Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Резюме

Формирование белковых комплексов в естественных условиях могут быть визуализированы бимолекулярного флуоресценции дополнения. Взаимодействие партнеров сливают с дополнительными частями флуоресцентных меток и временно экспрессированного в листьях табака, в результате чего восстановленного флуоресцентного сигнала при непосредственной близости от двух белков.

Аннотация

Многие белки взаимодействуют временно с другими белками или интегрированы в мульти-белковых комплексов выполнять свою биологическую функцию. Бимолекулярного флуоресценции комплементация (BiFC) является методом в естественных условиях для мониторинга таких взаимодействий в клетках растений. В представленном протокола исследованные белки-кандидаты слиты с дополнительными половин флуоресцирующих белков и соответствующие конструкции вводятся в клетки растений через агробактериальной трансформации. Впоследствии белки временно экспрессируется в листьях табака и восстановленные флуоресцентные сигналы могут быть обнаружены с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в неповрежденных клетках. Это позволяет не только визуализацию самого взаимодействия, но и внутриклеточной локализации белковых комплексов может быть определена. Для этой цели маркерные гены, содержащие флуоресцентной метки можно коэкспрессируются вместе с конструкциями BiFC, таким образом визуализации клеточных структур, таких как Тон эндоплазматической сети, митохондрий, аппарата Гольджи или плазматическую мембрану. Флуоресцентный сигнал можно контролировать либо непосредственно в эпидермальных клетках листьев или в отдельных протопластов, которые могут быть легко выделенных из трансформированных листьев табака. BiFC идеально подходит для изучения белок-белковых взаимодействий в их естественной среде в живой клетке. Тем не менее, он должен считать, что выражение должно быть обусловлен сильных промоторов и что партнеры взаимодействия изменяются в результате синтеза относительно больших меток флуоресценции, которые могут помешать механизма взаимодействия. Тем не менее, BiFC является отличным дополнительный подход к другим обычно применяемых методов следственных белок-белковых взаимодействий, таких как коиммунопреципитации подтверждено, в пробирке выпадающие анализов или дрожжей двугибридная эксперименты.

Введение

Изучение образование белковых комплексов и их локализация в клетках растений в естественных условиях имеет важное значение для расследования сотовых сетей, сигнализации и метаболические процессы. BiFC позволяет визуализировать белок-белковых взаимодействий в их естественной среде непосредственно внутри живой клетки растения ^1-5.

В BiFC подойти к комплементации двух нефлуоресцирующих N-и С-концевых фрагментов флуоресцентного белка приводит к восстановленной флуоресцентного белка. Фрагменты многих различных флуоресцентных белков были использованы для обнаружения белковых взаимодействий, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) хромофор, который химически образована тремя различными остатками ^6. Флуоресцентные белки можно сократить вдвое в течение цикла или бета-цепи, чтобы привести в двух нефлуоресцирующих фрагментов, которые могут быть слиты с обоих белков, представляющих интерес. Анализ может быть использован для обнаружения взаимодействий в любом субклеточном compartmeнт в любом аэробно растущего организма или клетки, которые могут быть генетически модифицированной для экспрессии слитых белков. Если эти два белка вступают в непосредственной близости внутри клетки, флуоресценция восстанавливают и могут быть проверены с помощью микроскопии без добавления экзогенных флуорофоров или красители ^3.

Табак (Nicotiana benthamiana) оказалась удобной моделью организм визуализировать взаимодействие растительных белков, так как белки могут быть легко выражены с использованием агробактериальной преобразование табачные листья с сгенерированных конструкций. Agrobacteria использовать так называемый Ti плазмиду (опухоли) индуцировать кодирующих ферменты, которые опосредуют трансдукцию интересующего гена в клетках растений. BiFC хорошо применимы для растворимого, а также для мембранных белков внутри всех сотовых отсеков и успешно используется на протяжении последних лет для выявления взаимодействующих белков в естественных условиях, а также для анализа места взаимодействияв белках ^7-9. При экспрессии введенных генов, взаимодействие флуоресцирующих белков могут быть визуализированы непосредственно в листьях, который подходит для более крупных клеточных структур, таких как эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране или хлоропластов. Тем не менее, для контроля локализации в более совершенных конструкций, например, хлоропласт конверт, желательно, чтобы визуализировать флуоресценцию в протопласты, выделенных из трансформированных листьев табака. Набор BiFC векторов, содержащих либо С-концевой или N-концевой флуоресцентной метки должен быть использован для подхода BiFC в растениях ^10. Описанный протокол далее был использован для изучения взаимодействия цитозольным белка теплового шока 90 (HSP90) с tetratricopeptide повторения домена (TPR), содержащий Док белки Toc64 и AtTPR7 проживающих в хлоропластов внешней оболочки и эндоплазматической сети, соответственно ^11-13. Для этой цели HSP90 был слит с Cterminal часть SCFP (SCFP ^C). Тег был N-терминальной слит с компаньонкой, чтобы обеспечить доступность С-концевой MEEVD обязательного мотивом HSP90 чтобы пресечь типа TPR доменов. Параллельно с этим, N-концевая часть Венеры (Venus ^N) был присоединен к цитозольными доменов домена TPR, содержащей Док белки Toc64 и AtTPR7 соответственно. В качестве отрицательного контроля мы клонировали растворимого С-концевой частью SCFP ^С исключительно которая находится в цитозоле и, следовательно, соответствующий контроль.

Флуоресцентные метки изучаемых белков должны столкнуться с той же сотовой отсек, чтобы позволить непосредственной близости и тем самым воссоздание флуоресцентного сигнала. Чтобы определить локализацию восстановленного флуоресцентного сигнала маркер белок, слитый с другом флуоресцентной метки можно котрансформировали, чтобы продемонстрировать внутриклеточную локализацию взаимодействия. ER белковый маркер слит с mCherrry была преобразована одновременно вСлучай ЭР расположенного AtTPR7 ^14. Аутофлюоресценция хлорофилла служил хлоропластов маркера в случае Toc64. Под этим не только взаимодействие в естественных условиях Toc64 и AtTPR7, соответственно, с цитозольной HSP90 шаперона можно контролировать непосредственно в листьях табака, но и внутриклеточной локализации взаимодействия могут быть исследованы.

BiFC хорошо подходит в качестве дополнительного подхода к другим методам, обучающихся белок-белковых взаимодействий. По сравнению с коиммунопреципитации подтверждено или в пробирке эксперименты ниспадающих, например, нет специфических антител не должны быть доступны для представляющих интерес белков, а белки не должны быть рекомбинантно экспрессировали в пробирке, который может быть сложным, особенно для мембранных белков. Кроме того, также переходные взаимодействия можно контролировать с помощью BiFC, так как белки захвачен взаимодействия конденсированных флуоресцентных меток ^15.

протокол

1. Трансформация BiFC Создает в Agrobacteria

1. Клонирование BiFC конструкций
   1. Amplify интересующий ген из соответствующего шаблона с использованием олигонуклеотидов, содержащих фланкирующие attB-сайтов. Выполнение ПЦР с использованием полимеразы корректуры. Адаптация длину стадии отжига до проектируемой грунтовки комбинации и длину шага растяжения в зависимости от размера фрагмента. Проверьте ПЦР-продукта с помощью электрофореза в агарозном геле и очищают его с помощью ПЦР Очистка Kit.
   2. Выполните реакцию ВР с полученного фрагмента и вектор входа с помощью рекомбиназу BP. Смешайте 15-150 нг продукта ПЦР-attB с 150 нг вектора входа, добавить 2 мкл рекомбиназы ВР и заполнить с ТЕ-буфера до общего объема 8 мкл. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 2 мкл протеиназы К в течение 10 мин при 37 ° С
   3. Transform всю реакцию в компетентный E. палочка DH5α; Клетки и скрининг полученных колоний ПЦР колоний для правильной вставки фрагмента ДНК в вектор. Секвенирование ДНК положительных плазмид выполняется для проверки на отсутствие мутаций.
   4. Используйте полученную запись клон для LR рекомбинации с соответствующим вектором назначения с использованием LR рекомбиназу. Смешайте 50-150 нг вектора входа с 150 нг вектора назначения, добавить 1 мкл LR рекомбиназу и заполнить с ТЕ-буфера до общего объема 5 мкл. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 1 мкл протеиназы К в течение 10 мин при 37 ° С
   5. Преобразование всей реакции в компетентные клетки Е.coli DH5α клетках и экран, полученных колоний ПЦР колоний для правильной вставки фрагмента ДНК в вектор. Секвенирование ДНК нет необходимости на этом шаге.
   6. Изолировать плазмидной ДНК с помощью набора плазмида Mini, чтобы обеспечить высокую степень чистоты.
2. Получение химически компетентных Agrobacteria (штамм AGL1, рифампицин и сопротивление Карбенициллин)
   1. Серия из агробактерии от исходной культуры и растут в течение 24 часов при 28 ° С
   2. Инокулировать 5 мл LB среды с одной колонии и инкубировать в течение ночи при 28 ° С.
   3. Привить 50 мл LB среды с 2 мл ночной культуры и расти в течение приблизительно 4 ч при 28 ° С до OD ₆₀₀ 1,0.
   4. Центрифуга клетки при 3000 х г в течение 15 мин при 4 ° С и ресуспендируют осадок в 1 мл стерилизованной ледяной CaCl ₂ (10 мМ). Держите клетки на льду после этого шага.
   5. Подготовка аликвоты (100 мкл) ячеек, немедленно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 ° С.
3. Трансформация химически компетентным Agrobacteria
   1. Оттепель один аликвоты компетентных AGL1 клеток на льду. Добавить 1-2 мкг плазмидной ДНК в клетки. Выдержите в течение 5 мин на льду, 5 мин в жидком азоте и 5 мин при 37 ° С Добавить 600 мкл LB среды к клеткам и схек при 650 оборотах в минуту в течение 4 часов при 28 ° С.
   2. Центрифуга клетки течение 1 мин при 8000 х г и отбросить супернатант. Ресуспендируют гранул в 50 мкл оставшейся LB среды и пластины на LB-планшеты, содержащие соответствующие антибиотики. Уплотнение тарелки и инкубировать в течение 2 дней при 28 ° С Колонии экрана на присутствие плазмиды с помощью ПЦР колоний.
   3. Инокулировать один положительный колонию в 5 мл LB-среды, содержащей соответствующие антибиотики и инкубировать при 28 ° С в течение ночи. Смешайте 500 мкл ночной культуры с 500 мкл 50% стерилизованного глицерина и заморозить при температуре -80 ° С.
   4. Инокулировать агробактерии в LB среде, содержащей соответствующие антибиотики непосредственно из раствора в глицерине для временной трансформации табачных листьев.

2. Переходные Трансформация табачных листьев

1. Agrobacteria рост
   1. Подготовьте следующие растворы: ацетосирингона (150 мм, растворяются в 70% EtOH), магазин виде аликвот при -20 ° С. МЭС / КОН (0,1 М) рН 5,7, хранят при температуре 4 ° C (стерильных фильтров через 0,2 мкм фильтр, чтобы предотвратить рост бактерий в течение более длительного хранения), MgCl ₂ (1 М) акции, хранить при комнатной температуре.
   2. Инокулировать 10 мл LB среды, содержащей соответствующие антибиотики с 50 мкл AGL1 глицерина исходной культуры, содержащей плазмиду интереса в стерильной 50 мл пробирку и инкубируют при 28 ° С в течение по меньшей мере 24 ч встряхивании при 190 оборотах в минуту до тех пор, наружным диаметром ₆₀₀ между 1,0 -2.0 достигается.
   3. Центрифуга бактерии при 3000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют осадок в свежеприготовленный инфильтрации среды [MgCl ₂ (10 мМ), MES / KOH (10 мМ) рН 5,7, ацетосирингона (150 мкМ)] и регулировать подвеску к OD ₆₀₀ 1,0.
   4. Выдержите агробактерии клеток в накладных шейкере в течение 2 часов в темноте. Клетки затем могут быть использованы для инфильтрации.
2. Проникновение листьев табака
   1. Используйте тринеделя табачные (Nicotiana benthamiana) растения. Выберите несколько старых листьях для инфильтрации.
   2. Смешайте равные объемы агробактерии несущих конструкций, представляющих интерес (3 мл каждый). Возьмем 5 мл шприц без иглы для инфильтрации. Проникнуть клеточной суспензии осторожно в листьях табака, нажав на шприц на нижней стороне листьев в нескольких местах.
   3. Поливают растения и оставить их в темноте в течение двух дней.

3. Протопластов Подготовка

Протопластов подготовка листьев табака был адаптирован из Куп и др.. ¹⁶ и слегка изменен.

1. Подготовка буфера
   1. Подготовьте F-PCN среды: Макро-соли [KNO ₃ (1012 мкг / мл), CaCl ₂ • 2H ₂ O (440 мкг / мл), MgSO ₄ • 7H ₂ O (370 мкг / мл), KH ₂ PO ₄ ( 170 мкг / мл), NH _{4-сукцинат} [(20 мМ; подготовить 2 М исходного золяution (сукцинат (236 мкг / мл) и NH ₄ Cl (106 мкг / мл), чтобы отрегулировать рН 5,8 до растворения)], микро-соли [ЭДТА Fe (III) х Na-соль (40 мкг / мл), KJ (0,75 мкг / мл), H ₃ BO _{3 (3} мкг / мл), MnSO ₄ • H ₂ O (10 мкг / мл), ZnSO ₄ • 7H ₂ O (2 мкг / мл), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 мкг / мл), CuSO ₄ • 5H ₂ O (0,025 мкг / мл), CoCl ₂ • 6H ₂ O (0,025 мкг / мл)], MES (390 мкг / мл), глюкоза (около 80 мкг / мл) осмолярность 550 мОсм, рН 5,8 (КОН). Хранить в аликвоты при -20 ° С.
   2. Подготовка F-PIN-носитель: Все ингредиенты как F-PCN но вместо глюкозы использования сахарозы (примерно 110 мкг / мл), осмолярность 550 мОсм, рН 5,8 (KOH). Хранить в аликвоты при -20 ° С.
   3. Подготовка W5 среды: 150 мм NaCl, 125 мМ CaCl _2, 5 мМ KCl, 2 мм MES, осмолярность 550-580 мОсм, рН 5,7 (КОН). Хранить при 4 °; С (стерильный фильтр через фильтр 0,2 мкм для предотвращения роста бактерий в течение более длительного хранения).
   4. Подготовьте свежий раствор фермента для протопластов изоляции (0,1 г целлюлазы, 0,03 г macerozym в 10 мл F-контактный). Инкубируйте раствор при 55 ° С в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Добавьте 100 мкл 10% BSA в 10 мл раствора.
2. Выделение протопластов
   1. Поместите один лист проникли в чашку Петри и добавить свежий раствор фермента. Используйте новую бритву, чтобы сократить лист в примерно 0,5 см ² части размера. Трансфер жуков-части с ферментного раствора в вакуум-инфильтрации колбу и вакуум проникнуть примерно 20 сек, пока пузырьки воздуха не появляются из листьев (выпуск вакуумных очень тщательно).
   2. Встряхнуть флакон в течение 90 мин при 40 оборотах в минуту в темноте.
   3. Выпуск протопластов путем встряхивания в течение 1 мин при 90 оборотах в минуту. Раствор фильтруют через марлю (100 мкМ) в 15 мл центрифужную пробирку (с круглым дном).
   4. Наложение протопластов решение с 2 мл F-PCN буфера и центрифуги в течение 10 мин при 70 мкг (медленно ускорения и замедления) при комнатной температуре.
   5. Интактные протопласты накапливаться на поверхности раствора фермента и F-PCN. Возьмите широкий отверстие 1 мл пипетки для передачи нетронутыми протопластов в свежем трубки центрифуги и залейте W5 буфера. Центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг (медленно ускорения и замедления) для осаждения протопластов.
   6. Удалить супернатант осторожно с помощью пипетки и ресуспендируют осадок в приблизительно 200 мкл буфера W5, в зависимости от количества протопластов.
   7. Всегда используйте широкие советы диафрагм для предотвращения разрыву неповрежденных протопластов.

4. Лазерной сканирующей микроскопии

1. Подготовка образца
   1. Вставить две маленькие полоски герметика вокруг предметное стекло микроскопа (2 см друг от друга). Поместите 20 мкл протопластов решения между полосками и осторожно поместите покровного стеклана вершине. Герметика ленты убедитесь, что протопласты не раздавлены покровного стекла.
   2. Для всего пробы листьев вырезать кусок 1 см от листа и поместить его на предметное стекло микроскопа с нижней стороны листа вверх. Добавьте примерно 30 мкл H ₂ O, разместить покровного стекла на вершине и исправить ее плотно скотчем с обеих сторон.
2. Конфокальной микроскопии и микроскоп настройки
   1. Изображений осуществляется с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии от Leica, Тип: TCS SP5. Для увеличения использовать объектив (НСХ PL APO CS) с магнитудой 63x с глицерином, как изображения среды. Установите числовую апертуру до 1,3. Используйте программное обеспечение Leica Application Suite / Расширенный флуоресценции для оценки (см. дополнительные данные S1).
   2. Установите лазер аргона до 30% и мощность лазера 488 нм к интенсивности 18% для мониторинга водостойких сигнал BiFC при 515 нм и установить один PMT пропускная способность излучения детектор от 495-550.
   3. Для контроля хлорофилла аутофлюоресценция установить второй полосы пропускания излучения детектор ФЭУ от 650-705.
   4. Для мониторинга сигнала mCherry использовать гелий-неоновый лазер 561, установить интенсивность лазера 561 до 18% и полосу пропускания излучения третьего детектора ФЭУ от 587-610.
   5. Убедитесь, что фотографии всех каналов детектора ФЭУ взяты с теми же настройками чувствительности (усиления должен быть между 800-900 исключить фоновые сигналы).
   6. Сфотографируйте в формате ширины / высоты 1024 x 1024 пикселей со скоростью сканирования 100 Гц.
   7. Для Z-stackings использовать максимальное расстояние 0,5 мкм между каждого стека.

Результаты

В этом примере мы использовали метод BiFC контролировать взаимодействие цитозольный молекулярной шаперонной HSP90 с мембранных док белков AtTPR7 и Toc64. AtTPR7 является частью транслокона Sec и взаимодействует с цитозольными сопровождающих, которые, возможно, доставить секреторных препротеинов ?...

Обсуждение

По планируете эксперимент BiFC несколько точек должны быть рассмотрены. Хотя никакого структурного информация о представляющих интерес белков не требуется, топология должен быть известен при работе с мембраной белков. Флуоресцентные белки должны находиться в том же субклеточной отдел...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning