חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Summary

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

Abstract

חלבונים רבים האינטראקציה transiently עם חלבונים אחרים או משולבים מתחמי חלבון רב כדי לבצע את תפקידם הביולוגי. שלמת bimolecular פלואורסצנטי (BiFC) היא שיטת in vivo כדי לפקח כגון אינטראקציות בתאי צמח. בפרוטוקול המובא חלבוני המועמד חקרו הם התמזגו לחצאים משלימים של חלבוני ניאון ומבני בהתאמה מוכנסי תאי צמח באמצעות שינוי בתיווך Agrobacterium. בהמשך לכך, החלבונים באים לידי ביטוי בtransiently עלי טבק וניתן לאתר אותות ניאון המשוחזר עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal בתאים שלמים. זה מאפשר הדמיה לא רק של האינטראקציה עצמה, אלא גם לוקליזציה subcellular של קומפלקסי החלבונים ניתן לקבוע. לצורך כך, ניתן coexpressed גנים סמן המכילים תג ניאון יחד עם מבני BiFC, וכך לדמיין מבנים הסלולר כגון tהוא endoplasmic reticulum, מיטוכונדריה, מנגנון Golgi או קרום הפלזמה. אות הניאון ניתן לנטר באופן ישיר בתאי עלה אפידרמיס או בprotoplasts הבודד, אשר יכול להיות מבודד בקלות מהעלים הטבק השתנו. BiFC הוא אידיאלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם בתוך התא החי. עם זאת, יש לו כדי להיחשב כי הביטוי צריך להיות מונע על ידי יזמים חזקים וששותפי האינטראקציה משתנים עקב שילוב של תגי הקרינה גדולים יחסית, מה שעלול להפריע למנגנון האינטראקציה. עם זאת, BiFC הוא גישה משלים מצוינת לשיטות נפוצות מיושמות אחרות חוקרים אינטראקציות בין חלבונים, כגון coimmunoprecipitation, במבחני חוץ גופית נפתחים או ניסויי שמרים ושניים-היברידיים.

Introduction

לומד את היווצרות של קומפלקסי חלבונים והלוקליזציה שלהם בתאי צמח in vivo היא חיונית כדי לחקור רשתות סלולריות, איתות ותהליכי חילוף חומרים. BiFC מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם ישירות בתוך תא הצמח החי ^1-5.

בBiFC להתקרב לשלמה של שני שברי N-ו-C-מסוף nonfluorescent של עופרת חלבון פלואורסצנטי לחלבון פלואורסצנטי מחדש. שברי חלבוני ניאון רבים ושונים שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבון, למשל החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) כרומופור של אשר נוצר כימי על ידי שלוש שאריות שונות ^6. ניתן לחצות חלבוני ניאון בתוך לולאה או SS-גדיל להביא שני שברי nonfluorescent אשר ניתן התמזגו שני החלבונים של עניין. Assay יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות בכל compartme subcellularnt בכל אורגניזם גדל אירובי או תאים שיכולים להיות מהונדס גנטי כדי לבטא חלבוני ההיתוך. אם שני החלבונים באים בסמיכות בתוך התא, הקרינה היא מחדש והוא יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ ללא התוספת של fluorophores או צבעים ³ אקסוגניים.

טבק (benthamiana Nicotiana) הוכיח להיות אורגניזם מודל נוח לדמיין את האינטראקציה של חלבונים צמחיים, שכן בקלות ניתן לבטא חלבונים על ידי ניצול שינוי בתיווך Agrobacterium של טבק עם המבנים שנוצרו. Agrobacteria להשתמש פלסמיד שנקרא Ti (גידול גרימת) קידוד עבור אנזימים שלתווך התמרה של הגן של עניין לתאי צמח. BiFC הוא גם ישים עבור מסיס, כמו גם לחלבוני קרום בתוך כל התאים הסלולריים ושמש בהצלחה בשנים האחרונות לזהות אינטראקציה חלבוני in vivo, כמו גם לנתח אתרי אינטראקציהבתוך החלבונים ^7-9. על הביטוי של הגנים הציגו, את האינטראקציה של חלבוני הניאון ניתן דמיינו ישירות בעלים, אשר מתאימה למבנים הסלולר גדולים יותר, כמו reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה או כלורופלסטים. עם זאת, כדי לפקח על הלוקליזציה במבנים מעודנים יותר, למשל, את מעטפת הכלורופלסט, רצוי לדמיין את הקרינה בprotoplasts מבודדת מעלי טבק השתנו. קבוצה של וקטורי BiFC המכילים גם C-מסוף או תג ניאון N-מסוף צריך לשמש לגישת BiFC בצמחי ^10. הפרוטוקול המתואר להלן שימש כדי לחקור את האינטראקציה חלבון cytosolic הלם חום 90 (Hsp90) של עם חוזר tetratricopeptide תחום (TPR) המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7 מתגוררים במעטפת החיצונית הכלורופלסט וreticulum endoplasmic, בהתאמה ^11-13. לצורך כך, Hsp90 היה התמזגו לCtחלק erminal של SCFP (SCFP ^C). התג היה N-סופני התמזגו למלווה כדי להבטיח נגישות של המוטיב בטרמינל C-MEEVD המחייב של Hsp90 כדי לצבוט מסוג תחומים TPR. במקביל, חלק N-המסוף של ונוס (Venus ^N) היה התמזגו לתחומי cytosolic של תחום TPR המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7, בהתאמה. כביקורת שלילית שאנו משובטים חלק מסיס בטרמינל ^C-C של SCFP אך ורק בו מתגורר בcytosol ולכן שליטה מתאימה.

תגי הניאון של החלבונים למדו צריכים להתמודד באותו תא סלולארי כדי לאפשר לסמיכות ובכך הכינון מחדש של אות הניאון. כדי לקבוע את הלוקליזציה של אות הניאון מחדש חלבון סמן התמזגו לתג ניאון שונה ניתן cotransformed כדי להדגים את לוקליזציה subcellular של האינטראקציה. חלבון סמן ER התמזגו mCherrry הפך בו זמנית במקרה של ER ממוקם ¹⁴ AtTPR7. Autofluorescence של כלורופיל שימש כסמן הכלורופלסט במקרה של Toc64. לפי זה לא רק האינטראקציה in vivo של Toc64 וAtTPR7, בהתאמה, עם מלווה Hsp90 cytosolic ניתן לנטר ישירות בי הטבק אלא גם לוקליזציה subcellular של האינטראקציה יכולה להיחקר.

BiFC מתאים גם כגישה משלים לשיטות אחרות לומדות אינטראקציות בין חלבונים. בהשוואה לcoimmunoprecipitation או בניסויים נפתחים מבחנה, למשל, אין נוגדנים ספציפיים צריכים להיות זמין לחלבונים של עניין, והחלבונים לא צריכים לבוא לידי ביטוי recombinantly במבחנה, מה שיכול להיות מאתגר, במיוחד לחלבונים בממברנה. יתר על כן, גם ניתן לנטר אינטראקציות חולפות באמצעות BiFC, שכן החלבונים שנתפסו על ידי האינטראקציה של תגי הניאון התמזגו ^15.

Protocol

1. טרנספורמציה של BiFC הבונה בAgrobacteria

1. שיבוט של מבני BiFC
   1. להגביר את הגן של עניין מתבנית מתאימה באמצעות oligonucleotides מכילה attB אתרי איגוף. לבצע PCR באמצעות פולימראז הגהה. להתאים את אורך צעד חישול לשילוב פריימר תוכנן ואת אורכו של שלב התארכות בהתאם לגודל השבר. בדוק את המוצר ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ולטהר אותו על ידי שימוש בערכת ה-PCR לנקות.
   2. בצע את תגובת BP עם שבר שהושג ואת וקטור הכניסה באמצעות recombinase BP. מערבבים 15-150 ng של מוצר attB-PCR עם 150 ng של וקטור הכניסה, להוסיף 2 μl של recombinase BP ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 8 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 2 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C.
   3. להפוך כל התגובה לE. המוסמך coli DH5α; תאים ומסך המושבות מתקבלות על ידי המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצף ה-DNA של פלסמידים חיוביים מתבצע כדי לוודא היעדר המוטציות.
   4. השתמש בשיבוט הכניסה מתקבל עבור רקומבינציה LR עם וקטור היעד המתאים באמצעות recombinase LR. מערבבים 50-150 ננוגרם של וקטור הכניסה עם 150 ng של וקטור היעד, להוסיף recombinase LR μl 1 ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 5 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 1 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C.
   5. להפוך כל התגובה לתאים המוסמכים E. coli DH5α ומסך המתקבלים על ידי מושבות המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצפי DNA אין צורך בשלב זה.
   6. לבודד את ה-DNA פלסמיד עם ערכת פלסמיד Mini כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר.
2. הכנת Agrobacteria כימית המוסמך (AGL1 המתח, ריפאמפיצין והתנגדות Carbenicillin)
   1. agrobacteria פס מ תרבות המניה ולגדול ל24 שעות ב28 ° C.
   2. לחסן 5 מיליליטר מדיום LB עם מושבה אחת ודגירת הלילה בשעה 28 ° C.
   3. לחסן 50 מיליליטר מדיום LB עם 2 מיליליטר של תרבות הלילה ולגדול לכ 4 שעות ב28 ° C ל OD ₆₀₀ של 1.0.
   4. צנטריפוגה התאים ב XG 3,000 15 דקות ב 4 ° C ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר עיקור קר כקרח CaCl ₂ (10 מ"מ). שמור את התאים על קרח לאחר שלב זה.
   5. הכן aliquots (100 μl) של התאים, להקפיא באופן מיידי בחנקן הנוזלי ולאחסן ב -80 ° C.
3. טרנספורמציה של Agrobacteria כימי המוסמך
   1. הפשירו aliquot אחד מתאי AGL1 המוסמכים על קרח. להוסיף 1-2 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד לתאים. דגירה במשך 5 דקות על קרח, 5 דקות בחנקן נוזלי ו5 דקות ב37 ° C. הוספת 600 מדיום LB μl לתאים והיםהייק ב650 סל"ד במשך 4 שעות ב28 ° C.
   2. צנטריפוגה התאים 1 דקות ב8,000 XG וזורקים supernatant. Resuspend את הכדור ב50 μl של המדיום שנותר LB וצלחת על צלחות LB המכילות האנטיביוטיקה המתאימה. לאטום את הצלחות ודגירה עבור 2 ימים ב28 ° C. מושבות מסך לנוכחות של פלסמיד על ידי המושבה PCR.
   3. לחסן מושבה אחת חיובית ב5 מיליליטר מדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 28 ° C במשך הלילה. מערבבים 500 μl של תרבות הלילה עם 500 μl 50% גליצרול מעוקר ולהקפיא ב -80 ° C.
   4. לחסן agrobacteria במדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ישירות ממניית גליצרול לשינוי זמני של עליי טבק.

2. טרנספורמציה חולפת של עליי טבק

1. Agrobacteria צמיחה
   1. הכן פתרונות המניות הבאים: acetosyringone (150 מ"מ, מתמוסס ב70% EtOH), חנות aliquots ב -20 ° C. pH MES / KOH (0.1 M) 5.7, לאחסן ב 4 ° C (סינון סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר), מניית MgCl ₂ (ז 1), חנות ב RT.
   2. לחסן 10 מיליליטר מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימה עם 50 μl של תרבות מניית גליצרול AGL1 המכילה את הפלסמיד של עניין בצינור מיליליטר סטרילי 50 ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות רועד ב190 סל"ד עד OD ₆₀₀ בין 1.0 הוא הגיע -2.0.
   3. חיידקי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend את הכדור במדיום הסתננות טרי [MgCl ₂ (10 מ"מ), pH MES / KOH (10 מ"מ) 5.7, acetosyringone (150 מיקרומטר)] ולהתאים את ההשעיה לOD ₆₀₀ של 1.0.
   4. דגירה תאי agrobacteria בייקר תקורה לשעה 2 בחושך. התאים לאחר מכן ניתן להשתמש לחדירה.
2. הסתננות של עליי טבק
   1. להשתמש בשלושטבק ישן שבוע צמחים (benthamiana Nicotiana). בחר כמה עלים מבוגרים להסתננות.
   2. לערבב כמויות שווה של agrobacteria נושא את המבנים של עניין (3 מיליליטר כל אחד). קח מזרק 5 מיליליטר ללא מחט להסתננות. לחדור את ההשעיה התא בזהירות לתוך עלי הטבק על ידי לחיצה על המזרק בצד התחתון של העלים בכמה מקומות.
   3. להשקות את הצמחים ולהשאיר אותם בחושך במשך יומיים.

3. Protoplast הכנה

הכנת Protoplast של עליי טבק הותאמה מKoop et al. ¹⁶ ושונים מעט.

1. הכנת חיץ
   1. להכין מדיום F-PCN: מאקרו-מלחים [kno ₃ (1012 מיקרוגרם / מיליליטר), CaCl ₂ • 2H ₂ O (440 מיקרוגרם / מיליליטר), ₄ MgSO • 7H ₂ O (370 מיקרוגרם / מיליליטר), KH ₂ PO ₄ ( 170 מיקרוגרם / מיליליטר), _[4 succinate-NH (20 מ"מ; להכין סול מניית 2 Mution (succinate (236 מיקרוגרם / מיליליטר) _ו4 Cl NH (106 מיקרוגרם / מיליליטר), להתאים את ה-pH 5.8 לפזר)], מיקרו מלחים [EDTA-Fe (III) x Na-מלח (40 מיקרוגרם / מיליליטר), KJ (0.75 מיקרוגרם / מיליליטר), H ₃ BO ₃ (3 מיקרוגרם / מיליליטר), ₄ MnSO • H ₂ O (10 מיקרוגרם / מיליליטר), ₄ ZnSO • 7H ₂ O (2 מיקרוגרם / מיליליטר), Na ₂ Moo ₄ • 7H ₂ O (0.25 מיקרוגרם / מיליליטר), ₄ CuSO • 5H ₂ O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר), CoCl ₂ • 6 שעות ₂ O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר)], MES (390 מיקרוגרם / מיליליטר), גלוקוז (כ 80 מיקרוגרם / מיליליטר) mOsm osmolarity 550, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C.
   2. להכין מדיום F-PIN: כל המרכיבים כמו F-PCN אבל במקום סוכרוז גלוקוז שימוש (כ 110 מיקרוגרם / מיליליטר), osmolarity 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C.
   3. להכין מדיום W5: 150 mM NaCl, 125 מ"מ CaCl _2, 5 מ"מ KCl, MES 2 מ"מ, osmolarity 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). חנות ב 4 °; C (מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר).
   4. הכן את פתרון אנזים טרי לבידוד protoplast (0.1 cellulase גרם, 0.03 macerozym גרם ב10 מיליליטר F-PIN). דגירה הפתרון ב55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבות RT. הוספה של BSA 10% 100 μl ל10 מיליליטר פתרון.
2. בידוד של protoplasts
   1. מניחים עלה אחד הסתנן לתוך צלחת פטרי ולהוסיף את פתרון האנזים הטרי. השתמש בסכין גילוח חדש לחתוך את העלה לכ 0.5 סנטימטר ² חתיכות בגודל. מעביר את העלים החלקים עם פתרון האנזים לתוך בקבוק ואקום חדירה והאבק לחדור לכ 20 שניות עד בועות אוויר יוצאות מהעלים (ואקום שחרורו בזהירות רבה).
   2. לנער את הבקבוק ל90 דקות ב40 סל"ד בחושך.
   3. שחרר protoplasts ידי טלטול 1 דקות ב90 סל"ד. סנן את הפתרון באמצעות גזה (100 מיקרומטר) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר (תחתית עגולה).
   4. Overlay פתרון protoplast עם 2 מיליליטר חיץ F-PCN ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 70 XG (תאוצה איטית והאטה) ב RT.
   5. protoplasts ללא פגע לצבור על הממשק של פתרון האנזים וה-F-PCN. קח את קצה פיפטה מיליליטר רחב פתח 1 להעביר protoplasts השלמה לתוך צינור צנטריפוגות טרי ולהתמלא בחיץ W5. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב100 XG (האצה האטה איטית) לגלולת protoplasts.
   6. הסר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה וגלולה resuspend בכ 200 חיץ W5 μl, בהתאם לכמות של protoplasts.
   7. השתמשו תמיד בטיפי פתח רחבים כדי למנוע פקיעה של protoplasts ללא פגע.

4. לייזר סריקה מיקרוסקופית

1. הכנת מדגם
   1. להדביק שתי רצועות קטנות של חומר איטום סביב שקופיות מיקרוסקופ (למעט 2 סנטימטר). הנח 20 μl של פתרון protoplast בין הרצועות ומניח את מכסה זכוכית בזהירותעל העליונה. רצועות איטום לוודא כי protoplasts אינם נמעך על ידי כיסוי הזכוכית.
   2. לסך דגימות עלים לחתוך חתיכת 1 סנטימטר מהעלה ולמקם אותו על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם הצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. להוסיף כ 30 μl H ₂ O, למקם את כוס על גבי עטיפה ולתקן אותה בחוזקה עם דבק בשני הצדדים.
2. הגדרות הדמיה ומיקרוסקופ confocal
   1. הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר מיקה, סוג: TCS SP5. להגדלת שימוש בעדשה אובייקטיבית (HCX PL APO CS) עם סדר גודל של 63X עם גליצרול כמדיום הדמיה. הגדר את הצמצם המספרי ל1.3. השתמש בתוכנת Leica Application Suite / מתקדם הקרינה להערכה (ראה משלימה נתונים S1).
   2. הגדר את לייזר ארגון ל30% וכוח הלייזר ב488 ננומטר לעוצמת 18% לפקח על אות BiFC מחדש ב515 ננומטר ולהגדיר רוחב פס פליטה אחד PMT גלאי 495-550.
   3. כדי לפקח autofluorescence כלורופיל להגדיר רוחב פס פליטת גלאי PMT שני 650-705.
   4. כדי לפקח על אות mCherry להשתמש בליזר HeNe 561, להגדיר את עוצמת הלייזר 561-18% ורוחב פס הפליטה של ​​גלאי PMT שלישי 587-610.
   5. ודא כי תמונות של כל ערוצי גלאי PMT נלקחות עם אותן הגדרות הרווח (רווח צריך להיות בין 800-900 להוציא אותות רקע).
   6. צלם תמונות ברוחב / גובה תבנית של 1024 x 1024 פיקסלים עם מהירות סריקה של 100 הרץ.
   7. עבור Z-stackings להשתמש במרחק מרבי של 0.5 מיקרומטר בין כל ערימה.

תוצאות

בדוגמא זו השתמשנו בשיטת BiFC לעקוב אחר האינטראקציה של Hsp90 המלווה המולקולרי cytosolic עם חלבוני העגינה קרום AtTPR7 וToc64. AtTPR7 הוא חלק מtranslocon Sec ואינטראקציה עם מלווים cytosolic, שאולי לספק preproteins הפרשה לטרנסלוקציה לאחר translational על קרום ER. כמו כן, Toc64 במעטפת החיצונית הכלורופלסט פועל ביבוא...

Discussion

על תכנון ניסוי BiFC כמה נקודות צריכה להיחשב. למרות שאין מידע מבני על החלבונים של העניין נדרש, טופולוגיה צריכה להיות ידועה בעת עבודה עם חלבוני קרום פורש. חלבוני הניאון צריכים להתגורר באותו התא subcellular או פנים באותו הצד של קרום כדי לאפשר אינטראקציה. באופן טבעי, בעת ניתוח חל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning