タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

要約

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。

要約

多くのタンパク質は他のタンパク質と一過性に相互作用するか、それらの生物学的機能を実行するために多タンパク質複合体に組み込まれる。二分子蛍光相補性（BIFC）は、植物細胞内でこのような相互作用を監視するin vivo法である。提示されたプロトコルで調べ候補タンパク質は、蛍光タンパク質の相補的な半分に融合され、各構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換を介して植物細胞に導入される。続いて、タンパク質を一過性にタバコの葉において発現され、復元された蛍光シグナルは、無傷の細胞における共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて検出することができる。これは、相互作用自体だけでなく可視化を可能にするだけでなく、タンパク質複合体の細胞内局在を決定することができる。この目的のために、蛍光タグを含むマーカー遺伝子は、従って、例えば、tのような細胞構造を視覚化する、BIFC構築物とともに同時発現され得る彼は胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置または原形質膜を小胞体。蛍光シグナルは直接葉表皮細胞において、または容易に形質転換されたタバコの葉から単離することができる単一のプロトプラスト、のいずれかでモニターすることができる。 BIFCは、理想的には、生細胞内でそれらの天然の環境の中でのタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために適している。しかしながら、発現が強力なプロモーターによって駆動されなければならず、相互作用パートナーを相互作用による機構を妨害する可能性があり、比較的大きな蛍光タグの融合物に変更されていることを考慮しなければならない。それにもかかわらず、BIFCは、例えば共免疫沈降、タンパク質-タンパク質相互作用、 インビトロでのプルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッド実験を調査する他の一般的に適用される方法への優れた相補的なアプローチである。

概要

タンパク質複合体の形成を研究およびインビボでの植物細胞におけるそれらの局在化は、セルラーネットワークを調査するために不可欠であり、シグナリングおよび代謝プロセス。 BIFCを直接生きた植物細胞^1-5内でのそれらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用の可視化を可能にする^。

BIFC中で再構成した蛍光タンパク質と蛍光タンパク質鉛の二非蛍光N-およびC-末端フラグメントの相補性に近づく。多くの異なる蛍光タンパク質の断片タンパク質相互作用を検出するために使用されており、 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、化学的に三つの異なる残基⁶によって形成された発色団。蛍光タンパク質は、目的の両方のタンパク質に融合させることができる2つの非蛍光フラグメントを生じ、ループ又はβ-ストランド内半減することができる。アッセイは、任意の細胞内compartmeにおける相互作用を検出するために使用することができるntの遺伝子的に融合タンパク質を発現するように修飾することができる任意の好気的に成長する生物または細胞において。 2つのタンパク質が、細胞内で近接するようになった場合は、蛍光が再構成され、外因性蛍光団又は染料³を添加せずに顕微鏡によりモニターすることができる。

タンパク質は容易にタバコのアグロバクテリウム媒介形質転換を利用して表現することができるので、タバコ（ ニコチアナ·ベンサミアナ ） が発生構築物、葉、植物タンパク質との相互作用を可視化するための便利なモデル生物であることが証明された。アグロバクテリウムは、植物細胞に目的の遺伝子の伝達を媒介する酵素をコードする、いわゆるTiプラスミド（腫瘍誘発）を使用します。 BIFCは、可溶性のためだけでなく、すべての細胞区画内膜タンパク質のための十分に適用可能であり、成功して、生体内でのタンパク質相互作用識別するだけでなく、相互作用部位を分析するために、過去数年にわたり使用されてきた^7-9タンパク質内。導入された遺伝子の発現の際に、蛍光タンパク質の相互作用は、例えば、小胞体（ER）などのより大きな細胞構造、原形質膜又は葉緑体に適している、葉を直接可視化することができる。しかし、より洗練された構造における局在化を監視するために、例えば、葉緑体エンベロープは、形質転換タバコの葉から単離されたプロトプラストの蛍光を可視化することが望ましい。 C-末端またはN-末端蛍光タグのいずれかを含むBIFCベクトルのセット¹⁰は、植物におけるBIFCアプローチのために使用されなければならない。後述のプロトコルは、テトラトリコペプチド反復タンパク質ドッキングToc64とAtTPR7は葉緑外側エンベロープそれぞれ小胞体^、11-13に存在する含有（TPR）ドメインと細胞質ゾルの熱ショックタンパク質90（HSP90）の相互作用を研究するために使用した。この目的のために、HSP90は、Ctを融合させたSCFPのerminal一部（SCFP ^C）。タグは、N末端TPRドメイン型クランプするHSP90のC末端MEEVD結合モチーフのアクセシビリティを確保するためにシャペロンに融合した。並行して、ビーナス（金星^N）のN末端 ​​部分は、それぞれ、ドッキングタンパク質Toc64とAtTPR7を含むTPRドメインの細胞質ゾルドメインに融合した。ネガティブコントロールとして、我々は細胞質ゾルに存在し、したがって、適切なコントロールであるだけにSCFP ^Cの可溶性C末端部分をクローニングした。

研究されたタンパク質の蛍光標識は、近接することにより、蛍光シグナルの再構成を可能にするために、同じ細胞区画に直面している。再構成された蛍光シグナルの局在を決定するために、異なる蛍光タグに融合されたマーカータンパク質の相互作用の細胞内局在を実証するために同時形質転換することができる。 mCherrryに融合ERマーカータンパク質は、同時に形質転換したAtTPR7 ¹⁴に位置し、ER例。クロロフィルの自家蛍光はToc64例で葉緑のマーカーを務めた。これにより細胞質ゾルのHSP90シャペロンとそれぞれToc64とAtTPR7のin vivoでの相互作用だけでなく、タバコの葉を直接監視することができるだけでなく、相互作用の細胞内局在を調べることができる。

BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究する他の方法に相補的なアプローチとして適している。免疫共沈降する又はインビトロプルダウン実験で比較し、例えば、特定の抗体は、目的のタンパク質に利用可能である必要はなく、タンパク質、特に膜タンパク質のために、挑戦することができる、組換えによってin vitroで発現される必要はない。蛋白質が融合した蛍光タグ¹⁵との相互作用によって捕捉されるので、また一時的な相互作用は、BIFCを用いてモニターすることができる。

プロトコル

1。 BIFCの形質転換は、アグロバクテリウム中の構築

1. BIFC構築物のクローニング
   1. 隣接のattB-部位を含むオリゴヌクレオチドを​​用いて、適切なテンプレートから目的の遺伝子を増幅する。プルーフリーディングポリメラーゼを用いてPCRを行う。フラグメントサイズに応じて設計したプライマーの組み合わせ、および伸長工程の長さにアニーリング工程の長さを適合させる。アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を確認し、PCRクリーンアップキットを使用して、それを精製する。
   2. 得られた断片とのBP反応とBPリコンビナーゼを使用して、エントリーベクターを実行します。エントリーベクターの150 ngののattB-PCR産物の15から150 ngのを混ぜて、BPリコンビナーゼの2μlを添加し、8μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、2μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止
   3. コンピテントに反応全体を変換する大腸菌 DH5α;細胞およびベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによって得られたコロニーを選別。陽性プラスミドのDNA配列決定は、変異の有無を確認するために行われる。
   4. LRリコンビナーゼを使用して適切なデスティネーションベクターでLR組換えについて得られたエントリークローンを使用してください。デスティネーションベクターの150 ngのエントリーベクターの50〜150 ngのを混ぜて、1μlのLRリコンビナーゼを追加し、5μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、1μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止
   5. ベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによりコロニーを得たコンピテント大腸菌DH5α細胞とスクリーンへの反応全体を変換します。 DNA配列決定は、この段階では必要ではない。
   6. 高純度を確保するために、プラスミドミニキットを用いてプラスミドDNAを単離する。
2. 化学的にコンピテントアグロバクテリウムの調製（AGL1株、リファンピシンおよびカルベニシリン耐性）
   1. ストリークうち保存培養からのアグロバクテリウムとは、28℃で24時間、成長する
   2. 単一コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種し、28℃で一晩インキュベート
   3. 一晩培養物2mlを、50 mlのLB培地に接種し、OD ₆₀₀が1.0 _になるまで28℃で約4時間成長する。
   4. 4℃で15分間、3,000×gで細胞を遠心分離し、氷冷のCaCl _2（10mM）を1mlの滅菌ペレットを再懸濁する。このステップの後、氷上で細胞を維持する。
   5. -80℃で液体窒素とストアにすぐに凍結し、細胞のアリコート（100μL）を準備
3. 化学的にコンピテントアグロバクテリウムの変容
   1. 氷上で有能AGL1細胞の1アリコートを解凍。細胞へのプラスミドDNAの1〜2μgのを追加します。 37℃で、氷上で5分間インキュベートし、液体窒素で5分間で5分間細胞とSに600μlのLB培地を追加28℃で4時間650rpmでメルルーサ
   2. 8,000×gで1分間細胞を遠心分離し、上澄みを捨てる。適切な抗生物質を含むLBプレート上の残りのLB培地とプレートの50μlにペレットを再懸濁します。プレートをシールし、28℃で2日間インキュベートコロニーPCRによるプラスミドの存在のための画面コロニー。
   3. 適切な抗生物質を含む5 mlのLB培地で1陽性コロニーを接種し、一晩28℃でインキュベートする。 500μlの50％滅菌グリセロールで一晩培養液500μlを混合し、-80℃で凍結
   4. タバコの葉の一過性の形質転換のためにグリセロールストックから直接、適切な抗生物質を含むLB培地でアグロバクテリウムを接種する。

2。タバコ葉の一過性の形質転換

1. アグロバクテリアの成長
   1. 以下のストック溶液を調製：アセトシリンゴン（150ミリメートル、70で溶解％エタノール）、-20℃でアリコートとしてストアMES / KOH（0.1M）pHは5.7、4℃（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmのフィルターを通して滅菌フィルター）で保存し、 _塩化マグネシウム（1 M）株、室温で保存する。
   2. 無菌50mlチューブへの関心のプラスミドを含有するAGL1グリセロールストック培養液50μlとの適切な抗生物質を含む10mlのLB培地に接種し、1.0の間のOD ₆₀₀まで、190 rpmで振とうし、少なくとも24時間、28℃でインキュベート-2.0に達した。
   3. 15分間3000×gで遠心分離菌。作りたての浸潤培地中のペレット[ _塩化マグネシウム（10ミリモル）、MES / KOH（10 mM）のpHは5.7、アセトシリンゴン（150μM）]を再懸濁し、OD 1.0の₆₀₀にサスペンションを調整します。
   4. 暗闇の中で2時間のオーバーヘッドシェーカーでアグロバクテリウム細胞をインキュベートする。次いで、細胞を浸潤のために使用することができる。
2. タバコの葉の浸潤
   1. 3を使用してください週齢のタバコ（ ベンサミアナタバコ ）の植物。浸透のためのいくつかの古い葉を選択してください。
   2. 興味の構築物を運ぶアグロバクテリウム等容量（3ミリリットルずつ）混ぜる。浸透のための針なしに5ミリリットルの注射器を取る。いくつかの場所で、葉の下側に注射器を押すことによって、タバコの葉に慎重に細胞懸濁液に潜入。
   3. 植物を水と2日間、暗闇の中でそれらを残す。

3。プロトプラストの準備

タバコの葉のプロトプラスト調製は、クープら ¹⁶から適応し、わずかに変更した。

1. バッファの準備
   1. F-PCN媒体を準備します。マクロの塩は_{、[3（1012μg/} mlの）をKNO、塩化カルシウム_{2•2H 2} O（440μg/ ml）を、硫酸マグネシウム_{4•7H 2} O（370μg/ ml）を、KH ₂ PO _4（ 170μg/ ml）を、NH _4-コハク酸[（20ミリモル、2Mの株式ゾルを調製ution]（コハク酸（236μg/ ml）を、およびNH ₄ Cl水溶液（106μg/ mlの）を、溶解させてpHを5.8に調整）、マイクロ塩は、[EDTA-鉄（III）、Na塩（40μg/ mlの）× KJ（0.75μg/ ml）を、H ₃ BO _3（3μg/ ml）を、のMnSO _{4•H 2} O（10μg/ ml）を、硫酸亜鉛_{4•7H 2} O（2μg/ ml）を、 _硫酸ナトリウムのMoO _4• 7H ₂ O（0.25μg/ ml）を、 _硫酸銅•5H ₂ O（0.025μg/ ml）を、のCoCl _{2•6H 2} O（0.025μg/ ml）を]、MES（390μg/ ml）を、グルコース（約80μgの/ ml）の浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）。 -20℃での分量を保存する
   2. F-PINの媒体を準備し、F-PCNとしてではなく、グルコース利用のスクロース（約110μg/ ml）を、浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）の全成分。 -20℃での分量を保存する
   3. 150のNaCl、125のCaCl _2、5mMのKCl、2mMのMES、浸透圧は550から580 mOsmで、pHは5.7（KOH）：W5メディアを準備します。 4℃で保存、C（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmフィルターで無菌フィルター）。
   4. プロトプラストを単離するための新鮮な酵素溶液（0.1グラムセルラーゼ、10ミリリットルのFピン0.03グラムのmacerozym）を準備します。 10分間、55℃で溶液をインキュベートし、室温まで冷却。 10ミリリットルの溶液に、10％のBSAを100μlを加える。
2. プロトプラストの分離
   1. ペトリ皿に1浸透させ、葉を置き、新​​鮮な酵素溶液を加える。約0.5cm ²サイズの断片に葉をカットする新しいカミソリの刃を使用しています。真空浸透フラスコに酵素液と葉の部分を転送し、気泡が（非常に慎重に解放真空）の葉から出てくるまで、真空を約20秒間浸透させる。
   2. 暗闇の中で40 rpmで90分間、フラスコを振る。
   3. 90 rpmで1分間振とうすることによりプロトプラストを放します。 15ミリリットル遠心チューブ（丸底）にガーゼ（100μM）に溶液をろ過する。
   4. 2ミリリットル、室温で70 XG（緩加速と減速）で10分間のF-PCNバッファと遠心でプロトプラスト溶液を重ねる。
   5. プロトプラストを無傷の酵素溶液及びF-PCNの界面に蓄積する。新鮮な遠心管にそのままプロトプラストを転送し、W5緩衝液で一杯に広い開口部1ミリリットルピペットチップを取る。プロトプラストをペレットに100 XG（緩加速と減速）で2分間遠心分離する。
   6. プロトプラストの量に応じて、約200μlのW5バッファにピペット再懸濁ペレットを使用して、慎重に上清を除去します。
   7. 常に完全なプロトプラストの破裂を防ぐために、広い開口部のヒントを参考にしてください。

4。レーザー走査顕微鏡

1. 試料調製
   1. 顕微鏡用スライド（2センチメートル離れて）を中心に、シール材の二つの小さな細片を貼り付けます。ストリップ間のプロトプラスト溶液20μlを置き、慎重にカバーガラスを配置上に。シーラントストリップは、プロトプラストをカバーガラスで押しつぶされていないことを確認してください。
   2. 総葉のサンプルについては葉から1cmの部分をカットし、上向きに葉の下側を顕微鏡スライド上に置きます。約30μlのH ₂ Oを追加する上にカバーガラスを配置し、両面に粘着テープでしっかりと固定します。
2. 共焦点イメージング顕微鏡の設定
   1. TCS SP5：イメージングは​​ライカ、型から共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる。倍率ためのイメージング媒体としてグリセリンと63Xの大きさは、対物レンズ（HCX PL APO CS）を使用しています。開口数を1.3に設定します。ライカ·アプリケーション·スイート/評価のための高度な蛍光ソフトウェアを（補足データS1を参照）を使用します。
   2. 515 nmでの再構成BIFC信号を監視し、495から550まで1 PMT検出器の放射帯域幅を設定するために18％の強度に30％のアルゴンレーザーおよび488nmのレーザパワーを設定する。
   3. クロロフィルの自家蛍光をモニターするには、650から705秒PMT検出放射帯域幅を設定。
   4. mCherry信号はヘリウムネオンレーザー561を使用し監視するために、レーザの強度百分の561から18と587から610まで三PMT検出器の放射帯域幅を設定。
   5. すべてのPMT検出器チャネルの画像は、同じゲイン設定（ゲインがバックグラウンド信号を除外するために800〜900の間でなければなりません）で撮影されていることを確認してください。
   6. 100Hzのスキャン速度で1024×1024ピクセルの形式幅/高さで撮影する。
   7. Z-スタッキングのために各スタック間0.5μmの最大距離を使用しています。

結果

この例では、膜結合タンパク質AtTPR7とToc64とサイトゾルの分子シャペロンHSP90との相互作用をモニターするためにBIFC法を用いた。 AtTPR7はSecトランスの一部であり、おそらくER膜への翻訳後転座のために分泌プレタンパクを提供し、サイトゾルシャペロンと相互作用する。同様に、葉緑体の外封筒にToc64は、HSP90に関連する葉緑体プレタンパクを受信することにより、翻訳後の輸入に作用する。?...

ディスカッション

BIFC実験を計画する際に、いくつかの点を考慮する必要があります。目的のタンパク質についての構造情報は必要ありませんが、トポロジー、膜貫通タンパク質で作業するとき知る必要がある。蛍光タンパク質は、同じ細胞内区画内に存在する又は相互作用を可能にするために、膜の同じ側に直面している。 N末端標的化配列を必要とするタンパク質を分析する場合、当然、唯一のC-末端タグ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning