proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7 que residem no envelope exterior cloroplastos e retículo endoplasmático, respectivamente ^11-13. Para esta finalidade, a HSP90 foi fundido com o Ctparte erminal de SCFP (SCFP ^C). A marca foi N-terminal fundido com a chaperona para garantir a acessibilidade do motivo C-terminal de ligação MEEVD de HSP90 a braçadeira do tipo com domínios TPR. Em paralelo, a parte N-terminal de Vênus (Venus ^N) foi fundido com os domínios citosólicos do domínio TPR contendo proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7, respectivamente. Como um controlo negativo, clonado a parte C-terminal solúvel de SCFP ^C unicamente que reside no citossol e é, por conseguinte, um controlo apropriado.

As marcas fluorescentes das proteínas estudadas têm que enfrentar o mesmo compartimento celular para permitir a proximidade e, assim, a reconstituição do sinal fluorescente. Para determinar a localização do sinal de fluorescência de uma proteína marcador reconstituído fundido com uma etiqueta fluorescente diferente podem ser co-transformados para demonstrar a localização subcelular da interacção. Uma proteína marcadora ER fundido com mCherrry foi transformada simultaneamente nocaso do PS localizado AtTPR7 ^14. A autofluorescência de clorofila serviu como marcador de cloroplasto em caso de Toc64. Por isso, não só a interacção in vivo da Toc64 AtTPR7 e, respectivamente, com o acompanhante citosólico HSP90 pode ser monitorizada directamente nas folhas de tabaco, mas também a localização subcelular da interacção pode ser investigada.

BiFC é bem adequado como uma abordagem complementar a outros métodos que estudam as interações proteína-proteína. Comparado com coimmunoprecipitation ou em experiências de pull-down in vitro, por exemplo, não há anticorpos específicos têm de estar disponíveis para as proteínas de interesse, e as proteínas não tem que ser expresso de forma recombinante, in vitro, que pode ser um desafio, em especial para as proteínas de membrana. Além disso, também as interacções transiente pode ser monitorizada utilizando BiFC, uma vez que as proteínas são capturadas pela interacção dos marcadores fluorescentes com fusíveis ^15.

Protocolo

1. Transformação de BiFC Constrói em Agrobacteria

1. Clonagem das construções BIFC
   1. Amplificar o gene de interesse a partir de um molde adequado, utilizando os oligonucleótidos que contêm locais attB que flanqueiam-. Realize uma PCR utilizando uma polimerase de revisão. Adaptar o comprimento do passo de recozimento para a combinação de iniciadores concebidos e o comprimento do passo de alongamento de acordo com o tamanho do fragmento. Verifique o produto de PCR por electroforese em gel de agarose e purificá-lo por meio de um kit de PCR Clean-up.
   2. Realizar a reação BP com o fragmento obtido eo vetor de entrada usando uma recombinase BP. Misturar 15-150 ng de produto attB-PCR com 150 ng do vector de entrada, adicionar 2 mL da recombinase BP e encher-se com tampão TE para um volume total de 8 mL. Incubar a reacção durante 1 hora à temperatura ambiente e parar a reacção pela adição de 2 ul de proteinase K durante 10 minutos a 37 ° C.
   3. Transformar toda a reacção em E. competente coli DH5ct, Células e triagem das colônias obtidas por colônia PCR para a correta inserção do fragmento de DNA no vetor. A sequenciação de ADN de plasmídeos positivos é realizada para verificar a ausência de mutações.
   4. Use o clone entrada obtido para recombinação LR com o vetor destino adequado usando uma recombinase LR. Misturar 50-150 ng do vector de entrada, com 150 ng do vector de destino, adicionar 1 ul LR recombinase e encher-se com tampão TE para um volume total de 5 mL. Incubar a reacção de 1 hora à temperatura ambiente e parar a reacção pela adição de 1 ul de proteinase K durante 10 minutos a 37 ° C.
   5. Transformar toda a reacção em células de E. coli DH5a competentes e as colónias obtidas tela por colónia de PCR para a correcta inserção do fragmento de ADN no vector. A sequenciação de ADN não é necessária para esta etapa.
   6. Isolar DNA de plasmídeo com um kit de plasmídeo mini para assegurar um elevado grau de pureza.
2. Preparação de Agrobacterium quimicamente competentes (AGL1 tensão, Rifampicina e resistência Carbenicilina)
   1. Streak fora Agrobacterium de uma cultura estoque e crescer por 24 horas a 28 ° C.
   2. Inocular 5 ml de meio LB com uma única colónia e incubar durante a noite a 28 ° C.
   3. Inocular 50 ml de meio LB com 2 ml da cultura durante a noite e crescer durante cerca de 4 horas a 28 ° C até um _OD600 de 1,0.
   4. Centrifugar as células a 3000 xg durante 15 min a 4 ° C e ressuspender o pellet em 1 ml esterilizados gelada de _CaCl2 (10 mM). Manter as células em gelo, após este passo.
   5. Preparar alíquotas (100 L) de células, congelar imediatamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.
3. A transformação de Agrobacterium quimicamente competente
   1. Descongele uma alíquota de células AGL1 competentes no gelo. Adicionar 1-2 ug de ADN de plasmídeo para as células. Incubar durante 5 min em gelo, de 5 min, em azoto líquido e 5 min a 37 ° C. Adicionar 600 ul de meio LB para as células e spescada a 650 rpm durante 4 h a 28 ° C.
   2. Centrifugar as células durante 1 min a 8000 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 50 mL de meio de LB e restante placa em placas de LB contendo os antibióticos apropriados. Selar as placas e incubar durante 2 dias a 28 ° C. Colônias de tela para a presença do plasmídeo por colônia PCR.
   3. Inocule uma colónia positiva, em 5 ml de meio LB contendo os antibióticos adequados e incubar a 28 ° C durante a noite. Misturar 500 mL da cultura durante a noite com 500 ul de glicerol a 50% esterilizada e congelar a -80 ° C.
   4. Inocular o Agrobacterium em meio LB contendo os antibióticos apropriados diretamente a partir do estoque de glicerol para a transformação transitória de folhas de tabaco.

2. Transformação transiente de folhas de tabaco

1. Agrobacteria crescimento
   1. Preparar as seguintes soluções de reserva: acetosiringona (150 mM, dissolvem-se em 70% De EtOH), armazenada como alíquotas a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, armazenar a 4 ° C (filtro estéril através de um filtro de 0,2 | iM para prevenir o crescimento bacteriano durante o tempo de armazenamento), _MgCl2 (1 M) estoque, armazenar à temperatura ambiente.
   2. Inocular 10 ml de meio LB contendo os antibióticos adequados com 50 ul da cultura de reserva AGL1 glicerol contendo o plasmídeo de interesse em um tubo de 50 ml estéril e incubar a 28 ° C durante pelo menos 24 horas com agitação a 190 rpm até uma OD ₆₀₀ entre 1,0 -2.0 é atingido.
   3. Bactérias centrifugar a 3.000 g durante 15 min. Ressuspender o sedimento em meio de infiltração fez recém _[MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, acetossiringona (150 ^ M)] e ajustar a suspensão para uma DO ₆₀₀ de 1,0.
   4. Incubar as células Agrobacterium em um agitador vertical por 2 horas na escuridão. As células podem então ser utilizadas para a infiltração.
2. Infiltração de folhas de tabaco
   1. Use trêssemana de tabaco velho (Nicotiana benthamiana) plantas. Escolha várias folhas mais velhas para a infiltração.
   2. Mistura de volumes iguais de os Agrobacteria que transportam as construções de interesse (3 ml cada). Dê uma seringa de 5 ml sem agulha para a infiltração. Infiltrar-se na suspensão de células cuidadosamente as folhas de tabaco, pressionando a seringa no lado inferior das folhas em vários lugares.
   3. Regue as plantas e deixá-los no escuro por dois dias.

3. Preparação de protoplastos

Preparação de protoplastos de folhas de tabaco foi adaptado de Koop et al. ¹⁶ e ligeiramente modificada.

1. Preparação de buffer
   1. Prepare meio F-PCN: Macro-sais [KNO ₃ (1012 ug / ml), _CaCl2 • 2H ₂ O (440 ug / ml), MgSO ₄ 7H ₂ O • (370 ug / mL), KH ₂ PO ₄ ( 170 ug / ml), NH _4-succinato de [(20 mM; preparar um sol de estoque 2 Mbuição (succinato (236 ug / ml) e NH ₄ Cl (106 ng / mL), ajustado a pH 5,8 para dissolver)], Micro-sais [EDTA-Fe (III) x Na-sal (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H ₃ BO ₃ (3 ug / ml), _MnSO4 • _H2O (10 ug / ml), _ZnSO4 • 7H ₂ O (2 ug / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 ug / ml), _CuSO4 • 5H ₂ O (0,025 g / ml), _CoCl2 • 6H ₂ O (0,025 g / ml)], MES (390 ug / ml), glucose (cerca de 80 ug / ml) osmolaridade de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Loja em alíquotas a -20 ° C.
   2. Prepare meio F-PIN: Todos os ingredientes tal como F-PCN mas em vez de sacarose glicose utilização (cerca de 110 ug / ml), a osmolaridade de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Loja em alíquotas a -20 ° C.
   3. Prepare meio W5: 150 mM de NaCl, 125 mM _CaCl2, 5 mM de KCl, 2 mM de MES, osmolaridade 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Guarde-o em 4 °; C (filtro estéril através de um filtro de 0,2 um para impedir o crescimento bacteriano durante o tempo de armazenamento).
   4. Preparar solução enzimática fresca para o isolamento de protoplastos (0,1 g de celulase, 0,03 g macerozym em 10 ml F-PIN). Incubar a solução a 55 ° C durante 10 min e arrefecer à temperatura ambiente. Adicionar 100 ul de BSA a 10% para 10 ml de solução.
2. Isolamento de protoplastos
   1. Coloque uma folha infiltrado em uma placa de Petri e adicionar a solução de enzima fresco. Use uma nova lâmina de barbear para cortar a folha em aproximadamente 0,5 cm ² pedaços de tamanho. Transferir as peças em folha com a solução de enzima para um balão de vácuo de infiltração e infiltrar-se vácuo durante cerca de 20 segundos até que as bolhas de ar emergem a partir das folhas (libertação de vácuo muito cuidadosamente).
   2. Agitar o frasco durante 90 minutos a 40 rpm em escuridão.
   3. Soltar protoplastos por agitação durante 1 min a 90 rpm. Filtrar a solução através de uma gaze (100 uM) num tubo de centrifugação de 15 ml (fundo redondo).
   4. Sobrepor a solução de protoplastos com 2 ml de tampão F-NCP e centrifuga-se durante 10 min a 70 x g (aceleração lenta e desaceleração) a TA.
   5. Protoplastos intactos acumular na interface da solução de enzima e F-PCN. Tome uma grande orifício 1 ml ponta da pipeta para transferir os protoplastos intactos em um novo tubo de centrífuga e encher-se com tampão W5. Centrifugar durante 2 minutos a 100 x g (aceleração e desaceleração lentas) para sedimentar os protoplastos.
   6. Retirar o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta e ressuspender o pellet em cerca de 200 ul de tampão W5, dependendo da quantidade de protoplastos.
   7. Sempre use dicas de orifício de largura para evitar ruptura de protoplastos intactos.

4. Laser Scanning Microscopy

1. A preparação das amostras
   1. Cole duas pequenas tiras de vedação em torno de uma lâmina de microscópio (2 cm de distância). Colocar 20 mL de solução de protoplasto entre as tiras e colocar uma tampa de vidro cuidadosamenteno topo. As tiras de vedação se certificar de que os protoplastos não são esmagados pela tampa de vidro.
   2. Para as amostras totais de folhas cortadas de uma peça de 1 cm da folha e colocá-la sobre uma lâmina de microscópio com o lado de baixo da folha virada para cima. Adicionar cerca de 30 mL _de H ₂ O, coloque uma tampa de vidro em cima e fixe-o firmemente com fita adesiva em ambos os lados.
2. Configurações de imagem e microscópio confocal
   1. Imagem é realizada com um microscópio confocal a laser da Leica, Tipo: TCS SP5. Para ampliação usar uma lente objetiva (HCX PL APO CS) com uma magnitude de 63X com glicerol como meio de geração de imagens. Defina a abertura numérica para 1,3. Use o software Leica Application Suite / Avançado de fluorescência para avaliação (ver Suplementar Dados S1).
   2. Definir o laser de Árgon de 30% e a potência do laser de 488 nm a uma intensidade de 18% para controlar o sinal BiFC reconstituído em 515 nm, e definir uma largura de banda de emissão do detector PMT 495-550.
   3. Para monitorar a clorofila autofluorescência definir um segundo de largura de banda de emissão detector PMT 650-705.
   4. Para monitorizar o sinal mCherry utilizar o laser de HeNe 561, definir a intensidade do laser 561-18% e a largura de banda de emissão de um terceiro detector PMT 587-610.
   5. Certifique-se de que as imagens de todos os canais de detector PMT são tomadas com os mesmos ajustes de ganho (ganho deve ser entre 800-900 para excluir sinais de fundo).
   6. Tirar fotos em um formato de largura / altura de 1024 x 1024 pixels com uma velocidade de varredura de 100 Hz.
   7. Para Z-stackings utilização de uma distância máxima de 0,5 m entre cada pilha.

Resultados

Neste exemplo foi utilizado o método BiFC para monitorar a interação do HSP90 chaperone molecular citosólica com as proteínas de ancoragem de membrana AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 faz parte do translocon Sec e interage com acompanhantes citosólicos, que possivelmente entregar pré-proteínas secretoras para translocação pós-translacional para a membrana do RE. Da mesma forma, Toc64 no envelope exterior cloroplasto atua na importação de pós-translacionais, recebendo pré-proteínas HSP90 cloroplastos associados. Am...

Discussão

Ao planejar um experimento BiFC vários pontos devem ser considerados. Embora não haja informação estrutural sobre as proteínas de interesse é necessária, a topologia tem que ser conhecida quando se trabalha com as proteínas da membrana que mede. As proteínas fluorescentes têm de residir no mesmo compartimento subcelular ou enfrentar o mesmo lado de uma membrana para permitir a interacção. Naturalmente, quando a análise de proteínas que requerem uma sequência de direccionamento do terminal N, apenas uma et...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning